Akut ve kronik Ecotoxicity test turkuaz Killifish Nothobranchius furzeri için iletişim kuralı

Summary

Bu çalışmada, akut, kronik ve multigenerational bir bioassay turkuaz killifish Nothobranchius furzeritek ve kombine stresler etkilerini çalışmaya açıklar. Bu iletişim kuralı hayat-Tarih özellikleri (ölüm, büyüme, verimlilik, ağırlık) ve kritik termal maksimum çalışma için tasarlanmıştır.

Abstract

Killifish Nothobranchius furzeri ecotoxicology alanında gelişmekte olan bir model organizma ve akut ve kronik ecotoxicity test onun uygulanabilirliği göstermiştir. Genel olarak, toksik bileşikler için türlerin hassasiyet aralığı ile ya da daha yüksek, diğer modeli türlerin mevcuttur.

Bu eser akut, kronik ve multigenerational BİYOANALİZLER i. furzeritek ve kombine tetikleyici efektleri için iletişim kurallarını açıklar. Kısa olgunlaşma zamanı ve yaşam döngüsü nedeniyle bu omurgalı model dört ay içinde bitiş noktaları olgunlaşma zamanı ve verimlilik gibi çalışma sağlar. Transgenerational tam ömrü pozlama denemeler kadar az 8 ay içinde gerçekleştirilebilir. Bu tür kuraklığa dayanıklı yumurta üretir ve yıl boyunca geçerli kalır, türlerin yerinde kültür gerekli değildir ama bireyler gerektiğinde işe. Protokoller ölçü hayat-Tarih özellikleri (ölüm, büyüme, verimlilik, ağırlık) ve kritik termal maksimum için tasarlanmıştır.

Introduction

Duyarlılık profilleri için stratejik olarak seçilen toxicants türlerin bir dizinin (kayıt, değerlendirme, yetkilendirme ve kimyasallar kısıtlama) Avrupa ulaşmak mevzuat için açıklanan¹ olmuştur. Onlar bir türün hassasiyeti hızlı bir göstergesidir gibi akut veya kısa vadeli toksisite testleri çoğunlukla bu amaç için kullanılmıştır. Ancak, kendi doğal ortamlarında organizmalar üzerinde çok daha uzun süre maruz kalır ve tam ömürleri ya da hatta birkaç nesil etkilenen²olabilir. Ayrıca, kirli ortamlarda organizmalar genellikle muhtemelen sinerjik etkileri³' te sonuçlanan birbirleriyle etkileşime girebilir, bir anda, birden çok tetikleyici için sunulur. Bu nedenle, güvenli konsantrasyonları hesaplanan dayalı akut, tek tetikleyici toksisite testleri, doğal ortamlarında toxicants tarafından dayatılan gerçek riskleri hafife. Bu, bu nedenle, aynı zamanda Avrupa Komisyonu^4,5 ve USEPA (Amerika tarafından savunduğu gibi sublethal toxicants bir çevre ilgili bağlamda konsantrasyonları kronik ve multigenerational etkileri çalışmaya tavsiye edilir Birleşik Çevre Koruma Ajansı)^6,7. Özellikle omurgalı araştırmada, kronik ve multigenerational pozlama çalışmaları nedeniyle nispeten uzun ömrü için omurgasız canlılar karşılaştırıldığında omurgalıların gerçekleştirirken emek, para ve zaman açısından maliyetleri yüksektir. Bu nedenle, araştırma soru bağlı olarak en uygun balık model organizma seçmek için tavsiye edilir. Ayrıca, omurgalı türleri geniş bir dizi türlerin en hassas türler üzerinde dayalı düzenlemeler adapte edebilmek için karşıdan karşıya yanıt genelliği test etmek için kullanılabilir olması gerekir. Şimdi, yeni, kronik ve multigenerational Etkilenmeler omurgalılar^7,8performans maliyetleri düşürmek için kısa yaşam döngüleri ile karakterize omurgalı modeli türleri ile etkili iletişim kuralları geliştirmek için gerek yoktur.

