Yalıtım ve dinamik bir teşvik etmek kemirgen Microglia kültürünü Morfoloji Serum-Alerjik orta Ramified

Summary

Ayrıntılı olarak mikroglial işlevini anlamak için çaba olgun vivo içinde microglia özelliklerini özetlemek mikroglial kültür modellerin eksikliği tarafından engel. Bu iletişim kuralı sağlam çok ramified olgun sıçan microglia tanımlanan-orta koşullar altında yaşama korumak için tasarlanmış bir yalıtım ve kültür yaklaşım anlatılmaktadır.

Abstract

Microglia tüm merkezi sinir sistemi (MSS) hücreleri % 5-10'u temsil ve geliştirme, homeostasis ve hastalık sırasında önem onların katkıları nedeniyle giderek çizim. Makrofajlar ayrıntılı olarak incelenmiştir rağmen yıl, özel şekil-in microglia, MSS doku yerleşik makrofajlar, kısmen olgun mikroglial özetlemek için yetenek sınırlamaları nedeniyle büyük ölçüde gizemli kalmıştır Kültür özelliklerinde. Burada, saf microglia--dan olgun kemirgen beyin hızlı yalıtım için basit bir yordam gösterilmektedir. Biz de mikroglial canlılık yüksek düzeyde zaman içinde destek serum serbest kültür koşulları tanımlamak. Bu tanımlanan-orta koşullar altında kültürlü Microglia sergi ayrıntılı ramified süreçleri ve dinamik gözetim davranış. Biz kültürlü microglia serum maruz kalma bazı etkileri göstermek ve nasıl bu serum-Alerjik kültürler hem serum maruz kültürler gibi microglia içinde vivokarşılaştırmak tartışıyorlar.

Introduction

CNS parankimi makrofajlar microglia nöronal devreler ve gliyal sinyal ağları geniş bir dizi ile etkileşim. Geliştirme ve homeostasis sinaptik budama, apoptotik hücre Gümrükleme ve nöronal işlemleri^1,2geçici etkileşimleri aracılığıyla beynin hayati rol oynarlar. Microglia nörolojik yaralanmaları, erken müdahale uzun, ince süreçlerinin lezyon siteler inflamatuar yanıt koordine etmek ve kanama^3,4sınırlamak için uzanan vardır. Mikroglial morfoloji ve işlev değişiklikleri akut ve kronik CNS yaralanmaları her yerde vardır ve Morfoloji, Yerelleştirme ve hasta....

Protocol

Kemirgenler ilgili tüm yordamlar için ulusal ve devlet yasaları ve politikaları ile uyumlu Stanford Üniversitesi yönergeleri standartlarla uyumlu. Tüm hayvan yordamları laboratuar hayvan bakım Stanford Üniversitesi'nin Yönetim Panel tarafından kabul edildi.

Not: Tüm çözüm ve tampon besteleri Tablo malzemeleritemin edilmektedir.

1. CD11b Immunopanning (gün 0) için bir petri hazırlayın

Not: her 1-2 çocuk sıçan beyin yerine 1 immunopanning yemek hazırlamak.

1. 25 mL 50 mM Tris pH 9,5 çözüm için 15 cm Petri kabına ekleyin.
2. Keçi Anti-fare IgG (H + L zincirl....

Results

Bu iletişim kuralı Juvenil sıçanlarından emir kültür yüksek saflıkta ramified microglia için bir yöntemi açıklar. Benzer sonuçlar olgunlaşmamış, perinatal ve Yetişkin Hayvanlar, kullanarak aşağıda anlatıldığı gibi alınabilir. Hücre izolasyonların genellikle ince nüanslar ve hücreleri ölmek için birçok fırsat içerir beri kalite kontrol denetim noktaları çeşitli adımlar başarı belirlemenize yardımcı olması için kullanılır. Genellikle birden çok adımda yalıtım Protokolü (

