Yalıtım ve dinamik bir teşvik etmek kemirgen Microglia kültürünü Morfoloji Serum-Alerjik orta Ramified

Özet

Ayrıntılı olarak mikroglial işlevini anlamak için çaba olgun vivo içinde microglia özelliklerini özetlemek mikroglial kültür modellerin eksikliği tarafından engel. Bu iletişim kuralı sağlam çok ramified olgun sıçan microglia tanımlanan-orta koşullar altında yaşama korumak için tasarlanmış bir yalıtım ve kültür yaklaşım anlatılmaktadır.

Özet

Microglia tüm merkezi sinir sistemi (MSS) hücreleri % 5-10'u temsil ve geliştirme, homeostasis ve hastalık sırasında önem onların katkıları nedeniyle giderek çizim. Makrofajlar ayrıntılı olarak incelenmiştir rağmen yıl, özel şekil-in microglia, MSS doku yerleşik makrofajlar, kısmen olgun mikroglial özetlemek için yetenek sınırlamaları nedeniyle büyük ölçüde gizemli kalmıştır Kültür özelliklerinde. Burada, saf microglia--dan olgun kemirgen beyin hızlı yalıtım için basit bir yordam gösterilmektedir. Biz de mikroglial canlılık yüksek düzeyde zaman içinde destek serum serbest kültür koşulları tanımlamak. Bu tanımlanan-orta koşullar altında kültürlü Microglia sergi ayrıntılı ramified süreçleri ve dinamik gözetim davranış. Biz kültürlü microglia serum maruz kalma bazı etkileri göstermek ve nasıl bu serum-Alerjik kültürler hem serum maruz kültürler gibi microglia içinde vivokarşılaştırmak tartışıyorlar.

Giriş

CNS parankimi makrofajlar microglia nöronal devreler ve gliyal sinyal ağları geniş bir dizi ile etkileşim. Geliştirme ve homeostasis sinaptik budama, apoptotik hücre Gümrükleme ve nöronal işlemleri^1,2geçici etkileşimleri aracılığıyla beynin hayati rol oynarlar. Microglia nörolojik yaralanmaları, erken müdahale uzun, ince süreçlerinin lezyon siteler inflamatuar yanıt koordine etmek ve kanama^3,4sınırlamak için uzanan vardır. Mikroglial morfoloji ve işlev değişiklikleri akut ve kronik CNS yaralanmaları her yerde vardır ve Morfoloji, Yerelleştirme ve hastalık Birleşik¹çeşitli bir yelpazede inflamatuar aracılar ifade microglia sergi değişmiş. Nörodejeneratif hastalıklar için risk alter mutasyonlar kez ağırlıklı olarak veya sadece hastalık patogenezinde veya ilerleme^{5 microglia için kritik bir rol işaret olduğu gibi MSS microglia tarafından ifade edilir insan genetik çalışmalar göstermektedir} . Yaralanma ve hastalık onların önem dikkate alındığında, mikroglial Biyoloji anlayışı sürdürmek yeni tedavi yaklaşımları geliştirmek için bir yüksek önceliktir.

Mikroglial Biyoloji anlayış için birçok kritik gelişmeler teknikleri ve kültür yöntemleri, gen ifade profilleri ve işlev tanımları da dahil olmak üzere diğer makrofaj nüfus çalışmalarda keşfetti mekanizmaları extrapolating tarafından ortaya çıktığı / morfolojik Birleşik. İşlevler genellikle oynamaya CNS manzara içinde şaşırtıcı şekilde makrofaj Genelleştirilmiş, microglia olmakla birlikte, kendilerini son derece uzmanlaşmış, ramified bir morfoloji ve onları diğer doku dışında setleri benzersiz gen ifade imza sergilenmesi makrofajlar⁶. Microglia--dan en diğer doku makrofajlar ayrı bir soy var; MSS ilkel hematopoiesis bir erken embriyonik dalga sırasında kolonize ve hayatı, bağımsız olarak kesin hematopoiesis⁷katkıları boyunca kendini yenilemek. Yetişkin microglia tam olgun gen ifade imza kadar ikinci doğum sonrası hafta⁸elde değil. Çevreleyen doku çevre ipuçları MSS sınırlı maruz kalma kan - beyin bariyerini⁹tarafından verilen kan kaynaklı faktörler içeren özel doku makrofaj özellikleri⁶, dikte içinde önemli bir rol oynamaktadır.