Turkuaz killifish Nothobranchius furzeri onun kısa olgunlaşma zamanı ve yaşam döngüsü (oluşturma süresi 4 hafta⁹' dan daha az) nedeniyle böyle uzun süreli pozlama deneylerde kullanmak için ilginç bir balık modelidir. Bu olgunlaşma zamanı ve verimlilik gibi ekolojik ilgili bitiş noktaları diğer balık modelleri⁷' ye göre bir kısa zaman dilimi içinde okudu olabilir anlamına gelir. Ayrıca, bu balık için birkaç yıl böylece sürekli kültür⁹ihtiyacını ortadan kaldırarak, standart koşullarda saklandığında uygun kalır kuraklığa dayanıklı, uyuyan yumurta üretmek. Ecotoxicological çalışmalarda, bu da balık tüm tam olarak aynı anda, farklı zamanlarda üretilen yumurta toplu işlemleri arasında bile tüm hayvanlar için zaman senkronizasyonu sonuçlanan yumurtadan bu çoğaltılır anlamına gelir. Pozlama deneyler gerçekleştirmek için laboratuvar GRZ zorlanma kullanarak tavsiye. Bu yük de laboratuvar koşullarında gerçekleştirir, (seks kromozom hariç) homozigoz ve genom de karakterize^10,11.

Ecotoxicological çalışmalarda test konsantrasyonları uygun aralığı seçmek önemlidir. Bu amaçla çeşitli tamamlayıcı yöntemler kullanılabilir. Nominal konsantrasyon aralığı Nothobranchius guentheri¹²gibi ilişkili bir tür duyarlılığını temel alabilir. Alternatif olarak, aralığın en toxicants (Philippe vd karşılaştırılabilir bir duyarlılık var Zebra balığı (Danio rerio)² gibi standart balık modelleri duyarlılığını temel alabilir (İnceleme)). Bu seçeneklerin her ikisi ile birlikte deney bir mesafe nominal konsantrasyon aralığı seçmek için yapılmalıdır. Akut test etmek için araştırmacılar konsantrasyon tedaviler için % 100 ölüm, ara mortalite ve % 0 mortalite ile maruz kalmanın toxicant 24 saat sonra amacı olmalıdır. Kronik test etmek için deneme durumda en yüksek test konsantrasyonları ile larva ölüm oranı % 10 Bu başvuru dönemde aşmadığı Eğer doğrulamak iki hafta için mesafe ölçme cihazı çalıştırmak için tavsiye edilir.

Protokol stresler bireysel ve hücresel düzeyde olası etkilerini inceleyerek, su kaynaklı kirleticiler akut ve kronik maruz i. furzeriüzerinde gerçekleştirmek için bir temel olarak hizmet verebilir. Daha yüksek bir ekolojik uygunluğu, farklı toksik bileşikler karıştırma ya kirliliği ve diğer doğal stresler (örneğin predasyona) arasında etkileşimli efektleri eğitim barındırmak için birden çok tetikleyici araştırma gerçekleştirmek için de kullanılabilir veya antropojenik stresler (örneğin Isınma İklim değişikliği nedeniyle).

Protocol

Tüm yöntem tanımlamak burada KULeuven Etik Komitesi tarafından onaylanmış olması.