Discussion

Microglia sentinel bağışıklık hücreleri MSS gördükleri için çevresel değişiklikler oldukça tepkili olduklarını; Bu nedenle, büyük bir özenle hücrelerindeki inflamatuar yanıt onların izolasyon ve kültür⁸sırasında en aza indirmek için gereklidir. Bu hız ve sıcaklık bu protokolüyle içinde gerçekleştirilir. Böylece tüm Santrifüjü adımları 4 ° C'de gerçekleşmesi mümkün büyük ölçüde harekete geçirmek, azaltır zaman buz üzerinde veya 4 ° C'de hücreler tutmak, hayvanlar ile buz gibi perfüzyon tampon perio.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sıçan: Sprague-Dawley	Charles River Kedi	# 400
fare sıçan önleyici CD11b monoklonal (klon OX42)	Bio-Rad	Kedi# MCA275R	Kaydırma: 1:1.000; Boyama: 1:500
Keçi polikolonal anti-Iba1	Abcam	Kedi # AB5076	Boyama: 1:500
Tavşan poliklonal anti-Ki67	Abcam	Kedi # AB15580	Boyama: 1:500
Alexa Fluor Eşek anti-fare 594	Invitrogen	Cat # 11055	Boyama: 1:500
Alexa Fluor Eşek anti-keçi 488	Invitrogen	Cat # A-21203	Boyama: 1:500
Alexa Fluor Eşek anti-Tavşan 647	Invitrogen	Cat # A-31573	Boyama: 1:500
Triton-X (ICC boyamada deterjan)	Thermo Fisher	Cat # 28313
Heparan sülfat	Galen Laboratuvar Malzemeleri	Kedi # GAG-HS01
Heparin	Sigma & nbsp;	Kedi # M3149
Süt katılarından pepton	Sigma Cat	# P6838
TGF -β 2	Peprotech	Kedi # 100-35B
Murin IL-34	Ar-Ge D Sistemleri	Cat# 5195-ML/CF
Küçükbaş yünü kolesterol	Avanti Polar Lipidler	Cat# 700000P
Kollajen IV	Corning	Kedi # 354233
Oleik asit	Cayman Kimyasalları	Kedi # 90260
11 (Z) Eikosadienoik (Gondoik) Asit	Cayman Kimyasalları	Kedi # 20606
Calcein boya	Invitrogen	Kedi # C3100MP
Etidyum homodimer-1	İnvitrojen	Kedi # E1169
DNaseI	Worthington	Kedi # DPRFS
Percoll PLUS	GE Sağlık	Kedi # 17-5445-02
Tripsin	Sigma Kedi	# T9935
DMEM / F12	Gibco	Kedi # 21041-02
Penisilin / Streptomisin	Gibco	Kedi # 15140-122
Glutamin	Gibco	Kedi # 25030-081
N-asetil sistein ve nbsp;	Sigma	Kedi # A9165
İnsülin	Sigma Kedi	# 16634
Apo-transferrin ve nbsp;	Sigma	Cat # T1147
Sodyum selenit	Sigma Cat	# S-5261
DMEM (yüksek glikoz)	Gibco	Cat # 11960-044
Dapi Fluoromount-G	Güney Biyoteknoloji Kedi	# 0100-20
Poli-D-Lizin	Sigma	Cat# A-003-E Primaria
Plakaları	VWR	Cat # 62406-456
< güçlü > Adı< / strong>	Company< / strong><	strong>Katalog Numarası< / strong>	Comments< / strong>
Stok reaktifleri  < / güçlü >
Apo-transferrin			Sulandırma: PBS < br / >'de 10 mg / mL Kullanılan konsantrasyon: 1: 100 < br / > Depolama: -20 / derece; C
N-asetil sistein			Sulandırma: H2O içinde 5 mg / mL Kullanılan konsantrasyon: 1: 1.000 < br / > Depolama: -20 / derece; C
Sodyum selenit			Sulandırma: H2O içinde 2,5 mg / mL Kullanılan konsantrasyon: 1: 25.000 < br / > Depolama: -20 derece; C
Kollajen IV			Sulandırma: 200 μ PBS cinsinden g/mL Kullanılan konsantrasyon: 1:100 Depolama: -80&derece; C
TGF-b2			Sulandırma: PBS içinde 2 mg / mL Kullanılan konsantrasyon: 1: 1.000 < br / > Depolama: -20 / derece; C
IL-34			Sulandırma: 200 μ PBS cinsinden g/mL Kullanılan konsantrasyon: 1: 1.000 Depolama: -80 derece; C
Küçükbaş yünü kolesterol			Sulandırma: %100 etanol içinde 1,5 mg/mL Kullanılan konsantrasyon: 1: 1.000 < br / > Depolama: -20 derece; C
Heparan sülfat			Sulandırma: H2O içinde 1 mg / mL Kullanılan konsantrasyon: 1: 1.000 < br / > Depolama: -20 / derece; C
Oleik asit / Gondoik asit			Sulandırma: Gondoik: 0.001 mg / mL; Oleik:% 100 etanol < br / > içinde 0.1 mg / mL Kullanılan konsantrasyon: 1: 1.000 < br / > Depolama: -20 derece; C
Heparin			Sulandırması: PBS içinde 50 mg / mL Kullanılan konsantrasyon: 1: 100 < br / > Depolama: -20 derece; C
Name	Company	Katalog Numarası	Comments
Solutions
Perfüzyon Tamponu Tarifi			: 50 μ DPBS++'da g/mL heparin (Ca++ ve Mg+ + ile PBS) Yorumlar: Buz gibi soğukken kullanın
Douncing Buffer			Tarifi: 200 μ 50 mL DPBS++ içinde L %0,4 DNaseI Yorumlar: Buz gibi soğuk
Kaydırma Tamponu			Tarifi: DPBS++Microglia Growth Medium'da (MGM
			Tarif: 100 birim/mL penisilin, 100 &mu içeren DMEM/F12; g/mL streptomisin, 2 mM glutamin, 5 & mu; g/mL N-asetil sistein, 5 μ g/mL insülin, 100 μ g/mL apo-transferrin ve 100 ng/mL sodyum selenit Yorumlar: Mikroglia'yı immnopanning kabından çıkarmak için buz gibi MGM kullanın.
Kollajen IV Kaplama			Tarifi: 2 &mu içeren MGM; g/mL kollajen IV
Miyelin Ayırma Tamponu			Tarifi: 9 mL Percoll PLUS, Ca++ ve Mg++ olmadan 1 mL 10x PBS, 9 μ L 1 M CaCl2, 5 & mu; L 1 M MgCl2 Yorumlar: Eklendikten sonra iyice karıştırın  CaCl2 ve MgCl2
TGF-b2/IL-34/Kolesterol içeren büyüme ortamı (TIC)			Tarif: İnsan 2 ng/mL TGF-b2, 100 ng/mL murin IL-34, 1.5 & mu içeren MGM; g/mL küçükbaş yünü kolesterol, 10 μ g / mL heparan sülfat, 0.1 & mu; g / ml oleik asit ve 0.001 & mu; g/ml gondoik asit Yorumlar: 37 °C'ye ısıtılmış ortama kolesterol eklediğinizden emin olun; C ve 1.5 &mu'dan fazla eklemeyin; g / mL veya çökelir. Kolesterol içeren ortamları filtrelemeyin. Optimal pH'ı sağlamak için hücrelere eklemeden önce TIC ortamını 30 dakika - 1 saat boyunca% 10 CO2 ile dengeleyin.