Yenidoğan fare beyin Striatal hücrelerdeki genetik manipülasyon için stereotaksik cerrahi

Modern çalışmalar yapısı ve beyin fonksiyonu genellikle belirli genler nöronal hücrelerdeki genetik manipülasyon gerektirir. Farklı genler, transgenik fareler de dahil olmak üzere mutant gen taşıyan fonksiyonlar soruşturma için nakavt ve çakma allelleri düzenli olarak yeniden üretilmedi. Stereotaksik beyin ameliyatı yetişkin kemirgen için yerel olarak uyuşturucu, virüsler, izleyiciler ve diğer kimyasalları kemirgen beyin^1,2özel bölgeler için teslim etmek için standart bir yöntemdir. Stereotaksik beyin ameliyatı transgenik fareler için uygulama bir genetik olarak gen fonksiyon ve fare beynin belirli nöron popülasyonları nöronal aktivite işlemek için izin verir. Hücre türüne özgü işleme karmaşık sinir devreleri beyin^3,4,5nöronal işlevlerinde deşifre etmek için güçlü bir yaklaşım sağlar.

Sinir sisteminin sinirsel gelişme aşamalarında erken embriyonik başlar ve gelişim süreçleri Juvenil dönemine kadar doğumdan sonra devam edin. Postnatal olgunlaşma sinir sistemi beyin⁶fizyolojik ve bilişsel işlevler için temel sinir devreleri, hassas sinaptik kablolama içerir. Bu nedenle, yenidoğan zaman pencerelerde oluşan gelişimsel olaylarını eğitim sadece normal sinirsel gelişim anlamak için önemlidir, ancak de nörogelişimsel ve Nöropsikiyatrik bozukluklar^{7 patogenezinde anlayışlar sağlayabilir ,8}. Stereotaksik beyin ameliyatı yöntemleri yetişkin kemirgen için hazır^2,9, olmasına rağmen birkaç protokolleri stereotaksik beyin ameliyatı yenidoğan fareler^10,11' deki yönergeleri için Internet üzerinde kullanılabilir. Yenidoğan yavru Başkanı standart stereotaksik aparatı düzeltilmesi için çok kırılgan olduğu için aslında, reaktifler stereotaksik microinjections yenidoğan fare pups beyinlerinin içine, zordur. Yine de, stereotaksik beyin ameliyatı uygulamaya transgenik farelerde neonatal fareler¹²için mümkün olabilir. Burada, yeni doğmuş fare pups içinde stereotaksik beyin ameliyatı gerçekleştirmek için ev yapımı bir kurulum ile basit bir yöntem açıklanmaktadır. Bu teknik bir muhabir gen fareler ve koşullu olarak floxed transgenik fareler striatum AAV ifade Cre DNA recombinase microinjecting tarafından floxed genler koşullu olarak silmek izin verdiğini göstermektedir. Bu teknik aynı zamanda reaktifler vahşi tipi farelerin striatum yenidoğan sunmak için geçerlidir.

Burada anlatılan hayvan iletişim kuralları hayvan bakımı ve kullanımı komiteler Ulusal Yang Ming Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.

1. hazırlanması sahibi için yenidoğan Pups içinde stereotaksik aparatı

1. Baş tepsi olun: 1/5 Tüp duvarı kaldırarak yenidoğan pups Başkanı uygun şekil 1.5 mL santrifüj tüpü (15 mm uzun) alt kesti.
2. Stereotaksik aparatı Kaide ile uygun doğru boyutta bir pipet ucu kutusu ve üst kapağı sökün. Adım 1.1 ve doku gömme kaset ipucu tepsi sıcak-erime yapıştırıcı ile temeli üzerine hazırlanan baş tepsi yapıştırmayın. 7 mm, PUPs boyun ve gövde baş-sabit konumda desteklemek için kullanılan doku gömme kaset yüksekliğidir.
3. Tüm kurulum bir standart stereotaksik aparatı yerleştirin.