1. tarama ve i. furzeri genel bakım

1. Hazırlamak balık orta (pH 7) 14 ° c sıcaklıkta ve 600 µS/cm (24 ° C) iletkenlik için eklenen standart tuzları ile arıtılmış tip II su ekleyin.
2. Yumurta standart koşullar¹³altında saklanan GRZ (Gona-Rhe-Zhou) laboratuvar satırı seçin. Yumurta (Yani çatlamaya hazır), DIII aşamasında seçin tanınabilir varlığı ile altın gözler⁹ ve yavaşça onları bir plastik 2 lt tank (tank başına yaklaşık 30'dan fazla yumurta) cımbız yumuşak bir çift ile aktarın.
   Not: yeterli sayıda sağlıklı test organizmalar için gerekli balık larva sayısı olarak iki katı kadar yumurtalar çatlar.
3. Balık orta 1 cm 12 ° C'de eklemek ve yavaş yavaş oda sıcaklığında (24 ° C)⁹' a yakınsama su sıcaklığı. Balık ilk 12 saat içinde yumurtadan.
4. (Bakınız gıda, miktarı ve sıklığı konusunda daha fazla ayrıntı için Polačik vd. 2016⁹üreme Protokolü) 24 saat sonra taze taranmış Artemianauplii konsantre doz yavru yem ve su 5 cm için arttırmak Balık orta ekleme.
5. 36 h sonra yavru taze taranmış Artemia nauplii bir konsantre doz yem ve su derinliği 10 cm artırmak için balık orta ekleyin.
6. 14 h:10 h altında balık konteynerler (örneğin bir kuluçka makinesi, iklim oda veya ısıtmalı su banyosu) sabit sıcaklık koşullarında kuluçkaya ışık: karanlık rejimi.
7. Toxicants aktarmak gerçek kapsayıcısında sınırlamak için karmaşık balık kapları (balık) olmadan onları maruz kalma orta yüksek konsantrasyon ile doldurma ve gideriş o bileşik pozlama ile deney başlamadan önce gece deneme.
8. 48 h damızlık sonra sağlıklı neşeli larva pozlama deneme başlatmak için seçin. Onların yüzme kesesi doldurun ve sonuç olarak Engelli bir kaldırma kuvveti vardır koyamadık sözde göbek kaydırıcıları atmak (sürekli altına lavabo).

2. kısa süreli maruz kalma Protokolü

Not: Araştırmacılar en az 20 çoğaltır (20 balık ayrı kavanoz) tedavi başına hedeflemelisiniz. Bahçedeki hisse senedi çözüm bir çözücü kullanarak hazırlanan tam denetim tedavisi yanı sıra, solvent denetim dahil edilmelidir. Solvent denetim çözücü en yüksek pozlama konsantrasyon çözelti konsantrasyonu eşit miktarda içermelidir.

1. Onları etiketleme ve onlara uygun pozlama orta (farklı yaydıkları konsantrasyonları) ile girerek deneysel konteynerler (0,5 L Cam Kavanoz) hazırlayın. Doğru konsantrasyon elde etmek için bileşik ekleyin.
2. Larva (48 saat sonrası çıkım) ayrı ayrı kaplara (bireysel izleme için konteyner başına 1 balık) aktarın.
   Not: Balıklar tek tek gıda ve saldırganlık için rekabet gibi sosyal etkileşim olası karıştırıcı etkilerini en aza indirmek için maruz kalır. Ancak, Balık görsel olarak laboratuvar hayvan kullanmak için etik standartlara uygun olarak etkileşimine izin verilir.
3. Bu akut maruz kalma kadar 2 hafta süresince izleyin. Bu süre içinde balıklara yem ad libitum Artemia nauplii günde iki kez, haftada 7 gün ile.
4. Orta her geçen gün su kalitesini korumak için ve potansiyel bileşik bozulması etkilerini en aza indirmek için yenileyin. İzlemek anahtar su değişkenleri (çözünmüş oksijen seviyesi % 80'i aşan, iletkenlik aralığı 600 ve 700 µS/cm, pH 7.8 8.2 ve sertlik (olarak CaCO₃) arasında arasında 350 ve uygun yetiştirme koşulları aralığı içinde yatıyor 450 mg/L arasında i. furzeri ⁹). Su örnekleri önce ve gerçek bileşik konsantrasyonu belirlemek için orta ferahlatıcı sonra al.
5. Bitiş noktaları
   1. Balık ölüm, stres için kontrol edin (örneğin anormal davranış: baş aşağı yüzme) ya da hastalık her gün (sabah, akşam). Shedd vd yayınlanması danışın (1999) ¹² gözlem mortalite, stres veya hastalık hakkında ayrıntılı bilgi için.
   2. LC hesaplamak₅₀ değerlerine dayalı farklı zaman noktalarda doz-yanıt eğrileri (Ritz ve Streibig, 2005) kullanılarak mortalite. ' R v3.2.3 (R geliştirme çekirdek takımı, 2016) drc pakette drm işlevini kullanın ya da benzer istatistiksel yaklaşımlar.

