Tükürük bezi hypofunction otoimmün hastalığı ve radyasyon terapisi sık bir sonucudur. Bu hastalıkların fare modellerinde Tükürük bezi ile tekrarlanabilir değerlendirilmesi teknik bir sorundur. Burada, tükürük üretim farelerde doğru ve tekrarlanabilir ölçüm için basit bir yöntem açıklanmıştır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Tükürük bezi işlevi farelerde ölçülmesi için bir yöntem
Bu makalede
Özet
Özet
Sjoegren Sendromu, ekzokrin bezleri etkileyen otoimmün bir hastalığı olan hastalarda Tükürük bezi iltihabı geliştirmek ve tükürük üretimi azalttı. Benzer şekilde, tükürük üretim ciddi baş ve boyun kanserlerinin için radyasyon tedavisi alan hastalarda güvenilir değil. Kemirgen modelleri, bu klinik durumlar ve taklit etmek için geliştirilen hastalık patogenezinde anlamayı kolaylaştırmak ve yeni tedavi stratejilerinin geliştirilmesi için izin verir. Bu nedenle, doğru tekrarlanarak ve art arda Tükürük bezi işlevi hayvan modellerinde ölçmek için kritik yeteneğidir. Literatürde daha önce açıklanan yordamları hakkında oluşturmak, bu kriterleri karşılayan ve tükürük bezi işlevi farelerde değerlendirmek için kullanılan bir yöntem geliştirilmiştir. Ek bir avantaj bu yeni yöntemin bu kolayca hakim ve küçük arası operatör varyasyon vardır olduğunu. Tükürük bezi işlevi miktar (ağırlık veya hacim) veya tükürük Pilokarpin stimülasyon üretti oranını (mL/dk) olarak değerlendirilir. Toplanan tükürük analizleri protein içeriği, immünglobulin konsantrasyonları ve diğer biomolecules için iyi bir kaynaktır.
Giriş
Tükürük bezlerinin tükürük yanıt olarak nörolojik ve mekanik uyaranlara1çeşitli üretmek. Uyaranlara için bezi adrenergic ve kolinerjik reseptörler sempatik ve parasempatik sinir sistemi aracılığıyla taşınır. Pilokarpin muscarinic reseptörleri üzerinde ağırlıklı olarak davranır kolinerjik, para sempatomimetik bir ajandır. Tükürük bezi bu muscarinic asetilkolin reseptörü M31üzerinde hareket ederek tükürük üretimini neden olmaktadır. Tükürük üretim Pilokarpin yönetim takip tükürük bezleri uyarmaya tepki yeteneğini bir göstergesidir ve tükürük bezi işlevi bir ölçüsü olarak yaygın olarak kullanılır.
Tükürük üretim doğru ölçüm Tükürük bezi hastalıkları Sjoegren Sendromu2 ve baş ve boyun kanser tedavi3takip radyasyon hasarı da dahil olmak üzere çalışma odasında önemlidir. Tükürük üretim Rodents ölçmek için birkaç farklı yöntem geliştirilmiştir. Bunlar doğrudan cannulation boşaltım tükürük kanal4, tükürük ağız boşluğu altında vakum5üzerinden topluluğu ve cam kılcal6 veya bir micropipette7,8, kullanarak toplama içerir 9. cannulation tükürük kanalının en doğru ve saf tükürük sağlar doğrudan. Ancak, bu teknik olarak zor bir işlemdir ve tekrarlayan tükürük koleksiyonları aynı hayvan duktal yaralanma neden için potansiyel engellemektedir. Vakum altında tükürük toplama tükürük tüp kurutma nedeniyle değişken sonuçları yol açabilir. Bu kaybı daha da indirimli salya ile farelerde abartılı olduğunu. Cam kılcal damarlar koleksiyonunu tükürük daha sonraki analizler için izin verir, ancak, viskozite hastalıklı durumda salgılanan tükürük değişimler kılcal verimli dolgu engeller. Ayrıca, artık tükürük toplamak için ağız boşluğu süpürme girişimlerini yaralanmalara yol açabilir. Damlalıklı yöntemi için tam toplama sağlar ve aynı işleci için deneyler arasında son derece tutarlı. Ancak, bilinmeyen nedenlerden dolayı bu yöntem farklı operatörler arasında önemli değişimleri gösterir. Bu nedenle, uygun karşılaştırma izin vermek için bu aynı işleç belirli bir projeyle ilgili tüm deneylerin gerçekleştirir şart olur. Açıkçası, bu bir laboratuvar için büyük bir dezavantaj temsil eder.