2. 30G Enjeksiyon paslanmaz çelik iğneler hazırlanması

1. 30 G şırınga iğneleri için 3 gün içinde kloroform ıslatarak önceden temiz.
2. Forseps dikkatli ve yavaş bir kimyasal başlıklı Polipropilen hub üzerinden iğneyi çıkar için kullanın.
3. Mutlak etanol iğnelerle bir shaker 50 RPM üzerinde % 70 etanol durular 3 × 10 dk ardından 20 dakika yıkayın. Kuru ve temiz bir kutu, oda sıcaklığında (RT) temizlenmiş iğneler depolamak iğneler hava kadar kullanmak izin.

3. bir bağdaştırıcı mikroenjeksiyon boruları hazırlayın

1. Microliter şırınga 30 G Enjeksiyon iğne PE10 Polietilen boru (PE10 tüp) ile bağlayın. PE20 Polietilen boru (PE20 tüp) adaptör enjeksiyon iğne ve microliter şırınga köprülemesini için hazırlayın. PE10 tüp çapı 26 G microliter şırınga iğne daha küçük olduğu için adaptör kullanımı gereklidir.
2. Microliter enjektör boruları hazırlayın: önceden temizlenmiş 30G Enjeksiyon iğne PE20 tüp ile 5 cm bağlanmak ve anlık tutkal ile birleşme mühür. Bu boru adaptörü yeniden kullanılabilir.
   Not: iğne mikroenjeksiyon şırınga 30 G ise, hazırlık (adım 3.1) ve bu adaptörü (adım 3.3) kullanımını gerekli değildir.
3. (3.1 adımda hazırlanan) boru adaptörü microliter şırınga (10 µL) takın.
4. PE10 (60 cm uzun) tüp PE20 boru adaptörü 30 G iğne üzerine bir ucunu bağlayın. Yeni 30 G Enjeksiyon iğne üzerine PE10 tüp diğer ucunu bağlayın.

4. yük Autoclaved distile su, boya ve virüsler ile mikroenjeksiyon tüp

1. Microliter şırınga pistonu çıkarın. 25 G şırınga microliter şırınga ve onun bağlı PE boru boru gelen havayı çıkarmak için autoclaved distile su ile yüklemek için kullanın.
2. Geri microliter şırınga fırlatıcıya yerleştirin ve pistonu 2 µL distile su kalır varil kadar itin. 2 µL düşük hale distile su hacmi izin vermeyin.
3. Dikkatle microliter şırınga mikro akış hızı şırınga pompa üzerine monte.
4. Küçük miktarlarda (% 0,9 serum içinde hazırlanan ve 0,22 µm filtre ile filtre) %0.1 hızlı yeşil boya ve bir parça parafilm virüs sıvı pipet.
5. Az miktarda hava bir hava kabarcığı mikroenjeksiyon tüp sıvı akışını sınamak için 30 G Enjeksiyon iğne ve tüpün içine süzülmüş hızlı yeşil 0.7 µL yükleyerek takip PE10 tüp arasındaki kavşakta görünür yapmak için geri alıyorum.
6. Mikroenjeksiyon boru içine virüs sıvılar yükleyerek ardından ikinci bir hava kabarcığı yapmak hava küçük bir miktar geri alıyorum.
7. Takın ve 30 G mikroenjeksiyon iğne kolu stereotaksik aygıtının güvenli.

5. anestezi hipotermi tarafından yenidoğan farelerin

1. Yavru bir lateks eldiven kol koyun ve 5 min için boyun kadar ezilmiş buz bırakın.
2. Pups ayak forseps ile para çekme yanıt onun ayak emin olmak için çimdik.
3. Lateks eldiven kol ile yavru baş tepsisine yerleştirin ve hipotermi anestezi için soğuk tutmak için lateks kol çevresinde bazı ezilmiş buz koyun.
4. Veteriner merhem pups gözünü anestezi altında iken kuruluk mümkünse önlemek için geçerlidir.