3. kronik pozlama Protokolü

Not: Amacı en az 25 balık/durum deneme, çarpık seks oranı olma olasılığını en aza indirmek için ve potansiyel arka plan ölüm doğal nedenler nedeniyle karşılamak için başlangıcı olarak (i.e. yaşa bağlı mortalite).

1. (Bkz: 1) çıkım
2. Aşama ı (2 gün-sonrası 16 gün sonrası kuluçka çıkım)
   1. 2.1-2.4 açıklandığı gibi iletişim kuralı izleyin
   2. İkinci aşamasında deneme olarak, orta (hiçbir ferahlık, aşağıya bakınız) hafta boyunca düşer. Orta gerekli miktarda bir hafta boyunca bahçedeki benzer düşmesine izin vermek için büyük etkisiz kaplarda saklayın.
3. Aşama II (16 gün sonrası çıkım-bitiş)
   1. 2 L hazırlamak deneysel cam kavanozlar kompleks tarafından onları ile bileşik. Kavanoz doğru pozlama orta ile doldurun ve kavanoz havalandırmak için bir hava tüp ekleyin. Bu kavanozlar deneme geri kalanı için ayrı ayrı ev balık. Etik standartları karşılamak görsel etkileşim sağlar.
   2. Haftada bir kez orta yenileyin. Bir ağ ile balık aynı poz orta içeren yeni bir kavanoza aktarın. Su örnekleri her konsantrasyon tedavisinde bileşik bozulması izlemek için bir hafta boyunca her gün al. Bir bozulma eğrisi birden fazla stres varsa her tedavi için (örneğin bir bileşim içinde farklı sıcaklık rejimleri toksisite) test hesaplamak. Abiyotik parametreleri (pH, sıcaklık, % çözünmüş oksijen, iletkenlik) haftada üç kez ölçmek.
   3. 2 sonrası kuluçkalık (dph) kadar gün 23 dph, günde iki kez, 7 gün hafta ad libitum Artemia nauplii başına balık yemi. 24 dph - 37 dph, kıyılmış Chironomus larvaları ile reklam libitumArtemia diyet tamamlıyor. 38 dph üzerinde günde iki kez, 7 gün başına hafta ad libitum Chironomus larva dondurulmuş balık yemi.
4. Bitiş noktaları
   1. Günlük onay balık ölümleri, stres veya hastalık¹².
   2. Büyüme belirlemek için balık orta onların rezervuar ile dolu bir petri aktararak haftalık olarak (9 dph - 16 dph - 21 dph -...) vücut büyüklüğü ölçmek. 4-5 kalibre boyutu fotoğraf yukarıdan balık (sabit bir yükseklikte) çekmek ve bunları dijital olarak (örneğin ImageJ) kayma bir ölçüm programı kullanarak analiz.
      Not: tüm balık ölçme işlemi tüm boyunca su altında tutarak işleme stresi en aza indirmek için daha yüksek bir petri yetişkin balık için kullanın.
   3. Erkek olgunlaşma için balık günlük 15 dph itibaren gelen renklendirme için kontrol edin. Yüzgeçleri için evlilik renklendirme (ikincil cinsel özellikleri) ilk belirtileri kontrol edin. İlk gün, bu erkek olgunlaşma bir proxy olarak görünür zamanı kullanın.
   4. Sigara sexed balık erkek aynı tedavi grubunun veya deneysel olmayan erkekler haftada üç kez ile 30 dph itibaren kadın olgunlaşma süresi (gün ilk yumurta yatırılır) belirlemek için bir çift gördüm. Bunun için 3.4.5 içinde açıklanan yumurtlama protokolü kullanın.
