Toplanması ve işlenmesi büyük hayvanlar lenf düğümlerinden RNA analizi için: büyük hayvan türlerinin lenf nodu Transcriptomic çalışmalar için hazırlanıyor

Özet

Bu iletişim kuralı kimliği ve lenf düğümlerinden hayvancılık ve yaban hayatının yaklaşımlar örnekleme, eksizyon adımlar dahil olmak üzere büyük hayvanlar dokulardan lenf nodu transcriptomic profilleme için RNA izolasyonu için yordamlar genel bakış sağlar sonrası koleksiyonu saklama ve işleme için RNA analizi için birden fazla hayvan ve dikkat edilmesi gereken noktalar artı temsilcisi sonuçları arasında tutarlılığı sağlamak için.

Özet

Büyük hayvanlar (hayvancılık ve yaban hayatının) Hayvansal patojenler, brusella, Mycobacterium bovis, Salmonellave E. coli, dahil olmak üzere önemli rezervuar hizmet ve Patogenez çalışma için yararlıdır ve/veya doğal ana bakteri yayılmasını. Lenf düğümleri konak immün yanıt anahtar işlevi ile gen ekspresyonu hücrelerdeki zamansal değişimler enfeksiyon boyunca değerlendirmek için aşağı akım transcriptomic analizleri, RNA'ın potansiyel bir kaynak olarak lenf nodu doku hizmet. Bu makale işlemi lenf nodu koleksiyonu, doku örnekleme ve aşağı akım RNA ve Hayvancılık, işleme sığır (Bos Toros) Amerikan bizonu (bizon bizon sağlanan ek örnekler ile bir model olarak kullanarak genel bir bakış sunar ). Protokol vücutta konumunu, kimlik ve lenf nodlarının birden çok anahtar site kaldırma hakkında bilgi içerir. Ayrıca, bir biyopsi örnekleme yöntem örnekleme bir tutarlılık için birden çok hayvanlar arasında sağlayan sunulur. RNA RNA-sıralama ve RT-PCR gibi aşağı akım yöntemleri için uygun üretimi dahil olmak üzere örnek korunması için birkaç önemli noktalar ele alınmaktadır. Büyük hayvan vs fare saat ders çalışmalarında doğal uzun gecikmeler nedeniyle bozulması bağlamında incelenmesi, bu doku türü zaman tabii açıklamak için bizon ve sığır lenf nodu doku temsilcisi sonuçları sunulmuştur RNA bozulması diğer dokularda önceki metodolojik çalışma. Genel olarak, bu iletişim kuralı transcriptome projeler büyük hayvan örnekleri üzerinde başlayan her iki veteriner araştırmacılar ve moleküler biyologlar vivo içinde doku örnekleme ve vitro işleme teknikleri öğrenmeye ilgi için faydalı olacaktır.

Giriş

Transcriptome lenf nodlarının analizini RNA-sıralama patojenler çeşitli hayvanların bağışıklık yanıtı karakterize etmek için fırsat sunuyor. Bu yöntemi yaygın olarak fareler kullanılmıştır iken, analizleri daha büyük memeliler^1,2son zamanlarda genişleyen. Hayvancılık/büyük hayvan lenf düğümleri bir enfeksiyon, sadece aşı veya genetik yatkınlık çalışmaları onların kullanım için ve hedefleri için ilaç geliştirme, aynı zamanda insan çalışmaları için model sistemleri olarak tanımlanması için ana bilgisayar yanıt karakterize için kullanılabilir Hayvansal hastalıklar. Örneğin, brusella (etkileri dünya çapında her yıl yarım milyon kişi bir Hayvansal bakteriyel hastalığı) olması durumunda, artmasına rağmen önemli ölçüde maliyeti, çalışmalarda koyun veya keçi insan enfeksiyonu ve insan aşı daha alakalı vardır gelişme laboratuvar hayvan modellere kıyasla. Retiküloendotelyal sistem enfeksiyonu ama değil karakteristik klinik belirtiler³_. fare enfeksiyon modelleri özetlemek

Laboratuvar hayvan çalışmaları ile karşılaştırıldığında büyük hayvan deneyleri içinde işlemi mutlaka hasat doku ötenazi korunması için potansiyel bir meydan okuma sunuyor doku koleksiyonu arasında daha uzun bir gecikme oluşur. yüksek kaliteli RNA. Sağlam RNA biyolojik ilgili transcriptomic veri üretimi için önemlidir. Yüksek kaliteli RNA doku örneklerinden nesil koruma tesislerinde özellikle kritik büyük hayvan patojen araştırmalar yapılır. Bu tür çalışmalar sadece onaylı imkanları ve yüksek eğitimli personel gerektirir ama hangi iş bağlı olarak, on binlerce dolar yüzlerce arasında olabilir önemli finansal maliyetler de taşımak gerçekleştirmek doğal olarak daha zordur. Bu tür çalışmalar da bir disiplinler arası işbirliği ve onların karmaşıklık ekleyerek onların tamamlanması için disiplinler arası bilgi içerir. Bu nedenle, üzerinde eğitim, geliştirilmesi ve bağlılık bir aerodinamik sistemi örnek toplanması ve korunması için önemli yararları sağlar dokulara aşağı akım Moleküler çalışmalar için enfekte hayvan--dan.