CNS homeostazı ve hastalığı mikroglial katkıları tam olarak anlamak için bir engel olduğunu olgun microglia görülen vivo içinde arıtılmış hücreleri ile özel özelliklerini recapitulating zorluk tüp bebek. İzole etmek için pek çok yöntem geliştirilmiştir ve kültür olduğu gibi microglia ama çoğu yaklaşımlar hücre survival desteklemek için serum güveniyor. Biz doğal olarak değişken bir reaktif biyoaktif molekülleri geniş bir dizi içeren, protozlar bir Morfoloji teşvik çünkü nükleer silahların yayılmasına karşı microglia ile çalışma artış özellikle sorunlu olduğunda, serum, bu ek göstermiştir ve microglia maruz kaldığında faktörlerin kan - beyin bariyerini bozulma sonra bulaşan kan için artan fagositoz⁹ vivo içinde sık görülen. Bu ölçümler tarafından serum Günese maruz kalan hücreleri microglia yaralanma veya hastalık durumlarında benzer ama tür değişiklikler azalır ne zaman microglia kültürlü CSF-1 (veya IL-34) içeren tanımlanmış büyüme orta, TGF-β, kolesterol ve selenit.

Bu iletişim kuralı Juvenil sıçan microglia kısa bir süre önce iş⁹' a ilgili serum-Alerjik koşullar altında kültür için ayrıntıları sağlar. Bu iletişim kuralı için rats postnatal gün 21-30 (P21 - P30) gelen aerodinamik ancak verim ve genel canlılığı türler ve hayvan yaş bağlı olarak değişir ama microglia sıçanlar ve fareler her yaştan itibaren yalıtmak için adapte edilebilir. Azami verimi ve biraz çocukça microglia kullanırken en iyi canlılık elde edilir (~ P9), verimleri ve yavaş yavaş biraz daha düşük seviyeleri yetişkin hayvanlarda sivrilen canlılığı ile. Microglia de fare ayrılmış olabilir ama biz fare hücreleri anlamlı olarak daha yüksek verimleri, canlılık ve ramified türleri Morfoloji, karmaşıklığı fare hücre kültürlerinde serum-Alerjik karşılaştırıldığında gösterir ki bulduk. Hayvanlar P50 daha büyük yaş bu iletişim kuralıyla değerlendirilmemiştir. Bu immunopanning yalıtım yordamı sırasında yalıtım mikroglial transkripsiyon profilleri değişiklikleri en aza indirmek için ve hücrelerin aşağı akım canlılığı en üst düzeye çıkarmak için optimize edilmiştir. Bu teknikleri ve medya formülasyonları kullanılarak, yüksek-canlılık birincil kültürler hafta boyunca sürekli olabilir. Bu koşullar altında kültürlü Microglia son derece ramified bir Morfoloji hızlı uzantısı ve geri çekme işlemleri içeren sergi ve nispeten düşük oranları yayılması. Biz serum-pozlama bu özellikler üzerinde önemini vurgulamak ve diğer yaklaşımlar göre bu yöntemin zayıf ve güçlü tartışıyorlar.

Protokol

Kemirgenler ilgili tüm yordamlar için ulusal ve devlet yasaları ve politikaları ile uyumlu Stanford Üniversitesi yönergeleri standartlarla uyumlu. Tüm hayvan yordamları laboratuar hayvan bakım Stanford Üniversitesi'nin Yönetim Panel tarafından kabul edildi.

Not: Tüm çözüm ve tampon besteleri Tablo malzemeleritemin edilmektedir.

