Yöntem makalesi

Çözünür ve çözünmez Huntingtin türler çözümlenmesi için ayırma

9.1K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/57082

⸱

27 Şubat 2018

 ,  ,  , 
1Department of Psychiatry and Human Behavior, University of California Irvine, 2UCI MIND, University of California Irvine, 3Department of Neurobiology and Behavior, University of California Irvine, 4Board of Governors Regenerative Medicine Institute, Cedars-Sinai Medical Center

Bu makalede

Özet

Fare beyin ve hücre kültür çözünür ve çözünmez mutant huntingtin türlerinin ayırma için bir yöntemi açıklanmıştır. Açıklanan yöntemi karakterizasyonu ve miktar huntingtin protein akı ve protein homeostazı hastalık patogenezinde ve tedirginlikler huzurunda analiz AIDS için yararlıdır

Özet

Misfolded proteinleri birikimi patoloji Huntington hastalığı (HD) ve diğer birçok nörodejeneratif hastalıklar için merkezi bir noktada bulunuyor. Özellikle, bir ana patolojik HD yüksek molekül ağırlıklı kompleksleri içine mutant HTT (mHTT) protein birikimine anormal özelliğidir ve hücre içi dahil ceset parçaları ve diğer proteinler oluşur. Ölçmek ve mHTT içeren toplamları çeşitli formları katkılarıyla Floresans mikroskobu, western blot analizi ve filtre dahil anlamak için geleneksel yöntemler deneyleri tuzak.

Ancak, bu yöntemlerin çoğu belirli biçimi vardır ve bu nedenle mHTT protein akı toplama çözünürlük ve çözünürlük karmaşık yapısı nedeniyle tam durumunu çözmeyebilir.

Toplanan mHTT ve çeşitli değiştirilmiş form ve kompleksleri kimlik için ayırma ve solubilization hücresel toplamları ve parçaları zorunlu değildir. Burada biz yalıtmak ve görselleştirmek çözünür mHTT, monomerleri, reaksiyonlar, parçaları için bir yöntem tanımlamak ve çözünmez yüksek molekül ağırlıklı (HMW) mHTT türler birikmiş. HMW mHTT izler hastalık ilerlemesi ile fare davranışı çıktıları ile karşılık gelir ve beneficially belirli tedavi müdahaleler1tarafından modüle. Bu yaklaşım fare beyni, periferik doku ve hücre kültürü ile kullanılabilir ancak diğer sistemleri modellemek bağlamı olarak da bilinen hastalık için adapte edilebilir.

Giriş

Uygun katlama sağlamak protein kalite kontrol ağları bozulma ve yıkımı proteinlerin patoloji Alzheimer hastalığı (Ah), Parkinson hastalığı (PD), Huntington hastalığı (HD) için büyük olasılıkla orta ve protein diğer "misfolding" olduğunu 2,3bozuklukları. Proteostasis ağ bileşenleri ve onların katkıları patoloji için detaylı bir anlayış bu nedenle geliştirilmiş tedavi müdahaleler geliştirmek için çok önemli. HD bir CAG tekrar polyglutamines (polyQ) huntingtin (HTT) protein4genişletilmiş bir streç sonuçlanan HD gen içinde anormal genişlemesi nedeniyle oluşur. Bir tutarlı patolojik HD Patogenez elde edilen misfolding, birikimi ve çeşitli şekillerde normal hücre homeostazı ve işlev girişimine gösterilen HTT beyin bölgelerinde ve periferik dokularda agregasyon özelliğidir 5 , 6. iken HTT ubiquitously ifade, striatum orta dikenli nöronların Ayrıca HD patogenezi ile ilgili dikkate değer kortikal Atrofi ile seçmeli olarak savunmasız ve en açıktan etkilenen vardır.

HTT HD hasta ve hayvan modelleri beyinde agrega oluşumu genellikle hastalık ilerleme ve baskın negatif kazanç mHTT7için işlevinin bir proxy marker olarak hizmet vermiştir. Hangi protein tarafından misfolding ve toplama mHTT kaynaklı toksisite için katkıda bulunabilir kesin mekanizmaları belirsiz kalır rağmen beyindeki bu kapanımlar HD hasta ve çeşitli hayvan modelleri oluşumu bir sabit ve kaçınılmaz özelliğidir. N-terminal içeren büyük ölçüde birikmiş HTT parçaları oluşan için o proteolizis belirten polyQ, genişletilmiş ve tam uzunlukta HTT yanı sıra alternatif Uçbirleştirme8,işleme9 oynayabilir kapanımlar görünür bir HD. N-terminal HTT parçaları patogenezinde önemli rol hızla toplamak, nucleate ve hızlandırmak veya toplama işlemi10yaymak HTT patolojik bir tür teşkil edebilir.

