Method Article

Sphingomyelin türler Sphingomyelin LC-MS iki kararlı Isotopically kullanarak tarafından için nicel ve nitel yöntemi etiketli

DOI:

10.3791/57293

⸱

May 7th, 2018

 ,  , 
1Faculty of Pharmaceutical Sciences, Teikyo University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, bir protokol ölçmek ve birden çok tepki izleme kullanarak her sphingomyelin tür hak ve MS/MS/MS modu, sırasıyla mevcut.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz sphingomyelin (SM) niteliksel çözümleme ve kantitatif sıvı Kromatografi-electrospray iyonlaşma-tandem kütle spektrometresi (LC-ESI-MS/MS) tarafından bir yöntem mevcut. SM bir phosphorylcholine ve bir ceramide hidrofilik ve hidrofobik bileşeni olarak sırasıyla oluşan bir ortak sphingolipid var. SM türlerinin sayısı sphingoid uzun zincirli temel (LCB) içinde a değişiklik nedeniyle memeli hücreleri mevcut ve bir N-asil yan ceramide içinde. Bu raporda, biz karbon ve çift bağı bir LCB ve bir Nsayısı tahmin etme yöntemi gösterir-asil yan onların karşılık gelen ürün iyonları MS/MS/MS (MS3) deneylerde dayalı. Buna ek olarak, biz bir kantitatif analiz yöntemi SM için SM Nefelometri içinde kullanılan aralığını belirleme kolaylaştıran iki kararlı isotopically etiketli SM türler, kullanarak mevcut. Mevcut yöntemi SM tür biyolojik örnekler ve kozmetik gibi endüstriyel ürünlerin çeşitli karakterize faydalı olacaktır.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sphingomyelin (SM) memeli hücrelerinde ortak bir sphingolipid var. Sphingosine-1-fosfat ve bir ceramide bağışıklık içinde çok önemli rolleri olan kaçakçılığı hücre ve bariyer Homeostazı, sırasıyla2deri gibi SM sentezlenmiş intracellularly1 ve diğer organizmalardandır için bir habercisi olarak hediye. 3. Böylece, SM metabolizma kesin analizini organizmalardandır fizyolojik ve patolojik rolleri elucidating için önemlidir.

SM bir ceramide ve daha da bir sphingosine ve bir Noluşan ceramide 1-hidroksi grubuna bağlı bir phosphorylcholine oluşur-asil yan. ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kullanmadan önce ilgili tüm malzeme güvenlik bilgi formları (MSDS) başvurun. Örnek bulaşma deri kaynaklı SM tarafından en aza indirmek için eldiven giymek. HeLa hücreleri % 10 fetal sığır serum ile (FBS), 2 mM Ltamamlanan kartal'ın en az gerekli ortamda yetiştirilen mevcut iletişim kuralı uygulandığı-glutamin, 1000 U/L penisilin ve 100 mg/L streptomisin.

1. hazırlanması Lipid örnekleri

Not: Test tüpleri Teflon kaplı vidalı kapakları dahil olmak üzere tüm cam ürünleri deterjan-Alerjik olması önemlidir.