Daha büyük lenf düğümleri topluluğu için fare lenf nodlarının örnekleme benzer karşılaştırıldığında doku koleksiyonu için ek sorunlar sunar. Örnek eksizyon için hazırlık ilgili iç yapılarını da içeren lenf nodu anatomisi temel bir anlayış gerektirir. Bir lenf nodu yapısını lenfoid lobules lenf ile dolu sinüsler çevrili oluşmaktadır. Bu yapılar içinde sert, fibröz kapsül içine alınır. ⁴ bir lenfoid kulak "temel anatomik ve fonksiyonel lenf nodu" birimidir ve köklerinin, derin kortikal bir birim ve medüller kordlar ve sinüsler⁴ (resim 1A) oluşur. B ve T lenfositler ev köklerinin ve derin kortikal birimleri, sırasıyla. Bu yapıların bir 3D iskele sağlamak ve lenfositler ve antijen veya antijen sunan hücreler arasındaki etkileşimi kolaylaştırmak.

Onlar daha yoğun bir retiküler meshwork içeren ve daha hassas bir retiküler meshwork oluşmaktadır ve hafif görünür sinüsler daha koyu görünmesini fena halde, köklerinin ve derin kortikal birimler kesilmiş yüzeyine belirlenebilir (Şekil 1B). Geleneksel olarak, patologlar lenf düğümleri olarak yüzeysel korteks (folikül), paracortex (derin kortikal adet) ve medulla (medüller kordlar ve sinüsler) bölgelerinde bakın. Uygun bir inceleme, tüm üç bölgeler olarak en iyi uygulama rutin patolojik muayene yönergeler lenf düğümleri⁵için kabul edilmiştir. Tutarlılık, boyutu ve rengi tek bir hayvan içinde bile lenf nodlarının önemli farklılıklar olduğunu unutmayın. Hayvan yaşlandıkça, onların lenf düğümleri boyutu küçülür ve bu genç hayvanlar daha sıkı hale, genellikle kendi bağ dokusu ve lenfoid normal bir azalma artış nedeniyle^6,7yapısı için eğiliminde olacaktır.

Şekil 1. Lenf nodu anatomisi. (A) Bu çizgi film görüntü anahtar yapıları betimleyen lenf nodu anatomisi gösterir. (B) bu hala görüntü kesit içinde kesilmiş sığır bir lenf nodu gösterir. Çıplak gözle görülebilir ilgili yapılar/katmanları vurgulanır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Deneysel soru bağlı olarak farklı lenf düğümleri toplama ve analiz için ilgi olacaktır. Periferik lenf düğümleri derin subkutan dokuda bulunan bunlar. Sığır, periferik veya yüzeysel lenf düğümleri genellikle klinik ve deneysel uygulamada kullanılan parotid, çene, retropharyngeal, prescapular, prefemoral dahil (precrural) ve yüzeysel kasık (supramammary içinde dişi, erkeklerde testis) () Şekil 2). Tablo 1' de, anahtar yüzeysel lenf düğümleri, özelliklerini sığır sistem⁸' de açıklandığı gibi özetlenmiştir. Aşağıda, bazı potansiyel lenf nodu toplama planları sığır bulaşıcı bakteriyel hastalıklar için soruşturma için bir başlangıç noktası olarak sunulmuştur.

Brusella abortus/brusella melitensis: Standart necropsies B. abortusiçin-enfekte sığır ve B. melitensis-virüslü keçi ulusal hayvan hastalığı Merkezi kurtarmak supramammary, prescapular ve parotid lenf nodu doku , hem ana bilgisayar RNA ifade profil oluşturma için RNA hazırlık ve bakteriyel numaralandırma için dövmek icin. B. abortus düzenli olarak her deneysel olarak enfekte sığır⁹_. bu lenf düğümlerinin elde edilebilir Bu lenf nodu türlerinin her biri bakteri varlığı içinde B. melitensistespit edilebilir-enfekte keçi kadar düşük çalışmalarımız (yayınlanmamış Boggiatto vd.,) RNA tabanlı yöntemlerini kullanarak en az dokuz ay sonrası enfeksiyon. Salmonella SP.: prescapular, subiliac (prefemoral), ve mezenterik lenf düğümleri-si olmak be yararlı sığır karkas Salmonella yaygınlık^10,11,12 profilleme sırasında ve transcriptomic çalışmalar için potansiyel ilgi olacak. E. coli O157: H7: mezenterik lenf düğümleri (at orta ince bağırsak ve distal ince bağırsak mekanlar) bakteriler enfekte buzağı (ancak değil enfekte yetişkin sığır)¹³ara sıra bir kurtarma siteleri olabilir. Leptospirosis (Leptospira sp.): bakterilerin kronik bir sebat meme bezi¹⁴drenaj lenf düğümleri gözlenmiştir. Mycobacterium bovis : Sığır, bakteri trakeobronşiyal ve mediastinal lenf düğümleri kurtarılan sonrası deneysel enfeksiyondan buzağı¹⁵olmuştur. Ayrıca, lenf nodu RNA virüsleri, domuz üreme ve solunum Sendromu virüs²gibi büyük hayvan ana bilgisayar yanıt incelemek için kullanılmıştır. Şekil 2 bir alt sığır vücuttaki bu büyük lenf düğümlerinin konumunu gösteriyor.