Ancak, bu eklemeler varlığı mutlaka HTT kaynaklı toksisite ya da hücre ölüm11ile ilişkilendirmek değil. HTT çözünür bir monomer çözünür oligomeric türler ve β-yapraklık liflerinde bir toplama işleminden çözünmez toplamları ve kapanımlar12geçmesi teklif edildi. Bu protein türleri standart biyokimyasal deneyleri ile çözme onların istikrar içinde düşük-deterjan lizis tampon ve standart biyokimyasal testleri kullanarak görselleştirme zorluk nedeniyle alandaki bir mücadele vardı. Böylece, metodolojik konusu derecesi ve birikmiş ve toplanan mHTT desen saptamada kritik önem taşır.

Burada sunulan Protokolü HTT, özellikle HD Patogenez ve hastalık ilerleme1,13 ile yakından izlemek için görünür bir çözünmez HMW HTT türlerin oluşumu, birkaç ara ürün görselleştirmek için bir yöntem sağlar ,14. Gidermek ve mHTT birden çok tür takip edememek araştırmacılar hastalığın patogenezinde çalışma ve modülasyon ve hastalık patogenezinde üzerindeki etkisi ile potansiyel terapötik müdahaleler değerlendirmek biyokimyasal bir araçtır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Hayvan etik beyanı - deneyler yürütülen Kılavuzu ile sıkı uygun bakım ve kullanım laboratuvar hayvanları Ulusal Sağlık enstitüleri ve kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi () tarafından onaylanmış hayvan araştırma protokolü IACUC) University of California, Irvine, bir AAALAC akredite kurum. Tüm çabaları hayvan acı en aza indirmek için yapılmıştır.

1. lizis arabellekleri hazırlanması

  1. "Çözünür" lizis arabellek hazırlamak (10 mM Tris pH 7.4, % 1 Triton-X 100, 150 mM NaCl, % 10 gliserol) ve 0,22 µm filtresi ile steril filtre.
    1. Çalışma "Çözünür" lizis için bir tampon, N-Ethylmaleimide (NEM) ölçmek ve iyice 100 mM phenylmethysulfonyl flor (PMSF) % 100 çözünmüş olarak dağıtılması alkol.
      Not: Lizis arabellek inhibitörleri: (i) 20 mM N-ethylmaleimide (NEM); (ii) 0.2 mM PMSF; (iii) 1 mM sodyum orthovanadate (Na3VO4); (iv) 1 µg/mL leupeptin; (v) 1 µg/mL aprotinin; (vi) 20 mM sodyum florür (kaf).
      Dikkat: bir yüz maskesi NEM boyunca protokolünün çalışırken giyiyorum. Lizis arabellek çalışma aktif inhibitörleri sağlamak için taze yapılmalıdır.
    2. Proteaz inhibitörleri ile çözünür lizis tampon için inhibitörleri aşağıdaki sırayla ekleyin: sodyum florür (kaf), soğuk lizis arabellek, sodyum orthovanadate (Na3VO4), Aprotinin ve Leupeptin bir birim kadar.
  2. "Çözünmez" lizis arabellek için % 4 SDS "Soluble" lizis arabellek için 2 mL % 20 SDS 500 µL ekleyerek ek. Oda sıcaklığında bırakın.
    Not: 4 ° C'de tutulur dışarı SDS çökelti; Bu oda sıcaklığında tutmak. Son lizis arabellek oluşturma: 10 mM Tris (pH 7,4); % 1 Triton X-100; 150 mM NaCl; % 10 gliserol; %4 SDS (sadece çözünmez).

2. çözünür/çözünmez ayırma iletişim kuralı

Not: Bkz. şekil 1 bir şematik için.

