CRISPR-aracılı kaybı serebellar granül işlev analizinin gen transferi Elektroporasyon tabanlı rahim içinde kullanarak hücreleri

Summary

Geleneksel işlev kaybı çalışmalar nakavt hayvanlar kullanarak genlerin kez pahalı ve zaman alıcı olmuştur. Somatik mutagenesis CRISPR-aracılı Elektroporasyon tabanlı gen içinde vivoişlevleri anlamak için güçlü bir araçtır. Burada, nakavt fenotipleri beyincik Proliferasyona hücrelerdeki analiz etmek için bir yöntem raporu.

Abstract

Beyin malformasyonu kez tarafından genetik mutasyonlar neden olur. Hasta elde edilen dokular mutasyonların deşifre olası etken faktörleri hastalıkları tespit etti. İşlev bozukluğu hastalığı geliştirme mutasyona uğramış genler katkısını doğrulamak için mutasyon taşıyan hayvan modellerin üretimi bir açık yaklaşım. Genetik olarak germline iken fare modelleri (GEMMs) popüler biyolojik araçlardır ve tekrarlanabilir sonuçlar sergi, zaman ve maliyeti ile sınırlıdır. Bu arada, Sigara germline GEMMs kez daha uygun bir şekilde keşfetmek gen işlevini etkinleştirin. Bazı beyin beri hastalıklar (Örn, beyin tümörleri) üzerinden somatik neden gibi görünüyor ama değil germline mutasyonlar, Sigara germline chimeric fare modelleri, hangi normal ve anormal hücreleri bir arada, hastalık ilgili analiz için yararlı olabilir. Bu çalışmada, beyincik bedensel mutasyonlar CRISPR-aracılı indüksiyon için bir yöntemi bildirin. Özellikle, hangi Cas9 ve GFP kronik aktif CAG (CMV artırıcı/tavuk β-aktin) düzenleyici tarafından Cresonra koşullu çakma fareler, kullanılan-aracılı rekombinasyon genom kopyası. Kendini tasarlanmış tek-Kılavuzu RNA'ların (sgRNAs) ve Cre recombinase sıra, hem bir tek plazmid yapı kodlanmış serebellar kök/progenitor hücre içine rahim içinde Elektroporasyon kullanarak bir embriyonik aşamada teslim edildi. Sonuç olarak, transfected hücreleri ve onların kızı hücreleri böylece daha fazla fenotipik analizleri kolaylaştırmak yeşil flüoresan protein ile (GFP), etiketli. Bu nedenle, bu yöntem sadece Elektroporasyon tabanlı gen teslim embriyonik serebellar hücrelere gösterilen ama ayrıca CRISPR-aracılı işlev kaybı fenotipleri değerlendirmek için yeni bir kantitatif yaklaşım öneriyor.

Introduction

Beyin hastalıkları en korkunç ölümcül hastalıklardan biri vardır. Onlar genellikle genetik mutasyonlar ve sonraki bozukluk sonucu. Moleküler mekanizmalar beyin hastalıkları anlamak için şimdiye kadar süren çabaları insan hasta genleri deşifre için potansiyel sorumlu genlerin bir dizi keşfettim. Şimdiye kadar genetik olarak germline hayvan modelleri vivo içinde kazanç--fonksiyonu (GOF) ve işlev kaybı (LOF) analizleri gibi aday gen için kullanılan. Fonksiyonel doğrulama çalışmaları hızlandırılmış gelişimi nedeniyle, gen işlevi okuyan bir daha uygun ve esnek vivo içinde gen tahlil arzu edilen sistemdir.

Vivo Elektroporasyon tabanlı gen aktarım sistemi uygulamaya gelişmekte olan fare beyin bu amaç için uygundur. Aslında, rahim içinde Elektroporasyon kullanarak çeşitli çalışmalar gelişmekte olan beyin^1,2,3fonksiyonel analizler yapmak için potansiyel göstermiştir. Aslında, fare beynin korteksinin⁴, retina⁵, diencephalon⁶, arka beyin⁷, beyincik⁸ve spinal kord⁹ gibi birden fazla bölge somatik gen teslim tarafından hedef almış yaklaşımlar, öylesine uzakta.