Bu sorunları aşmak için bir yordam birleştiren tükürük toplama yöntemleri insanlar ve kemirgen için kullanılan geliştirilmiştir. Tükürük Pilokarpin kaynaklı cilt ölçmek için aşağıda açıklanan çubukla yöntemi, operatör tarafından akıttıkları basit, tekrarlanabilir ve tekrar tekrar aynı hayvan gerçekleştirilebilir. Ayrıca, proteinler, immünglobulin veya diğer biomolecules daha sonraki analizler için tükürük toplama sağlar.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Aşağıda açıklanan protokol kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi tarafından kabul edildi ve ulusal sağlık Enstitüleri tarafından kurulan etik kuralları izler. Bu raporda sunulan tüm veri 10-12 hafta-in yaş vardı kadın fare kullanarak oluşturulan. Fareler aşağıdaki suşları kullanılmıştır: C57BL/6, BALB/c, DBA1, 129S ve (B6XA/J) F1. Bütün fareler bariyer kafeslerde (kafes başına 5 hayvanlar) patojen-Alerjik spesifik koşullar içerisinde yer alan ve yem ve su ad libitum sağlanan.
1. hazırlık
- Pilokarpin hidroklorür stok çözeltisi hazırlamak için bahçedeki 10 mg tartmak ve 1.776 mL steril izotonik salin 5.63 mg/mL stok çözeltisi vermek vortexing tarafından çözülür. Bu çözüm sterilize etmek için gerek yoktur. Ancak istenirse, 0.2 µM filtreden filtre. Bu hisse senedi çözüm birden çok aliquots bir-80 oC dondurucuda 3 aya kadar saklayın. Donmuş her hissenin tek kullanıma yöneliktir. Bir kez çözdürülen Pilokarpin çözüm refreeze değil.
- Microfuge tüpler 0.6 mL al ve dikkatlice ısıtmalı bir 18'lik iğne ile her tüpün dibinde küçük bir delik yumruk. Bu tüpler 2 mL tüpler içine ayarlayın. Tüpler steril olması gerekmez.
- Keskin, steril jilet kullanarak, silindirik emici bezlerden yaklaşık 2 cm uzunluğunda parçalara kesilmiş. Çapraz olarak 2 konik şekilli temizleme bezi vermek için her 2 cm parça kesti. Bir çubukla her 0.6 mL microfuge tüpler içinde yerleştirin.
- Kuru Pamuklu çubuk içeren 0.6 mL microfuge tüp tartın.
- Fareler belirlenmesi için su şişeleri ile yeni bir temiz kafes içine aktarın. Toplanan tükürük kirletici gıda parçacıkları önlemek için tükürük toplama başlamadan önce fareler yemeden en az 2 h tutun.
Not: Bu yordam için kafes başına 1 fare tutmak gerekli değildir. Ancak, belirli kurum ve kuralları hayvan kullanmak için fare her kafese yerleştirilen sayısını bağlıdır. - 2 h sonundan önce çalışan Pilokarpin çözüm (0.0563 mg/mL) steril serum fizyolojik içinde hisse senedi çözüm 100 x sulandrarak hazırlayın. Daha fazla filtre uygulamak için gerekli değildir bu çözüm sterilize. Her zaman çalışan Pilokarpin çözüm buz üzerinde tutun.