  1. Tüpler her örnek için iki farklı etiket: "Soluble" ve "Çözünmez."
  2. X-µL buz gibi çalışma çözünür lizis arabelleği proteaz inhibitörleri (bkz: 1.1.1) doku ile takıma ekleyin.
    Not: X = birim değişir doku miktarı bağlı olarak; Bkz. Tablo 1.
  3. (Yani, striatum) fare beyin doku için dounce cam 1 mL douncer ve damlalıklı "Çözünmez" içine yavaş yavaş 30 kere tüp (buz üzerinde tutun) etiketli.
    Not: bubbles formu olacak ve eksik homojenizasyon verim gibi douncing, başlattıktan sonra sıvı yüzeyinin kırmamaya dikkat et.
  4. (Yani, HeLa, HEK293T) hücreler için hücreleri bir kez soğuk, 1 x PBS ile yıkayın. PBS kaldırmak ve asgari miktar lizis arabelleği hücrelere uygulayın ve hücre sıyırıcı kaldırın.
    Not: İçin yukarıdaki hücre satır, hücre 6 iyi plaka başına 5 x 105 hücre, kaplama ve confluency yakın büyüdü. Bir tane de fare striatum için kullanılan birimleri karşılaştırılabilir.
  5. Homogenate veya hücre içine lysate etiketli, "Çözünmez" tüpler aktarmak ve buz 1 h (son tüp işlendikten sonra başlangıç saat) koşullar.
    Not: cep lysates için kuluçka başlamadan önce hücre kümeleri bölmek için birkaç kez triturate. Kabarcıklar oluşumunu önlemek. Kısaca girdap darbe her örnek için 1 s lysing aracılığıyla yarı yolda.
  6. 15.000 x g 20 dk için de 4 ° C'de örnekler santrifüj kapasitesi.
  7. Süpernatant "Soluble" kesir olarak kurtarmak.
    1. Damlalıklı ile kaldırmak için bu kesir kontamine gibi Pelet/bulutlu katman bozmamaya dikkat. Damlalıklı çözünür kesir "Soluble" içine tüp etiketli. Buz üstünde tutun.
  8. Her yıkadıktan sonra Pelet 500 µL lizis arabellek (x2) ve santrifüj ile 15.000 x g 5 min için de 4 ° C'de yıkama; Bulutlu katman bazıları kapalı pipetted sorun değil.
  9. Son yıkama sonra kalan tüm yıkama arabellek yalnızca doku Pelet bırakarak kaldırın.
    Not: Bu noktadan sonra çözünmez örnekleri şimdi oda sıcaklığında tutulmalıdır.
  10. Resuspend Pelet X-µL lizis arabellek % 4 SDS ile takviye ile (birim Pelet boyutuna bağlı olarak ayarlanabilir; bkz. Tablo 1).
  11. Her örnek için 30 solüsyon içeren temizleyicide s bir sonda sonicator ile oda sıcaklığında (125 Watt, 20 kHz, nabız, genlik % 40, bkz: Malzemeler tablo).
  12. (Haddeleme kaynatın) örnekleri için 30 dk kaynatın; Kısaca santrifüj kapasitesi (15 s) 6.000 x g herhangi bir örnek kaybetmemek için de.
  13. DC (deterjan uyumlu) protein tahlil gerçekleştirmek ( Tablo malzemelerigörmek) veya Lowry protein tahlil protein konsantrasyonu (1/5 ilgili lizis arabelleği hücre kültürü için örnek ve 1/10 için doku lysates başlamış dilutions önerilen) ölçmek için.
    Not: Protein konsantrasyonları yüksek deterjan konsantrasyon nedeniyle DC veya Lowry tahlil kullanarak okunması gerekir.
  14. Donma-çözülme sorunları önlemek için 50 µL toplu işleme aliquot örnekleri.
    Not: İletişim kuralı burada daha fazla biyokimyasal analiz önce her iki kesirler-20 ° C'de depolayarak duraklatılmış