Resim 2: Çizgi film seçilen lenf nodu yerlerde tasvir Bos Toros . Numaralandırılmış lenf düğümleri açıklamalı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Bu kağıt ve ilişkili video, biz büyük hayvan lenf düğümleri moleküler biyologlar büyük hayvan enfeksiyonları transcriptomic çalışmalarda yer için bilgilendirici olacak şekilde RNA etütler yalıtım için bir iletişim kuralı mevcut. İlk olarak, biz genel bir bilgi yalıtım yordamı lenf düğümleri için örnekleme sığır ve bizon dokulara gelen örnek olarak kullanarak sağlar. Bu gösteri ile videoda gösterildiği eşleştirilmiş, RNA izolasyonu için tekrarlanabilir doku örnekleme için iş akışı olduğunu. Ardından, güvenlik, tutarlılık ve RNA kalite odaklı bir virüslü bir lenf düğümünün işlenmesi için önemli hususlar açıklanmaktadır.

RNA hazırlanması ile bir acidified fenol-guanidin isothiocyanate reaktif dokusundan Chomczynski ve Sacchi^16,17, silis tabanlı spin sütunlar varlığı üzerinde bir arıtma ile orijinal yöntemine dayalı chaotropic ajanlar Vogelstein ve Gillespie¹⁸özgün çalışmasına dayanmaktadır. Biz de sığır lenf bezleri alternatif yöntemler tarafından korunmuş transcriptomics için RNA'ın kurtarma için potansiyel incelemek. Son olarak, biz ötenazi ve örnekleme bizon kurtarılan RNA profilden üzerinde arasında bir artış etkisini gösteren temsili bir deney dahil olmak üzere büyük hayvan Nekropsi RNA kalitesinde zaman değişken etkisini keşfedebilirsiniz ve sığır lenf bezleri. Bu makalede sadece moleküler biyologlar ama da için veteriner araştırmacılar transcriptomic çalışmalar başlıyor işe.

Protokol

Burada tasvir hayvan Nekropsi yordamlar ulusal hayvan hastalığı Merkezi, Ames, İçişleri onaylı IACUC protokolleri altında kaplıdır Tüm deneylerin hayvan bakımı ve refah için onaylanmış yönergelere uygun olarak yapılmıştır.

1. önce Nekropsi ön planlama

1. Nekropsi önce taşınmaya Nekropsi suite aşağıdaki belgeleri hazırlayın:
   1. 1.5 veya 2 mL microcentrifuge tüpler ile dolu ~ 1.0 mL RNA koruma çözeltisi, bir raf veya taşıma kap. Doku hacmi koruma çözümü hacmi oranı için üreticinin yönergeleri izleyin emin olun.
   2. Tek kullanımlık neşter ve forseps temiz, autoclaved: bir set deri ve lenf düğümleri (bir hayvan başına her lenf nodu), toplamak için farklı bir küme dissekan için böylece çapraz bulaşma deri ve çevre lenf nodu Flora'yla önleme doku.
   3. 3 mm kullanılan neşter ve biyopsi araçları ve kesme tahtaları "Sharps" kapsayıcısı veya tek kullanımlık kanalları lenf nodu diseksiyonu kullanımda için biyopsi araçları, Nekropsi bıçaklar, yumruk.
   4. PPE sistemi için uygun BSL düzeyde çalışması için gerekli dahil olmak üzere kişisel koruyucu ekipman kullanın.
   5. Forseps, ayarlama aletleri/kuru mallar kullanarak Nekropsi önce tavada metal otoklav yeniden kullanılabilir metal araçlar içerir.

2. kimlik ve örnekleme sığır ve Bison lenf düğümlerinin

Şekil 3 . Sığır baş ve boyun lenf düğümlerinin. Baş ve boyun BosToroslar (A) Bu çizgi film görüntü gösterir seçili lenf düğümleri. (B) bu (sağda) kesit kesit (parotid tükrük bezi ile karşılaştırıldığında sol) parotid lenf düğümünde gösterilir. Dokular iki doku türleri arasındaki farka dikkat edin. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