6. mikroenjeksiyon

1. Steril Cerrahi stereotaksik araç % 70 etanol ile iyice silerek hazırlayın. Cerrahi alet % 70 etanol çeker tarafından sterilize.
2. Pups kafa % 70 etanol ile fırçalayın. Kafatasında Simgesel Yapı lambda bulun ve lambda marker kalemle işaretlemek. Lambda için iğne ucu amaç ve ön-arka (AP) ve medial-lateral (ML) koordinatları sıfır ayarlayın.
3. Enjeksiyon kol hedef site X ve Y koordinatlarını göre hedef siteye taşımak. Doğum sonrası gün (P) 2 striatum için pups, Koordinatlar: AP, 2,4 mm anterior lambda; ML, ±1.0 mm orta hat yanal; dorsal-ventral (DV), kafatası mm'den −1.7. PE10 tüp hızlı yeşil boya bulunduğu bir kalemle işaretlemek.
4. 30 G Enjeksiyon iğne yavaş yavaş deri ve kafatası nüfuz ve kafatası yüzeyde durana kadar iğne ucu kadar alın. DV konumu sıfır ayarlayın.
5. Hedef site DV koordinatı ulaşıncaya kadar 30 G Enjeksiyon iğne yavaşça. Sürdürme normal şeklini parankimi izin vermek 1 dakika bekleyin. Mikroenjeksiyon çalıştırın (100 nL/dk).
6. Hızlı yeşil boya işareti virüs sıvı beyne enjekte edilir emin olmak için PE tüp hareketli olduğundan emin olun.
7. Mikroenjeksiyon fesih sonra 1 dakika bekleyin ve sonra yavaş yavaş ve aşamalı olarak iğneyi DV derinliği 30 içinde 1/2 yüksekliğine getirmek s. Sonra 30 s, yavaş yavaş iğne pups başından çekilme.
8. Microinjections tüm hedeflenen sitelerin tamamlanıncaya kadar 6.2-6,7 adımları yineleyin.

7. ameliyat sonrası kurtarma yavru

1. Yavru için 33 ° C kuluçka 20 dk kadar sıcak. Yavru fok sternal recumbency korumak için yeterli bilinci yerine geldi kadar yavru fok kurtarma hipotermi anestezi her 5 dk dan kontrol edin.
2. Yavru fok tamamen iyileşti sonra yavru fok baraja geri dönün.

Deney ilk kümesi için biz 200 microinjected nL Cre DNA recombinase hızlı AAV9.hSynapsin.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 virüs (AAV-eGFP-Cre, Dulbecco'nın fosfat tamponlu tuz 1/10 seyreltme) erimiş GFP ile Ai14 farelerin P2 striatum. Ai14 fareler tdTomato muhabir gen Cre-aracılı silme (floxed) loxP çevrili STOP kaset (2F rakam) üzerine hızlı. Beyin P14 GFP ve tdTomato immunostaining için hasat edildi. Birçok AAV GFP pozitif hücreler transduced hediye (Şekil 2A, C), striatum boyunca geniş enfeksiyon striatal hücre AAV-eGFP-Cre virüsler tarafından gösteren edildi. TdTomato benzer geniş ifadesi de striatum (Şekil 2B, C) bulundu. Yüksek büyütmede mikroskobik incelenmesi üzerine, neredeyse tüm GFP pozitif striatal hücreleri Co tdTomato muhabir gen ifade bulduk (Şekil 2A'-C'). Ayrıca, tdTomato sinyalleri muhtemelen akson terminalleri (Şekil 2B) globus pallidus ve gözlemliyorum nigra pars reticulata (Şekil 2E), striatonigral ve striatopallidal projeksiyon nöronların hedef bölgelerde tespit edildi 13. bu sonuçları Cre başarılı loxP aracılı AAV aracılı ifade yenidoğan striatal nöronlar faaliyete Cre tarafından indüklenen DNA rekombinasyon öneririz.

Deney ikinci kümesi için biz 50 microinjected striatum P2 loxP çevrili Foxp2 gen taşıyan Foxp2fl/fl farelerin içine AAV-eGFP-Cre virüslerin nL (Şekil 3A- C, F) ve beyin P9, hasat. Hiçbir Foxp2+; GFP+ çift etiketli hücreleri bulundu striatum, i.e., Foxp2 protein yok GFP pozitif hücrelerdeki (Şekil 3A'-C'). Denetim deneylerde, Foxp2+; GFP+ çift etiketli hücreleri mevcut AAV-eGFP denetim virüsler (şekil 3D) ile Foxp2fl/fl fareler striatum ve striatum, heterozigoz Foxp2fl / + AAV-eGFP-Cre ile fareler virüs (Şekil 3E). Bu sonuçlar Foxp2 gen özellikle yenidoğan striatum AAV-eGFP-Cre transduced hücrelerde silindiğini gösterir.