3. Western Blot ve miktar

  1. Batı açıkları olarak bildirilen başka bir yerde1,13 30 µg sulandrarak Örnek 1:1 arabellek (boya, 1 azaltmak x yükleme x 1.6) yük içinde yerine getirilir.
    Not: protein fraksiyonu başına 30 µg yeterlidir, ancak en iyi çözünürlük için ayarlanabilir. 3 - %8 Tris-asetat Poli-Akrilamid jelleri çözünmez kesir için kullanılmalıdır. 4 - %12 bis-Tris jelleri çözünür kesir için tavsiye edilir.
  2. Kısaca 5 dk. santrifüj örnekleri (haddeleme kaynatın) kaynatın (15 s) örnek toplamak için 6.000 x g de.
  3. Kesirler SDS-sayfa ve western blot, azaltılmış örnekleri için üreticinin protokolüne göre analiz.
    Not: Çözünmez kesir en iyi 0,45 µM nitroselüloz membran Transfer edildiğinde giderir. 0,45 veya 0.2 µM nitroselüloz faiz protein büyüklüğüne bağlı olarak çözünür kesir için kullanılabilir. Bazı optimizasyon HMW malzemeleri en iyi transferi için gerekli olabilir.
  4. Membran protein verimlilik yükleme görselleştirmek için tüm protein leke ile (örneğin, MEMcode, bkz: Malzemeler tablo) leke.
    Not: Batı lekesi ortalama piksel yoğunluğu tarafından çözümlenebilir. Çözünür kesirler en iyi deneysel sistemi için uygun bir ev tutma protein için normalleştirilmiş. Çözünmez kesir olarak göreli protein bereket tersinir protein boyama veya ayrı leke üzerinde Histon 3 normalleştirme tarafından doğrulandı.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Kararlılık-in ayırma takip çözünür ve çözünmez hücre lysates Batı analizi ve filtre retardasyon deneyleri (Şekil 2) kullanarak tespit edilebilir. Örnek olarak, HEK293T hücre transfection reaktifi (örneğin, lipofectamine 2000) kullanarak transfected, ile HTT exon 1 kodlama cDNA 97 glutamin içeren Poli prolin zengin bölgeye göre takip15 tekrarlar ve bu hücreler için izin verildi 44 h. hücreleri tedavi edildi için hızlı ya 5 mikr...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bazı önlemler tutarlı ve kantitatif sonuç sağlamak yukarıdaki iletişim kuralları için ihtiyaç vardır. İlk olarak, mHTT her iki kesirler kendiliğinden toplamları üzerine birden çok donma çözülme çevrimleri, zamanla oluşturacak özellikle ne zaman yüksek bir konsantrasyon içinde. Böylece protein preps aliquots dondurma ve yalnızca gerekli birim Protokolü yukarıda açıklandığı gibi tahlil çalıştırmadan önce çözülme çok önemlidir. Ayrıca, çözünmez kesir çözdürme üzerine beyaz precipitant belirtiyorsa, sulandırma bir ek 5 s son...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Bu eser NIH (RO1-NS090390) tarafından desteklenmiştir. Ayrıca Dr. Joan Steffanfor teknik yardım ve tartışma bu tahlil geliştirilmesi sırasında teşekkür etmek istiyorum.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Steril FiltreKırlangıçSCGP505REVidalı kapak, steril vakum filtresi
1 mL Doku Öğütücü, DounceWheaton357538
SonicatorQsonicaModel Q125
DC Protein TestiBiorad5000111Lowry testi ile karşılaştırılabilir
Tris 1M tampon çözeltisiAlfa AesarJ60636
Triton X-100FisherBP151-100
NaCl 5M çözeltisiTeknovaS0251
GliserolFisherBP229-1
%20 SDS çözeltisiTeknovaS0295
N-etilmaleimidSigmaE1271
Fenilmetilsülfoni florürSigmaP7626% 100'de 100mM stok çözeltisi oluşturun EtOH, 4 derecede saklayın; C
Sodyum ortovanadatSigmaS6508Suda 0.5M stok çözeltisi oluşturun
LeupeptinSigmaL2884Suda 10mg / ml stok çözeltisi oluşturun
AprotininSigmaA1153Suda 10mg / ml stok çözeltisi oluşturun
Sodyum FlorürSigmaS4504Suda 500mM stok çözeltisi oluşturun
Anti-HTTMilliporeMAB5492Western blot için 1:1000, filtre geciktirme testi için 1:500 kullanın
Anti-GAPDHNovus BiologicalsNB100-56875Çözünür western blot için 1:1000 kullanın