1. Yalıtım sığır ve bizon prescapular lenf düğümlerinin
   1. Ötenazi yerel IACUC protokolüne dayanan hayvan (sığır veya bison deney için uygun herhangi bir yaş). Özellikle bir kalp atışı eksikliği, solunum yetersizliği ve Korneal refleks yokluğu da dahil olmak üzere kurumsal IACUC protokolünde açıklanan yöntemler tarafından ölüm onaylayın. Hayvan Nekropsi yere taşıyın.
      Not: İnsancıl ötenazi büyük hayvanlar laboratuvar uygulamada kullanılan çeşitli yöntemleri vardır. Ancak, intravenöz Fentobarbital sodyum ve Fenitoin Sodyum çözüm en yaygın olarak onaylanmış ve formu kullanılan bir ilçedir. Travma yönergelere hayvanlara ötenazi için başvurun. ¹⁹
      Uyarı: tüm ilgili Biyogüvenlik iletişim kuralları için bir delik geçirmez konteyner ve yeniden kullanılabilir metal bıçak ve forseps dekontaminasyonu "Sharps" güvenli bertarafı için yönergeleri de dahil olmak üzere ana bilgisayar Kurumu Nekropsi izleyin. Bu iletişim kuralı tek kullanımlık neşter kullanımından "Sharps" atık üretir. Kişisel koruyucu donanım çizme, Tulum, eldiven ve göz koruma da dahil olmak üzere kurumsal kurallar tarafından dikte edildiği gibi giyin.
   2. Hayvan dokuları üzerinde çalışmak için 3 katılımcıları tanımlayın.
      Not: Burada, tetkik 1 sorumlu büyük ölçekli istenen hayvan dokuları kesit, tetkik 2 farklı hayvan bölümlerden lenf düğümleri kurtarmak ve tetkik 3 ayrı bir masada her lenf nodu bölümlerinden ayırmak için çalışacak ve Onları tüpler koruyucu bir çözüm ile aktarın.
   3. Yanal recumbency hayvan yerleştirerek başlayın.
   4. Açık bacak diz (carpus); düzeyinde geri hareket ettirerek omuz genişletme Bu hareket omuz geri getirmek ve lenf nodu daha kolay bir palpasyonla için izin verir. Lenf nodu "yumru" varlığı için hissediyorum.
      Not: hastalık koşullarında lenfadenopati lenf düğümleri tanımlaması daha kolay kılan mevcut, olabilir, ama bu işlem tutarlılık, kompozisyon ve lenf nodu mimarisini de etkileyebilir.
   5. Yer alan bir kez ve hala genişletilmiş omuz ile bir neşter ya da Nekropsi bıçak anahat omuz boyunca bir cilt kesi yapmak için kullanın.
      Not: lenf nodu bulunduğu via palpasyonla olmuşsa bile belgili tanımlık kesme boyutu kısıtlamaz. Daha büyük bir kesi daha derin dokulara daha kolay erişim sağlar ve lenf nodu eksizyon tetkik için kolaylaştırır.
   6. Forseps bir çift kullanarak, omuz amacı ortaya çıkarmak ve kas boyun için cilt geri çek.
      Not: Prescapular lenf nodu kez özellikle overconditioned hayvanlarda deri altı yağ bulunur.
   7. Bir kez daha, lenf nodu (Şekil 3A) konumunu muayene et.
      Not: subkutan yag, lenf nodu şeklini palpe zaman yapacak. Ayrıca, onlar tarafından ince bir fibröz kapsül içine alınır gibi lenf düğümleri herhangi bir çevreleyen doku ile bitişik değildir.
   8. Prescapular lenf nodu bulmak sonra dikkatlice bir neşter ve forseps, kullanarak subkutan yağ dışarı teşrih ve lenf nodu yalıtır.
      1. İnce bir fibröz kapsül varlığı için Şekil 1Badımında, lenf nodu ve yağ dokusu arasında ayrım yapmak için tasvir bakın; lenf düğümleri herhangi bir çevreleyen doku ile bitişik değildir.
   9. Lenf nodu daha fazla kesit için doku transferi için bir plastik tepsi kullanarak lenf nodu diseksiyonu tablo aktarın.
      Not: Bu lenf düğümleri bizon görünümünü benzer. İlişkili video prescapular lenf düğümü olarak bir Amerikan bizonu sağ omuz dışında disseke görünümünü gösterir.
2. Yalıtım sığır ve bizon parotid lenf düğümlerinin
   1. Nekropsi yerdeki yanal recumbency hayvan yerleştirerek başlayın. Temporomandibuler eklem (TME) bulun.
      1. Bu bulmak zor ise, alt çene yavaş hareket ve hangi kafatası çene verdiği konumunu belirlemek; TME bu.
   2. Bir neşter ya da Nekropsi bıçak kullanarak, deride bir kesi dikkatli olun. Belgili tanımlık kesme ortak dorsal başlatın ve ventrally/dikey Çenemdeki boyunca uzatmak.
   3. Subkutan doku açıklamaya cilt incelemek. Parotid tükrük bezi ilk, büyük boy, loblu yüzey görünümünü ve kırmızı rengi nedeniyle görünür.
   4. Bir neşter ve forseps parotid tükrük bezi taşı bir kenara oturup parotid lenf nodu sadece kafatası ve tükürük bezi (Şekil 3A) medial bulmak için kullanma. Parotid lenf nodu doku doku için daha fazla alay önce inceleyin.
      Not: yüz (parotid ve çene) lenf düğümleri lenf nodu yalıtım yıkmak tükürük bezleri ile ilişkilidir. Lenf düğümleri, ile karşılaştırıldığında tükürük bezleri çok daha büyük ve loblu bir yüzey görünümü vardır. Ayrıca, kesme yüzeyi, tükrük bezleri doğada homojen ve lenf nodlarının (Şekil 3B) klasik kortikal ve medüller mimari desen Sergisi değil.
   5. Bezinin bir neşter ile tüketim. Daha fazla kesit için doku transferi için bir plastik tepsi kullanarak lenf nodu diseksiyonu tablo aktarmak.
3. Yalıtım dişi sığır ve bizon supramammary lenf düğümlerinin
   1. Hayvan yanal recumbency yerleştirin.
   2. İnguinal bölge ortaya çıkarmak ve meme bulmak için arka bacak yükseltmek.
      Not: bir sağlıklı, süt hayvan, bu lenf nodlarının palpasyonla mümkün olmayabilir. Emzikli bir hayvan bu lenf düğümleri meme tabanının kaudal sınırda aşikar olabilir.
   3. Bir neşter kullanmadan, bir kesik sadece dorsal supramammary bezleri açığa üst bacak çalışan meme için olun.
   4. Subkutan doku teşrih ve supramammary lenf nodu subcutaneous yağlı ince bir tabaka içinde gömülü bulmak. Eğer görsel olarak ayırt edilebilir, firma bünyesinde subcutaneous yağlı varlığı için maruz kalan doku muayene et.
   5. Bir neşter ve forseps kullanarak, dikkatle lenf nodu fat dosya sisteminden dışarı incelemek. Daha fazla kesit için doku transferi için bir plastik tepsi kullanarak lenf nodu diseksiyonu tablo aktarmak.