1. CD11b Immunopanning (gün 0) için bir petri hazırlayın

Not: her 1-2 çocuk sıçan beyin yerine 1 immunopanning yemek hazırlamak.

1. 25 mL 50 mM Tris pH 9,5 çözüm için 15 cm Petri kabına ekleyin.
2. Keçi Anti-fare IgG (H + L zincirler) yemek 6 µg/mL nihai bir konsantrasyon için ekleyin. Eşit dağıtmak için plaka girdap.
3. Yemek için 1-3 h 37 ° C'de kuluçkaya
4. Durulama yemekleri üç kez ile DPBS⁺⁺ (fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) Ca^{2 +} ve Mg^{2 +}ile), daha sonra 1 µg/mL OX42 antikor içeren arabellek kaydırma bir çözüm ile değiştirin. Gecede, oda sıcaklığında bulaşıkları düz bir yüzeye bırak.

2. doku koleksiyonu (1 gün)

Not: Bu protokol ~ 3-4 h almalıdır.

1. Başlamadan önce tüm çözümler steril ve soğutulmuş buz üzerinde olduğundan emin olun. Tüm aletleri buz üzerinde sakin ve etanol ile kullanmak için önceden sterilize.
2. Aşağıdaki uygun yasal prosedürleri, karbon dioksit boğulma tarafından bir çocuk laboratuvar sıçan kurban.
   Not: Alternatif olarak, ketamin/xylazine (100-200 µL 24 mg/mL ketamin bas, 2.4 mg/mL xylazine) öldürücü bir doz ile genç hayvanlar kurban. 14 günden daha az sürede hayvanlardır ketamin/xylazine kullanılmalıdır. Birden fazla hayvan kullanıyorsanız, bir hayvandan dokuya ayıklamak ve buz sonraki hayvanlar geçmeden önce önceden soğutulmuş DPBS⁺⁺ yerleştirin.
3. Bir hindpaw tutam ve devam etmeden önce hayvan tam yanıt vermeyi durdurma sorununu sağlamak.
4. Transcardially buz gibi perfüzyon arabellek arabellek açık bitene 27½-G iğne kullanarak 10-30 mL hayvanla sıvı.
   Not: Perfüzyon arabellek hacmi hayvan boyutu/yaş bağlı olarak değişir.
5. Hemen perfüzyon sonra hayvan başkanı kaldırın. Omurilik oksipital düzgün her iki tarafta diseksiyon makasla kesme gelen, beyin zarar vermemeye dikkat et. Kesmek sonra her tarafı dikkatle, Paryetal ve frontal kemik Burun kemiği doğru boyunca parça parça kesin. Forseps ile dikkatli bir şekilde geri kafatasının üst çekin, hızlı bir şekilde beyin (veya ilgi CNS yapıları) kaldırmak ve önceden soğutulmuş DPBS⁺⁺ buzda yerleştirin.
6. Tüm kalan hayvanlar için yineleyin.
   Not: Tüm devam etmeden adımları laminar akış başlıklı uygun steril koşullarda gerçekleştirilmesi gerekiyor.

3. mekanik ayrışma (1 gün)

1. Tüm beyin topladıktan sonra bir beyin bir soğuk neşter bıçakla buzda Petri kabına 1 mm³ parçalar halinde doğrayın ve bir buz gibi dounce homogenizer 5-7 mL buz gibi douncing arabellek ile aktarın. Bir beyin bir zaman ayırmak.
2. 10-20 nazik ve eksik vuruş ile gevşek-montaj dounce homogenizer kullanarak doku ayırmak. Değil doğrudan homogenizer alt doku ezmek, ama bunun yerine doku piston kenarlarına ve homogenizer arasındaki boşluğu ile itmek için dikkat ediniz.
3. Pistonlu Hava kabarcıkları giriş önlemek için dikkatli bir şekilde çıkarın. Kötü Disosiye doku parçaları homogenizer altına yerleşmek izin ve süpernatant bir yeni soğutulmuş 50 mL konik tüp için transfer.
4. Kaldırılan birimin taze douncing arabellek ile değiştirin ve 3,2 3,3 için toplam 3-4 tur veya tüm doku ayrışmış kadar aygıtlarından. Her beyin için yordamı yineleyin.