Kaynaklar

  1. Ochaba, J., et al. PIAS1 Regulates Mutant Huntingtin Accumulation and Huntington's Disease-Associated Phenotypes In Vivo. Neuron. 90 (3), 507-520 (2016).
  2. La Spada, A. R., Taylor, J. P. Repeat expansion disease: progress and puzzles in disease pathogenesis. Nat Rev Genet. 11 (4), 247-258 (2010).
  3. Reiner, A., Dragatsis, I., Dietrich, P. Genetics and neuropathology of Huntington's disease. Int Rev Neurobiol. 98, 325-372 (2011).
  4. The Huntington's Disease Collaborative Research Group. A novel gene containing a trinucleotide repeat that is expanded and unstable on Huntington's disease chromosomes. Cell. 72 (6), 971-983 (1993).
  5. Sassone, J., Colciago, C., Cislaghi, G., Silani, V., Ciammola, A. Huntington's disease: the current state of research with peripheral tissues. Exp Neurol. 219 (2), 385-397 (2009).
  6. Weydt, P., et al. Thermoregulatory and metabolic defects in Huntington's disease transgenic mice implicate PGC-1alpha in Huntington's disease neurodegeneration. Cell Metab. 4 (5), 349-362 (2006).
  7. Schulte, J., Littleton, J. T. The biological function of the Huntingtin protein and its relevance to Huntington's Disease pathology. Curr Trends Neurol. 5, 65-78 (2011).
  8. Gipson, T. A., Neueder, A., Wexler, N. S., Bates, G. P., Housman, D. Aberrantly spliced HTT, a new player in Huntington's disease pathogenesis. RNA Biol. 10 (11), 1647-1652 (2013).
  9. Neueder, A., et al. The pathogenic exon 1 HTT protein is produced by incomplete splicing in Huntington's disease patients. Sci Rep. 7 (1), 1307(2017).
  10. Arndt, J. R., Chaibva, M., Legleiter, J. The emerging role of the first 17 amino acids of huntingtin in Huntington's disease. Biomol Concepts. 6 (1), 33-46 (2015).
  11. Saudou, F., Finkbeiner, S., Devys, D., Greenberg, M. E. Huntingtin acts in the nucleus to induce apoptosis but death does not correlate with the formation of intranuclear inclusions. Cell. 95 (1), 55-66 (1998).
  12. Kim, S., Kim, K. T. Therapeutic Approaches for Inhibition of Protein Aggregation in Huntington's Disease. Exp Neurobiol. 23 (1), 36-44 (2014).
  13. O'Rourke, J. G., et al. SUMO-2 and PIAS1 modulate insoluble mutant huntingtin protein accumulation. Cell Rep. 4 (2), 362-375 (2013).
  14. Shibata, M., et al. Regulation of intracellular accumulation of mutant Huntingtin by Beclin 1. J Biol Chem. 281 (20), 14474-14485 (2006).
  15. Apostol, B. L., et al. A cell-based assay for aggregation inhibitors as therapeutics of polyglutamine-repeat disease and validation in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (10), 5950-5955 (2003).
  16. Wanker, E. E., et al. Membrane filter assay for detection of amyloid-like polyglutamine-containing protein aggregates. Methods Enzymol. 309, 375-386 (1999).
  17. Sontag, E. M., et al. Detection of Mutant Huntingtin Aggregation Conformers and Modulation of SDS-Soluble Fibrillar Oligomers by Small Molecules. J Huntingtons Dis. 1 (1), 119-132 (2012).
  18. Grima, J. C., et al. Mutant Huntingtin Disrupts the Nuclear Pore Complex. Neuron. 94 (1), 93-107 (2017).
  19. Sontag, E. M., et al. Methylene blue modulates huntingtin aggregation intermediates and is protective in Huntington's disease models. J Neurosci. 32 (32), 11109-11119 (2012).
  20. Trushina, E., Rana, S., McMurray, C. T., Hua, D. H. Tricyclic pyrone compounds prevent aggregation and reverse cellular phenotypes caused by expression of mutant huntingtin protein in striatal neurons. BMC Neurosci. 10, 73(2009).
  21. Shahmoradian, S. H., et al. TRiC's tricks inhibit huntingtin aggregation. Elife. 2, e00710(2013).
  22. Kim, Y. M., et al. Proteasome inhibition induces alpha-synuclein SUMOylation and aggregate formation. J Neurol Sci. 307 (1-2), 157-161 (2011).
  23. Goldberg, N. R. S., et al. Human Neural Progenitor Transplantation Rescues Behavior and Reduces alpha-Synuclein in a Transgenic Model of Dementia with Lewy Bodies. Stem Cells Transl Med. 6 (6), 1477-1490 (2017).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Huntingtin ProteiniProtein Fraksiyonlamaz n r z nmez Ay r mY ksek Molek ler A rl kWestern Blot AnaliziSDS PAGEProtein AnaliziH cre LizisiSantrif jlemeSonikasyon

İlgili makaleler