3. kesit ve lenf nodlarının depolama

1. İzole lenf düğümleri tetkik 2 3 ana Nekropsi alanı bitişik bir diseksiyon masada dissector üzerinden geçmek. Her lenf nodu bir kesme tahtası taze bir bölüm üzerinde yerleştirin. Kesme tahtaları bölümlerde tarafından lenf nodu art arda birden fazla lenf düğümleri alınmasını kolaylaştırmak için önceden etiket. Bulaşıcı örnekleri için tek kullanımlık tepsileri kullanın.
2. Forseps ve tek kullanımlık bir neşter ya da Nekropsi bıçak kullanarak, lenf nodu bir bölümünü kaldırın. Keskin bir bıçak kullanarak, lenf düğümü açmak için sagittal bir kesim yapmak.
3. Lenf düğümünde, hastalıklı hayvanlardan numune özellikle iç incelemek, asimetri için arıyorum, lezyonlar, renk farklılıkları, vb kaydetmek gözlemler.
4. (1. seçenek) Küçük doku bölümleri
   1. Daha az 5 mm kalınlıkta ve her parça bir tüp bir RNA koruma çözümü ile temiz forseps ile transfer her lenf nodu adet tüketim için tek kullanımlık neşter kullanın.
5. (Seçenek 2) Lenf nodu biyopsisi veya kesit metodolojisi
   Not: Biyopsi veya paralel lenf nodu bölümlerine farklı düğümleri ve hayvanlar, uygulandığında parça metodolojileri, toplu RNA analizi için örneklenen doku tutarlılığını sağlar.
   1. Kama kesit yöntemi
      1. Yakalamak için sagittal bölüm inceledikten sonra hücreler lenf nodu profil boyunca lenf düğümü, dış kapsül Merkezi'nden gelen bir turta şekilli kama tüketim. İçin bir düğüm 2 cm genişliğinde (Standart ölçü; bkz: Tablo 1), bir kama kesmek için dış yay uzunluğu 4 mm boyundadır merkezi ve 5 mm kalınlıkta ıslak bir ağırlığı olacak ~ 100 mg.
      2. Neşteri kullanarak, kama küçük parçalar, 5 mm ve yaklaşık 50-100 mg her ıslak mendil kilo daha daha kalın kesilmiş.
         Not: tutarlılık sağlamak için bir toplu iş veya ayrı tüpler lenf nodu ilgi bir temsilcisi RNA profilden sağlamak için havuzu RNA ardından tek bir lenf düğümü tüm kama parçalarıyla işlemek.
      3. Doku parçaları forseps ile doku hacmi ile karşılaştırıldığında RNA koruma çözümünün en az 10 birimlerini içeren tüpler içine koyun.
   2. Punch Biyopsi yöntemi
      1. Eğer amaç düğümden belirli köklerinin gibi belirli bölümlerini toplamak için punch biyopsi aracını seçin. Koleksiyon için istenen örnek boyutu ile tutarlı bir araç seçin. Punch Biyopsi araçları 1-8 mm çapında boyutlarda bir dizi kullanılabilir.
      2. Görsel olarak ilgi örnek için bölgelerinde lenf düğümü bulun.
      3. Tuşuna basarak ve aracı çekirdek oluşturmak için doku dönüm faiz, bölümlerini tüketim için punch biyopsi aracını kullanın. Doku parça RNA koruma çözümünün en az 10 birimlerini içeren bir tüp forseps ile aktarın. 5 mm daha kalın ise bir neşter ve forseps daha fazla doku daha küçük parçalara bölmek için kullanın.
6. Örnekleri koruma çözümü için transfer edilmiş bir kez (Örn., RNALater), onları geri oda sıcaklığında laboratuvar için taşıma.
7. 4 ° C'de doku penetrasyon için izin vermek için bir gecede örnekleri saklayın.
8. Ertesi gün, aşırı RNA koruyucu solüsyonu dökün ve doku örnekleri-80 ° C'de depolayın Örnekleri dondurma daha önce mümkün olduğu kadar koruyucu kaldırın. P1000 ve/veya P200 micropipette ipucu etkili bir RNA koruyucu çözüm kaldırma için kullanın.
   Dikkat: çıkarmak koruma çözümü uygun şekilde, koruyucu çözüm olarak belirtilen güvenlik bilgi formu üzerinde kimyasal ve çevresel tehlikeleri yanı sıra kullanılan patojen infektif özelliklerini temel atma.
   Not: Tablo reçetesiaçıklanan RNA koruma çözümü için burada sağlanan yönergeler sağlanır. Eğer alternatif koruma çözümleri kullanarak üreticinin yönergelere başvurun.

4. RNA lenf düğümlerinden işleme

Dikkat: bir önlük, eldiven ve işlem adımları için uygun göz koruma giymek.

Not: burada kullanılan fenol-esaslı reaktif Malzemeler tablo anlatılan (ve protokol üzerinde üreticinin yönergeleri dayalı)²⁰. Alternatif fenol tabanlı reaktifler kullanımı belirli ürün satın almak için üreticinin önerilerini temel yordamı, bir değişiklik gerekli.