4. miyelin kaldırma (1 gün)

Not: Miyelin kaldırma microglia hayvanlardan P12 büyük yalıtım için kullanılır.

1. Hücre süspansiyon 25 mL pipet kullanarak 50 mL konik tüp hacmi ölçmek, sonra buz gibi douncing arabellek 33,5 ml toplam ses seviyesini ayarlamak için ekleyin.
2. Miyelin ayrılık arabellek (MSB) 10 mL hücre süspansiyon için iyice tüp birkaç kez ters çevirme tarafından ekleyip karıştırın. Bu da % 23 bir son konsantrasyon MSB 43,5 mL hacminde yol açar.
3. Hücreleri 500 x g yavaş frenleri 4 ° c de 15 dakika santrifüj kapasitesi.
   Not: Santrifüj yaklaşık 1,5-2 yavaşlatmak için dakika sürer. Bu miyelin ve ölü hücre artıkları, biraz bulanık süpernatant ve canlı hücreler için zenginleştirilmiş bir daha küçük Pelet üst tabakası oluşturur.
4. Miyelin/enkaz ve süpernatant bir pipet ile üst katmanı kaldırın. Daha bunun mümkün olduğunca kaldırılır olarak sağlamak için üst tabaka kaldırırken ilgilen.
5. Hücre Pelet arabellek kaydırma 12 mL içinde resuspend. Yavaşça kalmış olabilecek hücreleri herhangi bir kümeleri kadar kırmak için hücre süspansiyon triturate.

5. Immunopanning (1. gün)

1. Hücre süspansiyon büyük enkaz veya hücre kümeleri kaldırmak için 70 µm hücre süzgeç aracılığıyla geçmek.
2. Üç kez DPBS⁺⁺ile OX42 kaplı kaydırma çanak durulayın. Plakasına izin vermeyen yıkar arasında tamamen kuru.
3. Son DPBS⁺⁺ yıkama dökün ve filtre uygulanmış hücre süspansiyon kaydırma yemek için geçerlidir. Yavaşça hücreleri dağıtmak için plaka girdap, sonra plaka hücreleri bağlı kalmak izin vermek 20 dakika oda sıcaklığında düz bir yüzey üzerinde kuluçkaya. 20 dk daha uzun kuluçkaya değil veya hücreleri yemek kurtarmak çok zor olacak.
4. DPBS⁺⁺ ile kaydırma çanak yapışık olmayan hücreleri kaldırmak için 10 kez yıkayın. Microglia-ecek var olmak sıkıca plaka bağlı, bu yüzden diğer yapışık olmayan hücreleri kaldırılmasını sağlamak için her durulama ile plaka girdap.
5. Son DPBS⁺⁺ yıkama dökün ve 15 mL DPBS⁺⁺ ve 200 μL tripsin (%1.25 stok çözelti) adıyla değiştirin.
6. Yemek için ≤10 min trypsinize için % 10 CO₂ 37 ° C'de kuluçkaya.
   Not: 10 dk daha uzun süre devam etmeyin veya microglia kaldırmak zor olacak.
7. Trypsinization, 10 dakika sonra microglia hala plakasına kalmış olacak. 2 x tripsin kaldırmak, buz gibi microglia büyüme orta (MGM) 12 mL ile değiştirmek için DPBS⁺⁺ ile nazikçe yıkayın ve tripsin/DPBS⁺⁺ dökün.
8. Hücre/substrat etkileşim zayıflatmak ve yemek emin olun yardım için tabak 2 min için buz üzerinde kaydırma kaydırma çanak alanlarında kurumasını önlemek için düz yerdir.
9. Şiddetle kaydırma çanak hücreleri kurtarmak için bir 10 mL pipet ve damlalıklı denetleyicisinde yüksek hız ile pipet. 16 x 16 kılavuz sıvı akışı ile denemek ve tüm hücre kaldırma pipet çizin.
10. Hücreleri tabaktan ayırdıktan emin olmak için 20 X büyütme, mikroskop altında hücreleri denetleyin. Mark noktalar nerede hücreleri hareketsiz şaşırıp kalmış yemeğin üstüne ve tekrar bu alanlarda pipetting.
11. Hücre süspansiyon ve aliquot 3-4 mL başına 15 mL konik tüp süpernatant toplamak. 500 x g yavaş frenleri 4 ° c de 15 dakika çevir.
    Not: microglia küçük bir birim aracılığıyla iplik için hücre kurtarma maksimum sağlar.
12. MGM 0.5 mL ile hücre Pelet bırakarak süpernatant, Aspire edin.
13. Her Pelet içinde kalan MGM resuspend ve tüpler hücrelerden Havuzu.
14. Hemasitometre içeren hücreleri saymak.
15. Adım 6 - 7 uygulamaya bağlı olarak açıklandığı gibi plaka hücreleri.
16. Kültür hücreleri 37 ° c % 10 CO₂.
    Not: Hücreler kültür için ilâ 3-4 hafta düzenli medya değişikliklerle veya medya değişiklik ile bir hafta olabilir.