  1. Toplam lipid kesir çekme--dan Bligh & Dyer yöntem7 kullanarak hücre ho....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kimyasal sentez d18:1 / 24:0 SM (şekil 1A) ve d18:1 / 24:0 SM lipid örneklerinde HeLa hücreleri (şekil 1B) elde analiz LC-ESI-MS3 [M + HCOO]- istihdam ve [M-CH3] tarafından- birinci ve ikinci habercisi iyonları, olarak anılan sıraya göre. Demethylated-sphingosylphosphorylcholine (SPC) (m/z 449) spektrum yoğunluğunu SM Ndaha büyük olduğ.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mevcut nitel yöntemde, biz MS3 ürün iyonları bir SPC ve bir Nelde edilen-asil yan. Düzgün bir SPC ve bir Natamak için önemlidir-asil yan. Bu amaçla, bu diğer phosphorylcholine içeren moleküller de MS3 ürün iyonları tespit edilebilir olması gerekmektedir. Diacyl-phosphatidylcholine (PC) ve plasmalogen-PC bol memeli hücrelerinde varsa ve onların hydrophobicity SM benzemektedir. Bu nedenle, diacyl-PC ve plasmalogen-PC ile bir izotop (genellikle 13C) teorik olarak aynı anda .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar onlar hiçbir çıkar çatışması var bildirin.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu eser Milli Eğitim Bakanlığı, kültür, spor, bilim ve teknoloji, Japonya (KAKENHI) K.H. (#15 K 01691) için Y.F. (#15 K 08625), K.Y. (#26461532) ve bir hibe Bakanlığı inatçı hastalığı projeden incelenmesi için bir araştırma hibe tarafından desteklenmiştir Sağlık, iş gücü ve refahı (K.Y. #201510032A). Edanz grubu (www.edanzediting.com/ac) bu yazının taslağını düzenleme için teşekkür ediyoruz.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
PBSThermoFisher10010023
100 mm doku kültürü kabıIWAKI3020-100
Hücre sıyırıcıIWAKI9000-220
Silikonlu 2.0 mL tüpFisher Scientific02-681-321
Test tüpüIWAKITST SCR 16-100
Teflon astarlı vidalı kapakIWAKI9998CAP415-15
Tek kullanımlık cam tüpIWAKI9832-1310
CAPCELL PAK C18 ACR 3 & mikro; m 1,5 mm İç Çap x 100 mmShiseido92223Koruma kartuşu, kartuş tutucuya takılır ve C18 sütununa bağlanır
CAPCELL C18 MGII S-3 2,0 mm x 10 mm KORUMA KARTUŞUShiseido12197
Kartuş tutucuShiseido12415
AsetonitrilWako018-19853
2-Propanol (İzopropil Alkol)Wako161-09163
MetanolWako134-14523
Formik asitWako066-00466
%28 Amonyak suyuWako016-03146
Sonikatör (banyo tipi)SHARPUT-206H
Cam test tüpü için girdap karıştırıcıTAITECMix-EVR
1.4 mL cam flakonTomsic500-1982Numuneler, vidalı kapakla kapatılmış 1.4 mL cam şişede ve -20 ° C'de 8 mm septumda saklanır; C
8 mm septumTomsic200-3322Numuneler analiz edildiğinde, vidalı kapaklar yarık septumlu vidalı kapaklarla değiştirilir
1,4 mm cam flakon için vidalı kapakTomsic500-2762
Yarık septumlu vidalı kapakShimadzuGLC GLCTV-803
PVDF 0.22 &mikro; m filtreKırlangıçSLGVR04NL
Üçlü dört kutuplu ve dört kutuplu doğrusal iyon tuzağı kütle spektrometresiSCIEXQTRAP4500
Ürün iyon spektrumlarının veri toplama ve analizi için yazılımSCIEXAnalisti
Kantitatif analizde veri entegrasyonu için yazılımSCIEXMultiQuant
HPLC sistemiShimadzuNexera
Cam şişeSansyo85-0002
d18:1/24:0 sfingomyelinAvanti Polar Lipidler860592P
SfingosilfosforilkolinMerck567735
Fetal sığır serumuThermoFisher 
L-glutaminThermoFisher 
Penisilin ve streptomisinSigmaP4333
Kartal' s minimum esansiyel ortamSigmaM4655
2614007925030081

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Huitema, K., van den Dikkenberg, J., Brouwers, J. F., Holthuis, J. C. Identification of a family of animal sphingomyelin synthases. EMBO J. 23 (1), 33-44 (2004).
  2. Kihara, Y., Mizuno, H., Chun, J. Lysophospholipid receptors in drug discovery. Exp Cell Res. 333 (2), 171-177 (2015).
  3. ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Sphingomyelin AnalysisLC MS MS MethodStable Isotope LabelingLipid ExtractionMobile Phase PreparationTriple Quadrupole MSProduct Ion SpectraStandard Curve ConstructionHeLa Cell SamplesCosmetic Lipid Characterization

Related Articles