1. Örnekleri, ön aliquot soğutulmuş (4 ° C) fenol-esaslı reaktif homojenizasyon tüpler (1,5 mL/tüp), için erişim önce bir pipet kullanarak.
   Dikkat: Fenol toksik, aşındırıcı ve bir sağlık tehlikesi var. Kloroform toksik ve bir sağlık tehlikesi var. İşlem adımları 4.1-4,9 kimyasal duman başlıklı tamamlamak ve kimyasallar ile herhangi bir temas önlemek için eldiven giymek. Amerika Birleşik Devletleri'nde, kloroform tehlikeli atık olduğunu; tehlikeli atık yerel ve kurumsal esaslarına göre içeren tüpler atmayın. Karşılık gelen BSL-2, BSL-3 veya BSL-4 yönergeleri altında patojenler ile enfekte hayvan işlemi doku örnekleri.
2. Hemen bir örnek microcentrifuge tüpler temiz forseps ile gevşetti sonra yaklaşık 50-100 mg korunmuş doku fenol-esaslı reaktif içeren homojenizasyon tüp aktarın.
   1. Fenol-esaslı reaktif için ek Önce çözdürme sınırlayın. Birden çok örnekleri işleme için dondurucu kaldırılır depolama kuru buza kullanın.
3. Sıkıca tüp kap, homogenizer yerleştirin ve fenol-esaslı reaktif bir rotor-stator doku homogenizer ile örnek homojenize. Oda sıcaklığında işlemeyi tamamlamak. Ne zaman tam bir bulutlu görünüm örnek başarıyla homojenize emin olmak kontrol edin; doku bulutlu bir süspansiyon dağınık.
   Not: 2 dk RNA ayıklama ayar kullanılır (önceden ayarlanmış RNA_02_1 ayarı homogenizer için Malzemeler tabloaçıklanan; dondurulmuş dokular için tasarlanmış). Bu protokol için belirtilen rotor-stator (bakınız Tablo reçetesi) büyük dişli ve doku türleri, lifli malzeme dahil olmak üzere bir dizi homojenizasyon için uyarlanmıştır. RNA_02_01 ayar özellikle dondurulmuş (taze aksine) için tasarlanmıştır dokular. Lenf düğümleri fibröz bağ dokusu bileşenleri gibi benzer şekilde en iyi duruma getirilmiş rotor-stator homogenizer etkili bir ayrılma elde etmek için tavsiye edilir. Çevre Sağlık Bilimler Ulusal Enstitüsü²¹ homojenizasyon önerileri hakkında daha fazla bilgi için bkz.
   1. Büyük boyutta doku homojenizasyon sonra kalırsa, homojenizasyon yordamı yineleyin. RNA verimli bir şekilde kurtarmak için doku de ayrışmış olmalı.
   2. Daha lifli lenf nodu adet lenf nodu parça ön homojenizasyon tüp transferi önce birkaç küçük parça halinde doğrayın için forseps ve makas kullanın. Giriş bölümünde açıklandığı gibi büyük hayvanlar lenf nodu dokulardan daha lifli olabilir.
      Not: Ana bilgisayar ve patojen RNA çift bir analiz isteniyorsa, (örneğin, boncuk homojenizasyon) ek tedavi bakteriyel RNA, kurtarma için özellikle gram-pozitif patojenler ve dokularda varsa gerekli olabilir.
4. Hemen homojenize örnek tüpler kaldırın ve RNase free microcentrifuge (boyutu 2.0 mL) ile tüplerin P1000 micropipette aktarmak.
5. Örnek için 12.000 x g 4 ° C'de herhangi bir örnek enkaz kaldırmak için de 5 dk santrifüj kapasitesi. P1000 micropipette ucu kullanarak, süpernatant Pelet geride bırakarak bir taze microcentrifuge tüp aktarın.
6. Süpernatant oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya. Her örnek iki 1.5 microcentrifuge tüpleri arasında bölünmüş.
7. Kloroform fenol-esaslı reaktif (yani, 1,5 mL örnek için 0.3 mL); 1 mL başına 0.2 mL ekleyin el ile 1-2 dk aşamaları karıştırmak, ama değil girdap örnek tersine çevirin. Oda sıcaklığında 2 min için kuluçkaya.
8. Vasıl 12.000 x g 4 ° C'de 15 dakika santrifüj kapasitesi
9. Üst katman, olur formu Interphase veya kırmızı fenol kloroform katman aksatmadan micropipette bahşiş (P1000 veya P200) ile üst, açık sulu faz dikkatli bir şekilde çıkarın. Yeni bir microcentrifuge tüp aktarın.
10. % 100 etanol eşit bir hacmi ile karıştırın; Tüp 4 - 5 kez ters çevirme tarafından iyice karıştırın. Tüp bulutlu görünmez.
11. Micropipette ucu ile daha fazla arındırmak ve üreticinin yönergeleri²²takip RNA, elute için bir ticari spin silis tabanlı sütun için sıvı transfer. Üretilen RNA elute ~ 50-100 µl RNase free su dokusuna 50 mg.
    Not: fenol-esaslı reaktif ayıklama qRT-PCR ve/veya RNA-sıralama uygulamaları, RNA'ın kullanım aşağı akım için Organik faz DNA kaldırırken RNA örnekleri DNaz ile ek bir tedavi önerilir.
12. Aliquot tüpler kullanılmak üzere herhangi bir donma-çözülme ana RNA örneği azaltmak için bir miktar ve kalite değerlendirme ayırmak için eluted RNA. -80 ° C için depolama tüpler aktarın.
13. Örnek bir alt Biyogüvenlik düzeyi kapsama alanına taşınır düzeyinde özellikle BSL-3 çevreleme, hayvansal patojenler ile enfekte hayvanlardan elde edilen lenf nodu örnekleri durumunda ortaya çıkan RNA örnek patojenlerin devamsızlığın doğrulayın kalitesi analizi, RT-PCR ve/veya RNA-sıralama kitaplığı hazırlık için.
    Not: Yerel düzenlemeler dikkate almak önemlidir ve select ajanlar ile çalışmaları için CDC (hastalık kontrol ve Önleme Merkezleri) inactivation kurallar söz konusu olduğunda, tüm inactivation yordamları araştırmacı yerel sitesinde doğrulamak gereklidir.
    1. 1/10^th hacmi her eluted RNA örnek 4.12. adımdaki (yani, toplam RNA'ın 50 µl üzerinden 5 µl) kaldırın. Steril tekniği kullanarak, örnek 100 µl bakteriyel büyüme suyu bir steril 1.5 mL microcentrifuge tüp ile karıştırın. Steril plastik dağıtıcısı kullanarak, RNA-suyu karışımı bir agar plaka yüzeyi boyunca yayıldı.
       Not: bir suyu türü ve agar plaka ile hangi hayvanlar meydan patojen büyüme ile tutarlı seçin.
    2. Agar plaka ile hangi hayvanlar meydan patojen büyüme için belirli koşullar altında kuluçkaya. Kurtarılan bakteri yokluğu için örnekleri BSL-3 kapsama çıkarmadan önce denetleyin.
       Not: Miktar ve testleri, bütünlüğü, sonra elde edilen eluted RNA, RNA-sıralama ve RT-PCR analiz gibi aşağı akım uygulamalar için uygun.
14. RNA kurtarma ve saflık bir spektrofotometre kullanarak değerlendirmek. RNA kalitesini değerlendirmek için 1-2 µl spektrofotometre bir analiz için eluted RNA örneği yükleyin. Örnek bir spektrumu ultraviyole (UV) aralığında kaydeder.
    1. A₂₆₀/A₂₈₀ oranı, A₂₆₀/A₂₃₀ oranı ve örnek için A₂₆₀ değer UV spektrumu kayıt (A = absorbans).
    2. Olarak tek iplikçikli RNA 40 µg/mL bir konsantrasyon, bir absorbans 1.0 260 nm, RNA konsantrasyonu (µg/mL) A₂₆₀ x 40 arıtılmış örnekleri için çarparak hesaplar.
15. Değerlendirme, RNA bütünlük, hızlı bir yöntem herhangi bir bozulmuş örnekleri daha fazla çözümleme dışı bırakmak için her RNA örneğinin 2 µl 1.5 x formamide yükleme boya [deiyonize % 95'formamide, % 0,025 (w/v) bromophenol mavi, (w/v) % 0,025 ksilen cyanol, 5 mM EDTA (pH 4 µl ile karıştırın 8.0), % 0,025 (w/v) SDS]^23,24microcentrifuge 1,5 mL tüpler.
16. 70 ° c için 1 dk tüpler ısı ve sonra 1 dakika buz tüplere aktarın.
17. Örnek 1'de hazırlanan % 1'özel jel için yük x TBE (RNA için bir yerel özel jel elektroforez tam açıklaması için bkz: Rio, Ares Jr., Hannon ve Nilsen)²⁴. Örnekleri standart jel elektroforez yöntemleri tarafından ayrı ve 28S ve 18S ribozomal RNA bantları varlığını doğrulamak.
18. Temsilcisi sonuçları ve Mueller, O. anlatılan RNA bütünlük tayini [Örneğin, bir Bioanalyzer ve RIN (RNA bütünlük numarası) analiz] için kantitatif analiz yöntemleri ile jel elektroforez kadar izleyin ve ark. ²⁵ ve Schröder, A. vd. ²⁶.