6. spot doku kültürü plakaları/Coverslips (gün 1) kaplama

1. Kollajen IV kaplama doğrudan bir 24-şey Anyonik/Katyonik kaplamalı doku kültürü tabak merkezinde 15 µL plaka ( Malzemeler tablo Ayrıntılar için bakınız) ve % 10 CO₂37 ° C'de 15 dakika kuluçkaya.
2. Hemasitometre hücrelerle sayım sonra 2.3 x 10⁵/mL MGM hücrelere oranında seyreltin. Kollajen IV spot ve hemen plaka 15 µL hücre süspansiyon bu noktaya Aspire edin; Bu 3,5 x 10³ hücreleri/spot verecektir. 5-10 dk 37 ° c % 10 CO₂ hücreler uygun, TGF-B2/IL-34/kolesterol içeren büyüme orta (TIC) CO_2-500 µL equilibrated eklemek izin vermek için hafifçe kuyuya kuluçkaya.
3. Eğer coverslips, ilk kat steril cam coverslips ile 10 µg/mL manevra-D-lizin (PDL) H₂O RT, 1 h için kaplama 3 kez H₂ile O yıkama ve bir başlık UV ışık altında kurumaya bırakın. Coverslips üzerine spot kaplama coverslips kuru olduğunda, adım 6.2 içinde açıklandığı gibi devam edin.

7. RNA/Protein izolasyon kaplama

1. 10⁴ hücreleri/iyi CO₂ gün 1, bir 24-şey Anyonik/Katyonik tüm alan doku kültürü plaka kollajen IV kaplama ile kaplı ve için 10 dk - 1 h % 10 CO₂, 37 ° C'de kuluçkaya sonra kaldırmak ve hemen 3-5 x plakası kat equilibrated TIC medya.
2. 2 günde bir % 50 medya değişiklik her biri için de bir gün sonra hazırlık yapmak. Ölü hücreleri iyi ortasında küme, bu yüzden oradan medya almak eğilimindedir.
3. Kültürleri korumak için 2-3 günde bir % 50 medya değişiklik yapmak. Ortam değişikliğine kültürler için istenmeyen bir değişken varsa, hücreleri yaklaşık 1 hafta 3 hafta düzenli bakım ile karşı herhangi bir medya değişiklik olmadan hayatta kalamaz.