Not: Tablo 1 fare vücut ağırlıkları son doz 0.375 mg/kg vücut ağırlığı vermek için bir dizi için enjekte edilir Pilokarpin miktarını verir.
2. yordam
- Her fare tartmak ve anestezik karıştırmak için her fare kullanarak Tablo 1doz belirlemek. Birinci fare mayi yoldan anestezik mix uygun hacmi ile enjekte et. 2 (Bu protokol için test çoğu fare suşları tarafından 2 dk uyu) dk. fırının saatini kurdu. Fare düzgün olmaması düz bir yüzeye yerleştirildiğinde yürüme anestezi emin olun. Fare hala yürüyor, bir sonraki adıma devam etmeden önce ek 2 dk bekleyin. Bir damla yağ oftalmik merhem kurutma önlemek için her iki gözde uygulama.
Not: Tablo 1' de, anestezik mix doz 0,007 mL/gr vücut ağırlığında olduğunu. Bu yordam için optimum menzili 0.006 0.008 mL/g vücut ağırlığı var. Ancak, sonra 4 fare hala yürüme ya sarsıntılı hareketler sergileyen min, konsültasyon ile uygun anesteziyle dozunun artırılması için kurumsal hayvan hastalıklarıyla ilgili. - Tablo 1 kullanarak fare Pilokarpin doz belirlemek ve mayi yoldan uygun miktarda enjekte. 2 min için zamanlayıcı ayarlamak ve baş ve kulaklar kesim sonunda dışarı sopa kadar fareyi 50 mL restrainer tüp içine sokun. Tüp ile baş aşağı, 45 derecelik bir açıyla ve ventral yüzeyde yukarı bakacak şekilde yerleştirin. Yordamı kurulu hareket etmesini engellemek için tüp teyp.
Not: Bu yordam 17 g ağırlığında fareler üzerinde çalışılmıştır değil gibi Tablo 1 doz 17 g, daha fareler için sağlar. - 2 dk sonunda, yavaşça ağzına forseps dissekan mikro kapalı bir çift eklemek ve yukarı doğru ağız açmak için alt çene kaldırın. Forseps 1-2 mm daha fazla dil forseps üst kol dinlenme görülür emin ağız, içine itin. Bir çift daha iyi Forseps ile önceden ağırlığını kuru bez konik ucu yakın tutun.
- Yavaşça çubukla konik ucunu ağzına kaydırın. Forseps ağız boşluğunda Pamuklu çubuk ucu bırakarak geri alıyorum.
- Daha geniş ağız dışında uzanan çubukla sonuna kavramak ve maksimum alan kişinin ağzı ile izin vermek için döndürün. Pamuklu çubuk 15 dakika bu pozisyonda tutun.
Not: Bu çubukla koleksiyon süresince ağızda kalmasını sağlar. Pamuklu çubuk konik ucunu bir fitil ve pamuklu çubuk daha geniş kısmı gibi davranan Not ağız dışında kalır. - 15 dk sonunda, nazikçe değil absorbe olmuştur herhangi bir tükürük toplamak için çubukla döndürmek ve ıslak bez 0.6 mL microfuge tüpte yerleştirin. Tüp kapatın ve buz üzerinde yerleştirilen 2 mL tüp içinde ayarlayın.
Not: şu anda, oral mukoza tamamen kuru görünür. Fare şimdi geri onun kafes anestezi kurtarma için taşınabilir. - Fare içinde belgili tanımlık kafes aktarın. Yer içinde belgili tanımlık kafes gıda granül daha hızlı rehidrasyon yardımcı olmak için tükürük toplandıktan sonra nemlendirilmiş.