5. alternatif çıkarma yöntemini Formalin-sabit, parafin gömülü (FFPE) doku

Not: FFPE doku koruma en güçlü yöntemi nükleik asit koruma temsil etmiyor olsa da, aşağıda sunulan Protokolü korunmuş diğer dokulara kullanılamaz olduğunda transkripsiyon bazı değişiklikler çalışma için bir yol olabilir.

1. Formalin reaktifler formalin plastik kaplara dağıtımı tarafından doku koruma için hazır olun. Doku 20:1 formalin: doku hacmi/ağırlık, oranında formalin içinde sırasıyla korunmalıdır.
   Dikkat: Formalin bilinen bir insan kanserojen olduğu ve akut toksik olsa da, (genellikle aracılığıyla inhale duman) Kronik pozlama bir önemli sağlık tehlikesi temsil edebilir. Uygun havalandırma ve KKE (yani, nitril eldiven, ilk maruz kaldıktan sonra 15 dk içinde değiştirilecek kullanımı) sağlık riskleri en aza indirmek için gereklidir. OSHA formaldehit standart için başvurun (29 CFR 1910.1048) maruz kalma izleme ve risk değerlendirme hakkında daha fazla bilgi için.
   Not: çok az formalin kullanarak doku tam koruyucu içinde sular altında korunur hale yeteneğini etkileyebilir.
2. Faiz dokusunun yalıtım sonra dikkatle kalınlığı 5 mm'den az doku kırpın.
   1. Forseps kullanarak, dikkatli bir şekilde kesilmiş doku herhangi bir sıçramasına en aza indirmek için formalin daldırın.
      Not: Dokuları tamamen tam bir fiksasyon için izin vermek için formalin içinde ve sular altında. Bu yüzeylerin dokusunun tamamen formalin ile kaplıdır önemlidir.
3. Bir kez formalin içinde belgili tanımlık doku sular altında en az 24 saat oda sıcaklığında doku fiksasyon için bekleyin.
   Not: Formalin dokularda yavaş, tüm yüzeyler^27,28üzerinden saatte 1 mm oranında nüfuz eder. Bu nedenle, doku bölümleri kalınlığı tüm doku bir hızlı fiksasyonu için daha 5 mm sonuçlar daha az tutmak.
4. Fiksasyon sonra parafin katıştırma için uygun bir reaktif dokuların aktarın.
   Not: Örneğin, bu el yazması muayene doku gömme önce % 70 etanol transfer edildi.
5. Dokular parafin embed. ²⁹
6. 10-80 µm için doku kalınlığı (miRNA ayıklanmasını isterseniz kullanımı 10-20 µm) bölüm²⁹.
7. Neşter ve forseps kullanarak bir 40 mg doku parça işleme ve steril, nükleaz ücretsiz microfuge tüp içine yerleştirmek için her örnek kaldırın.
8. Ticari bir kit RNA korunmuş örneklerinden ayıklamak için deparaffinization ve FFPE doku örnekleri nükleik asit kurtarılması için tasarlanmış kullanır.
   Not: Malzeme tablo başvurulan kiti ksilen kullanır ve parafin, proteaz tedavi adım ve RNA arındırmak için Cam elyaflı filtre kaldırmak için etanol yıkar.