Sonuçlar

Bu iletişim kuralı Juvenil sıçanlarından emir kültür yüksek saflıkta ramified microglia için bir yöntemi açıklar. Benzer sonuçlar olgunlaşmamış, perinatal ve Yetişkin Hayvanlar, kullanarak aşağıda anlatıldığı gibi alınabilir. Hücre izolasyonların genellikle ince nüanslar ve hücreleri ölmek için birçok fırsat içerir beri kalite kontrol denetim noktaları çeşitli adımlar başarı belirlemenize yardımcı olması için kullanılır. Genellikle birden çok adımda yalıtım Protokolü (

Tartışma

Microglia sentinel bağışıklık hücreleri MSS gördükleri için çevresel değişiklikler oldukça tepkili olduklarını; Bu nedenle, büyük bir özenle hücrelerindeki inflamatuar yanıt onların izolasyon ve kültür⁸sırasında en aza indirmek için gereklidir. Bu hız ve sıcaklık bu protokolüyle içinde gerçekleştirilir. Böylece tüm Santrifüjü adımları 4 ° C'de gerçekleşmesi mümkün büyük ölçüde harekete geçirmek, azaltır zaman buz üzerinde veya 4 ° C'de hücreler tutmak, hayvanlar ile buz gibi perfüzyon tampon perio...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Sıçan: Sprague-Dawley	Charles River Kedi	# 400
fare sıçan önleyici CD11b monoklonal (klon OX42)	Bio-Rad	Kedi# MCA275R	Kaydırma: 1:1.000; Boyama: 1:500
Keçi polikolonal anti-Iba1	Abcam	Kedi # AB5076	Boyama: 1:500
Tavşan poliklonal anti-Ki67	Abcam	Kedi # AB15580	Boyama: 1:500
Alexa Fluor Eşek anti-fare 594	Invitrogen	Cat # 11055	Boyama: 1:500
Alexa Fluor Eşek anti-keçi 488	Invitrogen	Cat # A-21203	Boyama: 1:500
Alexa Fluor Eşek anti-Tavşan 647	Invitrogen	Cat # A-31573	Boyama: 1:500
Triton-X (ICC boyamada deterjan)	Thermo Fisher	Cat # 28313
Heparan sülfat	Galen Laboratuvar Malzemeleri	Kedi # GAG-HS01
Heparin	Sigma & nbsp;	Kedi # M3149
Süt katılarından pepton	Sigma Cat	# P6838
TGF -β 2	Peprotech	Kedi # 100-35B
Murin IL-34	Ar-Ge D Sistemleri	Cat# 5195-ML/CF
Küçükbaş yünü kolesterol	Avanti Polar Lipidler	Cat# 700000P
Kollajen IV	Corning	Kedi # 354233
Oleik asit	Cayman Kimyasalları	Kedi # 90260
11 (Z) Eikosadienoik (Gondoik) Asit	Cayman Kimyasalları	Kedi # 20606
Calcein boya	Invitrogen	Kedi # C3100MP
Etidyum homodimer-1	İnvitrojen	Kedi # E1169
DNaseI	Worthington	Kedi # DPRFS
Percoll PLUS	GE Sağlık	Kedi # 17-5445-02
Tripsin	Sigma Kedi	# T9935
DMEM / F12	Gibco	Kedi # 21041-02
Penisilin / Streptomisin	Gibco	Kedi # 15140-122
Glutamin	Gibco	Kedi # 25030-081
N-asetil sistein ve nbsp;	Sigma	Kedi # A9165
İnsülin	Sigma Kedi	# 16634
Apo-transferrin ve nbsp;	Sigma	Cat # T1147
Sodyum selenit	Sigma Cat	# S-5261
DMEM (yüksek glikoz)	Gibco	Cat # 11960-044
Dapi Fluoromount-G	Güney Biyoteknoloji Kedi	# 0100-20
Poli-D-Lizin	Sigma	Cat# A-003-E Primaria
Plakaları	VWR	Cat # 62406-456
< güçlü > Adı< / strong>	Company< / strong><	strong>Katalog Numarası< / strong>	Comments< / strong>