Birlikte AAV-eGFP-Cre sonuçlarını ele alındığında; Ai14 ve AAV-eGFP-Cre; Foxp2fl/fl fareler, geliştirdiğimiz stereotaksik yenidoğan beyin ameliyatı tekniği için Koşullu Sil genler, yenidoğan fare beyinlerinin belirli bölgelerde mükellef.

Şekil 1. Stereotaksik cihazları ve ev yapımı head-sabit tutucu yenidoğan fareler için. (A) stereotaksik enjeksiyon sistemi aşağıdaki aygıtından oluşur: ı. Şırınga pompa (denetleyici); II. enjektör pompası (sürücü birimi); III. microliter şırınga (10 µL); IV. PE20 boru adaptörü; v. PE10 tüp; VI. 30G Enjeksiyon iğne; VII. stereotaksik aparatı; VIII. bir pipet ipuçları kutusu yenidoğan yavrular için platform dönüştürülür; XI: buz ezilmiş. (B) yaklaşık 7 mm doku gömme kaset yüksekliğidir. 1.5 mL santrifüj tüpü 15 mm uzun düğmedir. (C) ev yapımı head-sabit tutucu içinde fare kafa sabitlenir. Ok işareti lambda yenidoğan farelerin kafasına gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 2. İfade striatum AAV-eGFP-Cre Cre-loxP DNA rekombinasyon aracılı sonra P14 Ai14 farelerin tdTomato. AAV-eGFP-Cre virüs sterotaxically Ai14 fareler P2 striatum enjekte edildi. Beyin P14 analiz edildi. (A) birçok GFP pozitif hücreler striatum (Str) mevcuttur. (B) çok tdTomato pozitif hücre içinde striatum mevcuttur. (C) birleştirilmiş görüntüler striatum GFP ve tdTomato geniş bir işbirliği yerelleştirme göstermektedir. A-C kutulu bölgelerde confocal görüntülerini a yüksek büyütmede gösterilir '-C', anılan sıraya göre. Tüm GFP pozitif hücreleri (yeşil) tdTomato (striatum içinde kırmızı) Co hızlı. (D, E) TdTomato sinyalleri striatal projeksiyon nöronlar, globus pallidus (GP; de dahil olmak üzere hedef bölgelerde tespit edilir D) ve gözlemliyorum nigra pars reticulata (SNr; E). AAV-eGFP-Cre ve Ai14 transgenik yapıları, (F) şematik çizimler. CTX: korteks; Eylül: septum; Hipp: Hippocampus; MB: orta. Ölçek çubuğu a (A-C için) 200 µm; A' (a '-C'), 10 µm; D (D ve E) için 100 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 3. İntrastriatal injecions AAV-eGFP-Cre virüs tarafından yenidoğan striatum Foxp2 gen koşullu silme. Intrastriatal enjeksiyon AAV-eGFP-Cre virüslerin P2 Foxp2fl/fl gerçekleştirilen (A-C') ve Foxp2fl / +(E) fareler. Beyin P9 analiz edildi. (A-C) GFP pozitif hücreler (A, C, yeşil) Foxp2 immunoreactivity (B, C, kırmızı) striatum AAV-eGFP-Cre virüs Foxp2fl/fl farelerin de yoksundur. A-C kutulu bölgelerde a yüksek büyütmede gösterilir '-C', anılan sıraya göre. (D) Co express GFP ve Foxp2 Striatal hücreleri ile AAV-eGFP denetim virüs enjekte ettiler striatum mevcut. (E) GFP pozitif hücreleri ortak Foxp2 ifade (ok) striatum mevcut Foxp2fl / + AAV-eGFP-Cre virüsler ile fareler. (F) şematik çizimler AAV-eGFP-Cre virüs ve Foxp2fl/fl transgenik fareler. Ölçek çubuğu a (A-C için) 200 µm; A' (a '-C', D ve E), 20 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Yazarlar ifşa gerek yok.