Nitekim, geçici gen ekspresyonu vivo içinde Elektroporasyon embriyonik fare beyin üzerinde tarafından uzun GOF analiz için kullanılmıştır. Son transposon dayalı genomik tümleştirme teknolojileri daha fazla gen işlevi sırasında kayma ve zamansal bir şekilde incelemek için avantajlı olan uzun vadeli ve/veya koşullu ifade faiz^10,11, genlerin etkin geliştirme. GOF Analizi aksine, LOF analiz daha zor oldu. Çift ve shRNA taşıyan plazmidlerin geçici transfection gerçekleştirildi iken, genlerin LOF uzun vadeli etkileri plazmit ve dsRNAs gibi exogenously tanıttı nükleik asitleri nihai bozulması nedeniyle garanti edilmez. Ancak, LOF analizlerde aracılığıyla bir ara CRISPR/CA teknolojisi sağlar. Floresan proteinler (Örneğin, GFP) veya kollarındaki proteinler (Örneğin, ateş böceği luciferase) kodlama genler ile CRISPR-Cas9 ve sgRNAs CRISPR-Cas9-aracılı somatik mutasyon maruz hücreleri etiketlemek için ortak transfected. Eksojen marker gen seyreltilmiş ve uzun vadeli yayılması sonra bozulmuş beri bununla birlikte, bu yaklaşım sınırlamalar fonksiyonel çalışmalar Proliferasyona hücreleri üzerinde olabilir. Transfected hücreleri ve onların kızı hücreleri onların genleri CRISPR kaynaklı mutasyonların tabi iken, onların ayak izleri zamanla kayıp alabilirsiniz. Böylece, genetik etiketleme yaklaşımlar bu sorunu aşmak için uygun olacak.

Son zamanlarda onların farklılaşma¹²sırasında uzun vadeli yayılması geçmesi serebellar granül hücre CRISPR tabanlı LOF yönteminde geliştirdik. Transfected hücrelerin genetik olarak etiketlemek için bir sgRNA Cre ile birlikte taşıyan bir plazmid inşa ve plazmid rahim içinde Elektroporasyon kullanarak Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP fareler¹³ cerebella tanıttı. EGFP kodlama düzenli plazmid vektörel çizimler bu yaklaşım başarıyla nöron öncüleri (GNPs) transfected granül etiketli ve onların kızı hücreleri. Bu yöntem vivo içinde işlev ilgi normal beyin gelişimi ve tümör eğilimli bir arka plan Proliferasyona hücrelerinde genlerin anlamada büyük destek sağlar.

Protocol

Tüm hayvan deneyleri hayvan refahı düzenlemelere göre yapılmıştır ve sorumlu yetkilileri tarafından onaylanmıştır (Regierungspräsidium Karlsruhe, onay numaraları: G90/13, G176/13, G32/14, G48/14 ve G133/14).