Not: Fareler içinde 10 dk sonra sonuna uyan. 0.2 mL Önceden ısıtılmış izotonik salin Subkutan Enjeksiyon kurtarma hızlandırmak için verilebilir. - Sonraki fare için devam edin. Tüm onlar tamamen iyileşti kadar fareyi takip edilmelidir ve Ambulatuvar vardır.
3. ölçümleri
- Tüm koleksiyonlar sonunda 0.6 mL tüpler ıslak bez ile tartın. Islak ağırlık ve üretilen tükürük kilo almak için Kuru ağırlık farkı hesaplar. Tükürük ile 0.6 mL tüp 2 mL tüp içine yerleştirin.
- 2 ml tüpler kapaklar kapalı kesti. Sonra 2 mL tüpler için tükürük kurtarmak için mikro santrifüj 4oC'de 7500 x g, 2 dk santrifüj kapasitesi. Bir micropipette kullanılarak elde tükürük hacmi ölçmek.
- Tükürük ağırlığı (mg)10 15 dk ya da tükürük ağırlığı (mg) oranında olarak sonuçları hızlı / vücut ağırlığı (g) fare.
Not: ölçülen çubukla dışına çıkarılan tükürük hacmi Eğer sonuçları tükürük (mL) kurtarılan birim veya tükürük hacmi (mL) oranı ifade / fare vücut ağırlığı (g).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Deneysel fare modeli sistemlerinde yeteneği tükürük Pilokarpin stimülasyon yanıt üretmek için Tükürük bezi işlevi bir göstergesi olarak kullanılır. Tükürük üretim 11-hafta-yaşlı C57BL/6 dişi farelerde çubukla yöntemi tarafından ölçüldü. Şekil 1A', sonuçları tükürük (mg) artan doz Pilokarpin takip toplanan tutar ifade edilir. Doz 1 mg/kg vücut ağırlığı bazı fareler (istemsiz sallayarak ve titreyerek) sıkıntı sergilenmesi başladı. Bu nedenle daha yüksek doz Pil...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Tükürük üretim karmaşık bir süreçtir ve birçok faktör tarafından etkilenir. Bu nedenle, Tükürük bezi işlevi laboratuvar hayvanlarda ölçme bir meydan okuma olabilir. Tükürük bezi fonksiyonunu kullanabilirsiniz aynı hayvan tekrarlanan ölçüler hastalığın başlangıcı kurmak için veya tedavi aşağıdaki kurtarma göstermek için gerekli olan bir ek mücadeledir.
Bu raporda açıklanan çubukla yöntem teknik olarak verileri göstermek için birden çok seçenek ile gerçekleştirmek basittir. Elde edilen sonuçlar ...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar hiçbir ifşa etmek çıkar çatışması var.
Teşekkürler
Çalışma Ulusal Sağlık enstitüleri, Ulusal Enstitüsü diş ve Fasiyal araştırma (DE025030) bir hibe tarafından desteklenmiştir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Tükürük toplama kimyasalları< / güçlü > | |||
| Pilokarpin hidroklorür | Alfa Aesar, Tewksbury, MA, ABD | B21410 | Steril izotonik salin içinde seyreltin. 100X stokun tek kullanımlık alikotlarını -80oC |
| Name< | strong>Company | >Katalog Numarası | Comments |
| Anestezi Karışımı solüsyonu | Steril bir şişede 1 mL ketamin hidroklorür + 0.5 mL ksilazin + 8.5 mL steril izotonik salin karıştırın. 3 ay boyunca kullanılabilir. | ||
| Zetamin (Ketamin hidroklorür) | Vet One, Boise, Idaho, ABD | C3N VT1 | Stok 100 mg/mL'dir |
| Anased (Xylazine) | Med-Vet International, Mettawa, IL, ABD | RXANASED-20 | Stok 20 mg / mL |
| İzotonik steril salin | Vet One, Boise, Idaho, ABD | 501032 | Seyreltici olarak kullanılır |
| Suni gözyaşı (kayganlaştırıcı oftalmik merhem) | Henry Schien, Dublin, OH, ABD | 48272 | İşlem sırasında gözlerin kurumasını önlemek için kullanılır |