   5. Verimlilik için çift Olgun kadın olgun erkek 3 kez / 30 dph haftadan itibaren içinde kendi tedavileri kullanarak bir geçiş düzeni.
      1. Pozlama orta substrat yumurtlama ile desteklenmiş erkek akvaryum kullanarak her çift için yumurtlama tankı (1 L) hazırlamak (ince kum < 500 µm).
      2. Hem erkek hem de kadın yumurtlama tanka transferi ve iki saat boyunca yumurtlamak izin. İnsan faaliyetleri veya yumurtlama konteyner çevresinde rahatsızlık bu işlem sırasında en aza indirmek.
      3. Daha sonra hafifçe balık geri onların özgün konut kaplarına gereksiz yumurtlama substrat yumurta kadar whirl su karıştırma olmadan aktarın.
      4. Yumurtaları yumurtlama substrat 500 µm kafes dökerek filtre. Yumurtaları saymak ve aktarmak (yumuşak cımbız kullanarak) için nemli torf yosun, Petri yemekler^9,-¹⁴.
      5. Ölü yumurta her gün kaldırın. Sonra bir hafta, Petri film mühürleme ile çanak ve bir sıcaklığında saklayın mühür kontrollü kuluçka 28 ° c ve bir 14:10 s açık: koyu DIII faz (Yani yaklaşık üç hafta sonra çatlamaya hazır) hemen Geliştirme döngüsü. Uzun süreli depolama için üzerine yumurta uyuyan aşama girmek ve birden fazla yıl boyunca uygun kalmak sürekli karanlık yumurta 17 ° C'de depolayın. Balık deneyler için uyuyan bu yumurtadan işe, uyuyan yumurta 28 ° C koşullarına 1410: s açık: koyu döngüsü DIII faz kalkınma için izin vermek yaklaşık üç hafta boyunca ile aktarın.
   6. Yetişkin balık kritik termal maksimum (CTmax) (performans¹⁵için bir ölçü) ölçmek.
      1. Isıtılan bir su banyosu 0,33 ° C/dk sabit bir oranda kullanmak ve içinde sürekli su sirküle olduğunu. Tek tek her balık için birkaç 1 L aquaria ekleyin.
         Not: alanıyla ilgili kısıtlamalarla su banyosu içinde göz önüne alındığında, birkaç dizisi çalışmak gereklidir. Şartlar serisi arasında potansiyel farklılıklar istatistiksel analiz 'serisi' rastgele bir faktör olarak dahil ederek gerçekleştirirken dikkate alınmalıdır.
      2. Deneme su içinde belgili tanımlık akvaryum balık (genellikle 28 ° C) deneysel yetiştirme sıcaklığı ulaşmıştır akvaryuma balık ekleyerek başlayın. CTmax Bath 1 L aquaria sıcaklığında dijital termometre (0.1 ° C ölçek) kullanarak her 5 dk izlemek.
      3. Balık dorso-ventrally dik konumunu korumak başarısız olur veya ağır^16,17seğirmesi başlatıldığında davayı sona. Kritik maksimum sıcaklık 1 L akvaryum ısısını ölçmek. Balık geri kurtarma için deneysel onun konut aktarın.
   7. Balık ağırlığı (0.1 mg doğruluk) kuru okşamaya ve tartı bir teknede aktarma deneme son gününde ölçmek. Not: Tüm balık gıda ağırlık bağırsak standartlaştırmak için son besleme sonra dört saat ölçülmelidir.
   8. % 0.1 kullanarak balık ötenazi Tricaine.