Sonuçlar

(Adım 1-4 iletişim kuralı) Bu makalede sunulan konuları kullanımı bir aşağı akım Analizi ana bilgisayar gen ifade çalışmalar için uygundur RNA kurtarılması büyük hayvan örneklerinden yardımcı olacak. RNA kalitesi aşağı akım uygulamaları için birden fazla standart önlemlerle değerlendirilir. Spectrophotometry, protein kontaminasyonu ölçüsü A₂₆₀/A₂₈₀ oranı sağlar ve A₂₆₀/A₂₃₀ oranı fenol gibi kimyasal kirleticiler algılar saflık değerlendirmenin başka bir yol sağlar. Her durumda,...

Tartışma

Transcriptomic çalışmaları ve ilgili protokolleri çoğunluğu fare, sıçan veya öldükten sonra insan örnekleri üzerinde odaklanın. Ancak, Hayvancılık ve yaban hayatının araştırmalarda çok çeşitli insan halk sağlığı için hastalık, hem veteriner ilaçları ve hayvansal hastalıklar açısından uygulanabilir olarak bağışıklık yanıtı karakterizasyonu için fırsatlar sağlar. Bu iletişim kuralı bir taslağını dokuları yüksek bütünlük RNA çıkarılması için kritik noktalar sığır, Bizon, keçi ve koyun gibi büyük hayvanlar üzerinden sağlanan...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
RNA koruma solüsyonu (tüm deneyler için RNALater kullandık)	ThermoFisher	AM7020
1.5 ml veya 2 ml polipropilen mikrosantrifüj tüpleri	Fisher Scientific	05-408-129
Tek kullanımlık neşterler	Daigger Scientific	EF7281
Doku forsepsleri, sıçan dişi	Fisher Scientific	12-460-117	Kavisli uç, konik kenar vb. dahil olmak üzere diğer doku forsepsleri mevcuttur, kullanıcı tercihine bağlıdır
3 mm punch biyopsi iğneleri	Fisher Scientific	NC9949469
Kesici alet kabı (küçük ve nekropsi için taşınabilir)	Stericycle	8900SA	1 qt. burada gösterilen boyut
Kesme tahtaları veya tek kullanımlık tepsiler	Fisher Scientific	09-002-24A	Çeşitli boyutlarda mevcuttur, kullanıcı tercihine bağlıdır
Kişisel koruyucu ekipman			Patojene göre değişir (eldivenler, solunum maskeleri, gözlükler vb.)
Fenol bazlı RNA ekstraksiyon reaktifi (tüm deneyler için TRIzol Reaktifi kullandık)	ThermoFisher	15596026
Silika sütunu bazlı RNA ekstraksiyon kiti (tüm deneyler için PureLink RNA Mini kitini kullandık)	ThermoFisher	12183018A	100 mg'a kadar doku için tasarlanmıştır
%100 Etanol (moleküler biyoloji için 200 kanıt)	Sigma-Aldrich	E7023
Kapalı homojenizasyon tüplü doku homojenizatörü (tüm deneyler için gentleMACS ayrıştırıcıyı kullandık)	Miltenyi Biotec	130-093-235
Agarose (Genel, jel elektroforezi için)	Sigma-Aldrich	A9539
1X TBE	Fisher Scientific	BP24301	Laboratuvarda sıfırdan da yapılabilir
Deiyonize formamid	EMD Millipore	S4117
Sodyum dodesil sülfat	Sigma-Aldrich	L3771
Bromofenol mavisi	Sigma-Aldrich	114391
Ksilen siyanol	Sigma-Aldrich	X4126
EDTA (Etilendiamintetraasetik asit)	Sigma-Aldrich	EDS
UV-Vis Spektrofotometresi (NanoDrop Spektrofotometresini kullandık)	ThermoFisher	ND-2000
Cihazı (ilişkili bileşenler ve protokollerle birlikte Biyoanalizörü kullandık)	Agilent	G2939BA
FFPE RNA ekstraksiyon kiti (Formalin Sabit, Parafine Gömülü Doku için RecoverAll Toplam Nükleik Asit İzolasyon Kitini kullandık)	ThermoFisher	AM1975
Plastik yayıcı (L-şekilli yayıcı)	Fisher Scientific	14-665-231	Yalnızca enfekte hayvanlardan alınan numuneler için sterilite testi için gereklidir
Nekropsi bıçakları	Hayvancılık Kavramları	WI-0009209