| Name< / strong> | Company< / strong> | Katalog Numarası< / strong> | Comments< / strong> |
| Tükürük toplama malzemeleri< / strong> | |||
| SalivaBio Çocuk sürüntüsü | Salimetrics, LLC Carlsbad, CA, ABD | N/A | Ayrı ayrı sarılmış swablar |
| 50 mL polipropilen tüpler | VWR, Radnor, PA, ABD | 89004-364 | Tüpün alt 1 cm'sini kesin. Kesilen kenarın pürüzsüz olduğundan emin olun. |
| Mikrosantrifüj tüpleri 0.6 mL | VWR, Radnor, PA, ABD | 87003-290 | Isıtılmış 18 gauge iğnelerle tüpün dibinde delikler açın |
| Mikrosantrifüj tüpleri 2 mL | VWR, Radnor, PA, ABD | 87003-298 | |
| Kalıcı olarak takılmış iğneli İnsülin Şırıngaları | Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, ABD | 324702 | |
| 18 gauge düzenli konik iğneler | Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, ABD | 305195 | |
| Steril neşter bıçağı #11 | Integra York Inc PA, ABD | 4-311 | |
| Mikrodiseksiyon forseps | Roboz, Gaithersburg, MD, ABD | RS-5139 | Tırtıklı açısal 0,8 mm uç, 4" uzunluk |
| Etiket bandı | Santa Cruz Biyoteknoloji, Dallas, TX, ABD | SC-224487 | |
| 3 kanallı zamanlayıcı | Amazon.com, Seattle, WA, ABD | B06W2KCYVN | |
| Analitik Terazi | Mettler Toledo, Columbus OH, ABD | ||
| strong>Name | >Company | Katalog Numarası | Comments |
| >Tükürük disfonksiyonunu indüklemek için kimyasallar / reaktifler< / güçlü> | |||
| LPS | Invivogen, San Deigo, CA, ABD | tlrl-b5lps | Endotoksin içermeyen suda çözün ve stok çözeltisini 5 mg / mL'de saklayın. steril HBSS 100 ug / mL içinde seyreltin - 100 uL / moue ip enjekte edin |
| Imject Şap adjuvanı | Thermo Scientific | 77161 | Steril tuzlu su içinde 1: 1 oranında seyreltin. İntraperitoral olarak 0.1 mL / fare enjekte edin |
| Tavşan anti-Ro52 antiserumu | Laboratuvarda | Rekombinant fare Ro52 ile tavşanların aşılanması | |
| Name< / strong> | Company< / strong> | Katalog Numarası< / strong> | Yorumlar< / strong |
| >Kimyasallar / Tükürük analizleri için kitler< / strong> | |||
| Tükürük lizozim tahmini< / güçlü > | |||
| EnzChek Lizozim Test Kiti | Moleküler Problar, Eugene, OR, ABD | E-22013 | Üreticinin talimatlarına göre kullanılır |
| Name< / strong>< | strong>Company< / strong> | Katalog Numarası< / strong> | Comments< / strong> |
| Tükürük IgA tahmini ELISA | |||
| Mouse IgA Southern | Biotech, Birmingham, AL, ABD | 0106-01 | Sandviç için standartlar ELISA - aralık 30 ng/mL ila 0,5 ng/mL |
| Keçi anti-fare IgA etiketsiz | Southern Biotech, Birmingham, AL, ABD | 1040-01 | Bikarbonat tamponunda 1 ug / mL'de kaplayın |
| Keçi anti-fare IgA HRP | Southern Biotech, Birmingham, AL, ABD | 1040-05 | 1:4000 seyreltme |
| TMB substratında | Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, ABD | 555214 | Üreticinin talimatlarına göre kullanılır |
| Immulon 4HBX Microtiter 96 kuyulu plakalar | Thermo Scientific, Rochester, NY, ABD | 3855 | |
| Name< | strong>Company | Katalog Numarası | Comments |
| Tükürük proteini tahmini | |||
| Bio-Rad Protein Tahlili Boya Reaktif Konsantresi | BioRad, Herkül, CA, ABD | 5000006 | Üreticinin talimatlarına göre protein tahmini için |
Kaynaklar
- Proctor, G. B. The physiology of salivary secretion. Periodontol 2000. 70 (1), 11-25 (2016).