4. Transgenerational pozlama Protokolü

Not: İ. furzerikirleticilerin transgenerational etkileri ölçmek için ilk nesil için yukarıda özetlenen kronik pozlama Protokolü uygulayın.

1. Haftada bir iki kez, 28 ° C'de depolanan üretilen yumurta (i.e. belgili tanımlık ikinci üretme) gelişimi kontrol 1410: s açık: koyu döngüsü koşulları embriyolar için petri kaplar DIII aşamasında teftiş tarafından (bkz: Polačik vd. 2016⁹). Otelde her ebeveyn tedavi 50'den fazla çoğaltır tam olarak gelişmiş, onları 1.1 protokolüne hatch.
2. Tam olarak aynı kurulum ve tedavi olarak ebeveyn balık için sağlıklı, neşeli balık maruz.

Results

İ. furzeri akut maruz kalma bakır, farklı konsantrasyonları sonuçlarını hesaplanan 2.5.2 olduğu gibi cleardose-yanıt ilişkileri (şekil 1) göstermek. Yaydıkları konsantrasyonu artan ölüm bir artış vardır. LC₅₀ değerleri zaman içinde konsantrasyonları azaltılarak, daha fazla zaman çoğaltır die % 50'si önce geçer anlamı azaltmak. Bakır, yanı sıra diğer türlere göre türün hassasiyeti karşılaştırılması için i. furzeri akut ve kronik po...

Discussion

Bu eser bireysel çalışmaya Nothobranchius furzeri, ortaya çıkan bir model organizma kullanarak yeni bir bioassay açıklar ve uzun vadeli etkileri toxicants ve diğer stresler kombine. Sunulan iletişim kuralları toxicants (bakır, kadmiyum, 3,4-dichloroaniline ve chlorpyrifos) bir diziye tür duyarlılığı ölçmek için başarıyla uygulandı. Hızlı ömrünün, nedeniyle bu omurgalı modeli sublethal değerlendirilmesi için izin verir ve transgenerational dört ay içinde etkiler. Bu balık türleri toksisite tarama için bir model o...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
arıtılmış su Tip 1 (milli Q)	Millipore
Deniz Tuzu	Anında Okyanus
2L plastik tank	SAVIC		Kontrol ve toksisite tedavileri için her zaman ayrı malzeme
1L plastik tank (yumurtlama)	Avamoplast		Kontrol ve toksisite tedavileri için her zaman ayrı malzeme
ağları	Aqua bilzen		Kontrol ve toksisite tedavileri için her zaman ayrı malzeme
2 litrelik cam kavanozlar	Sepac-Flacover		Kontrol ve toksisite tedavileri için her zaman ayrı malzeme
0,5 L cam kavanozlar	Sepac-Flacover		Kontrol ve toksisite tedavileri için her zaman ayrı malzeme
Artemia yumurtaları	Ocean Nutrition
chironomus	Ocean Nutrition		dondurulmuş
tricaine	, Sigma, aldrich,
petri kapları	VWR,
Parafilm	VWR
pipetleri	MLS
cımbız,	FST
500 ve mikro; m örgü elek	/		kendi kendine yapılan
mikrosantrifüj tüpü (2ml)	MARKA		Balıkları dondurucu cam şişelerde saklamak için
	Sigma aldrich		Su analizi için
tartı teknesi	MLS
	Jiffy
su banyosu	Ctmax	için Gilac
	Sıvı hava termometresi
	Testo AG	testo 926
HETO termal ısıtıcı	Anker Schmitt
kalibre edilmiş terazi	Mettler-Toledo AG
kamera	/
kamera platformu	/		kendi kendine üretilen
çok parametreli kit	HACH
Dondurucu (-80 derece; C)	Panasonic Ultra düşük sıcaklık dondurucu
İsim	Şirket	Katalog Numarası	güçlüYorumlar
>Fysio
homojenizasyon tamponu	VWR		0.1  M TRIS– HCl, pH 8.5, 15 % polivinil pirolidon, 153  &mikro; M MgSO4  ve% 0.2 % Triton X-100
kloroform: metanol	Sigma Aldrich
gliseril tripalmitat	Sigma Aldrich
amiloglukosidaz	Sigma Aldrich	A7420
glikoz tahlil reaktifi	Sigma Aldrich	G3293
Biorad protein boyası	VWR
96 oyuklu mikrotitre plakası	Greiner Bio-one
384 mikrotitre plakaları	Greiner Bio-one
2 ml cam tüpler	Fiers		Yağ analizi için
2,5ml eppendorf tüpleri	VWR
homojenizatör	Ultra-turrax TP 18/10
fotospektrometre	Infinite M200 Cam tüpler için TECAN
ısıtıcı	Hach COD REACTOR
santrifüj	Eppendorf Santrifüj 5415 R İnkübatör
	Bumako