Stok reaktifleri  < / güçlü >
Apo-transferrin			Sulandırma: PBS < br / >'de 10 mg / mL Kullanılan konsantrasyon: 1: 100 < br / > Depolama: -20 / derece; C
N-asetil sistein			Sulandırma: H2O içinde 5 mg / mL Kullanılan konsantrasyon: 1: 1.000 < br / > Depolama: -20 / derece; C
Sodyum selenit			Sulandırma: H2O içinde 2,5 mg / mL Kullanılan konsantrasyon: 1: 25.000 < br / > Depolama: -20 derece; C
Kollajen IV			Sulandırma: 200 μ PBS cinsinden g/mL Kullanılan konsantrasyon: 1:100 Depolama: -80&derece; C
TGF-b2			Sulandırma: PBS içinde 2 mg / mL Kullanılan konsantrasyon: 1: 1.000 < br / > Depolama: -20 / derece; C
IL-34			Sulandırma: 200 μ PBS cinsinden g/mL Kullanılan konsantrasyon: 1: 1.000 Depolama: -80 derece; C
Küçükbaş yünü kolesterol			Sulandırma: %100 etanol içinde 1,5 mg/mL Kullanılan konsantrasyon: 1: 1.000 < br / > Depolama: -20 derece; C
Heparan sülfat			Sulandırma: H2O içinde 1 mg / mL Kullanılan konsantrasyon: 1: 1.000 < br / > Depolama: -20 / derece; C
Oleik asit / Gondoik asit			Sulandırma: Gondoik: 0.001 mg / mL; Oleik:% 100 etanol < br / > içinde 0.1 mg / mL Kullanılan konsantrasyon: 1: 1.000 < br / > Depolama: -20 derece; C
Heparin			Sulandırması: PBS içinde 50 mg / mL Kullanılan konsantrasyon: 1: 100 < br / > Depolama: -20 derece; C
Name	Company	Katalog Numarası	Comments
Solutions
Perfüzyon Tamponu Tarifi			: 50 μ DPBS++'da g/mL heparin (Ca++ ve Mg+ + ile PBS) Yorumlar: Buz gibi soğukken kullanın
Douncing Buffer			Tarifi: 200 μ 50 mL DPBS++ içinde L %0,4 DNaseI Yorumlar: Buz gibi soğuk
Kaydırma Tamponu			Tarifi: DPBS++Microglia Growth Medium'da (MGM
			Tarif: 100 birim/mL penisilin, 100 &mu içeren DMEM/F12; g/mL streptomisin, 2 mM glutamin, 5 & mu; g/mL N-asetil sistein, 5 μ g/mL insülin, 100 μ g/mL apo-transferrin ve 100 ng/mL sodyum selenit Yorumlar: Mikroglia'yı immnopanning kabından çıkarmak için buz gibi MGM kullanın.
Kollajen IV Kaplama			Tarifi: 2 &mu içeren MGM; g/mL kollajen IV
Miyelin Ayırma Tamponu			Tarifi: 9 mL Percoll PLUS, Ca++ ve Mg++ olmadan 1 mL 10x PBS, 9 μ L 1 M CaCl2, 5 & mu; L 1 M MgCl2 Yorumlar: Eklendikten sonra iyice karıştırın  CaCl2 ve MgCl2
TGF-b2/IL-34/Kolesterol içeren büyüme ortamı (TIC)			Tarif: İnsan 2 ng/mL TGF-b2, 100 ng/mL murin IL-34, 1.5 & mu içeren MGM; g/mL küçükbaş yünü kolesterol, 10 μ g / mL heparan sülfat, 0.1 & mu; g / ml oleik asit ve 0.001 & mu; g/ml gondoik asit Yorumlar: 37 °C'ye ısıtılmış ortama kolesterol eklediğinizden emin olun; C ve 1.5 &mu'dan fazla eklemeyin; g / mL veya çökelir. Kolesterol içeren ortamları filtrelemeyin. Optimal pH'ı sağlamak için hücrelere eklemeden önce TIC ortamını 30 dakika - 1 saat boyunca% 10 CO2 ile dengeleyin.

) süt katılarından 2 mg/mL pepton