- Fox, R. I. Sjögren's syndrome. Lancet. 366 (9482), 321-331 (2005).
- Eisbruch, A., Kim, H. M., Terrell, J. E., Marsh, L. H., Dawson, L. A., Ship, J. A. Xerostomia and its predictors following parotid-sparing irradiation of head-and-neck cancer. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 50 (3), 695-704 (2001).
- Marmary, Y., Fox, P. C., Baum, B. J. Fluid secretion rates from mouse and rat parotid glands are markedly different following pilocarpine stimulation. Comp Biochem Physiol A Comp Physiol. 88 (2), 307-310 (1987).
- Lin, A. L., Johnson, D. A., Wu, Y., Wong, G., Ebersole, J. L., Yeh, C. K. Measuring short-term gamma-irradiation effects on mouse salivary gland function using a new saliva collection device. Arch Oral Biol. 46 (11), 1085-1089 (2001).
- Scofield, R. H., Asfa, S., Obeso, D., Jonsson, R., Kurien, B. T. Immunization with short peptides from the 60-kDa Ro antigen recapitulates the serological and pathological findings as well as the salivary gland dysfunction of Sjogren's syndrome. J Immunol. 175 (12), 8409-8414 (2005).
- Deshmukh, U. S., Nandula, S. R., Thimmalapura, P. R., Scindia, Y. M., Bagavant, H. Activation of innate immune responses through Toll-like receptor 3 causes a rapid loss of salivary gland function. J Oral Pathol Med. 38 (1), 42-47 (2009).
- Deshmukh, U. S., Ohyama, Y., Bagavant, H., Guo, X., Gaskin, F., Fu, S. M. Inflammatory stimuli accelerate Sjögren's syndrome-like disease in (NZB x NZW)F1 mice. Arthritis Rheum. 58 (5), 1318-1323 (2008).
- Szczerba, B. M., et al. Interaction between innate immunity and Ro52-induced antibody causes Sjögren's syndrome-like disorder in mice. Ann Rheum Dis. 75 (3), 617-622 (2016).
- Takakura, A., Moreira, T., Laitano, S., De Luca Júnior, L., Renzi, A., Menani, J. Central muscarinic receptors signal pilocarpine-induced salivation. J Dent Res. 82 (12), 993-997 (2003).
- Yao, C., et al. Lipopolysaccharide-induced elevation and secretion of interleukin-1beta in the submandibular gland of male mice. Immunology. 116 (2), 213-222 (2005).
- Knudsen, J., Nauntofte, B., Josipovic, M., Engelholm, S. A., Hyldegaard, O. Effects of isoflurane anesthesia and pilocarpine on rat parotid saliva flow. Radiat Res. 176 (1), 84-88 (2011).
- Kohrs, R., Durieux, M. E. Ketamine: teaching an old drug new tricks. Anesth Analg. 87 (5), 1186-1193 (1998).
- Cold Spring Harbor Protocols. Cold Spring Harb Protoc. , Available from: http://cshprotocols.cshlp.org/ (2006).
- Kozaki, T., Hashiguchi, N., Kaji, Y., Yasukouchi, A., Tochihara, Y. Effects of saliva collection using cotton swab on cortisol enzyme immunoassay. Eur J Appl Physiol. 107 (6), 743-746 (2009).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