1. pU6-sgRNA-Cbh-Cre plazmid oluşturmak

1. Gen--ilgi çekici bir daha önce yayımlanmış Protokolü¹⁴göre hedefe sgRNA tasarım.
   Not: Bu deneyde iki sgRNAs fare Top2b gen ve bir sigara hedefli kontrol sgRNA (Tablo 1) hedeflemek için tasarlanmıştır. CRISPR teknolojisini kullanarak nakavt gene(s) için sgRNAs 5' bölgesinin kodlama dizisi ya da protein temel işlev etki alanı hedef için tasarlanmış olması gerekir. Bir uygun başlangıç noktası GeCKO v2 fare nakavt havuzu Kütüphane¹⁵ Zhang laboratuvar gibi kamuya önceden tasarlanmış sgRNA dizileri test etmektir. Alternatif olarak, sgRNAs aşağıdaki Web sitesi gibi kamu mevcut yazılım kullanarak dizayn edilebilir: crispr.mit.edu.
2. SgRNAs pU6-sgRNA-Cbh-Cre vektör kopyalayın.
   Not: Bu çalışmada kullanılan pU6-sgRNA-Cbh-Cre vektör¹² SpCas9 kodlama dizisi ile Cre recombinase yanında eski yerine koymak orijinal pX330 plazmid¹⁶ türetilmiştir.
   1. İki DNA oligos aşağıdaki gibi sentez. Anlamı: 5' - CACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN - 3'; Antisens: 3' - CNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAA - 5'.
      Not: 20 N stand sgRNA sırası için yukarıda gösterdi.
   2. PU6-sgRNA-Cbh-Cre BbsI ile aşağıdaki reaktifler kullanarak 37 ° C'de 30 dk için sindirmek, sindirilmiş örnek % 1'özel jel için yük ve bir jel-ekstraksiyon kiti kullanarak onları arındırmak. 3 µg plazmid kullanın; 3 µL Bbsben; 1 µL FastAP; Sindirim arabellek x 5 µL 10; Toplam hacim için 50 µL getirmek için GKD₂O ekleyin.
   3. Fazdan ve her çifti aşağıdaki reaktifleri (10 µL toplam hacim) kullanarak sgRNA oligos tavlamak: 1 µL özelleştirilmiş anlamda oligo (100 mM); 1 µL özelleştirilmiş antianlamlı oligo (100 mM); T4 ligasyonu arabellek x 1 µL 10; 6.5 µL GKD₂O; 0.5 ΜL T4 PNK. Bir termo-cycler 37 ° C'de 30 dk için kuluçkaya ve 95 ° C ve 25 ° C 5 ° C/dk aşağı rampa 5 dak.
   4. Aşağıdaki ligasyonu tepki kadar ayarlayın ve oda sıcaklığında (10 µL toplam hacim) 10 min için kuluçkaya: plazmid sindirilmiş X µL Bbs(50 ng); 1 µL fosforile ve tavlanmış, oligo Dubleks (1: 200 seyreltme); Tüp ligasyonu arabellek x 5 µL 2; x µl GKD₂O; 1 µL hızlı ligaz.
   5. Tüp ligasyonu ürünün 2 µL kimyasal olarak yetkili DH5α Escherichia coli hücreleri 50 µL ekleyin. Kuluçka buz üzerinde 30 dk sonra ısı şok 90 için örnek s 42 ° C'de ve buz üzerinde 2 min için kuluçkaya. LB orta 100 µL ekleyin ve 100 µg/mL ampisilin içeren bir LB tabağa plakası.
      Not: PU6-sgRNA-Cbh-Cre plazmid içine sgRNA sıra entegrasyonu pX330 plazmid¹⁴için klonlama adımları göre gerçekleştirilir.
   6. Her 2 ml LB orta 37 ° c 6 h, en az iki kolonileri aşılamak ve bir mini hazırlık DNA izolasyon bir seti kullanarak gerçekleştirebilirsiniz.
   7. Sanger hU6 ileri astar kullanarak mini hazırlık DNA dizisi ve koloniler sgRNAs doğru yerleştirilmesi ile 1.2.1 adımda gösterilen sıra ile hizalayarak tanımlar. Astar sıra Tablo 1' de gösterilen. Bu çalışmada kullanılan plazmid olarak pU6-sgTop2b-1-Cbh-Cre, pU6-sgTop2b-2-Cbh-Cre ve pU6-sgControl-Cbh-Cre seçilmiştir.
   8. Doğru tespit kolonileri aşılamak ve rahim içinde çoğalmasıyla bir kit, Örneğin, QIAGEN üzerinden kullanarak için endotoksin-Alerjik plazmid DNA arındırmak. DNA endotoksin-Alerjik TE-GKD₂içinde O 1:10 (% 10 TE arabellek) seyreltilmiş arabellek ile elute. Plazmid DNA konsantrasyon 2 mg/mL yüksek olması gerekir.
      Not: normal bir maxi-hazırlık seti DNA hazırlık için kullanmayın. Plazmid-çözümleri için kısa süreli kullanım (4 hafta) veya aliquot 4 ° C'de yaklaşık 25 µL uygun bir hacmi depolamak ve uzun süreli depolama için-20 ° C'de tutun.

2. EGxxFP plazmid sistemi kullanarak sgRNAs etkinliğini test

Not: SgRNAs verimliliğini normalde Surveyor veya T7E1 tarafından test edilmiştir (T7 endonükleaz ben) deneyleri. Bu protokol için kolay ve verimli alternatif bir yaklaşım kullanılır. Bu yaklaşımın anahtar sitesi¹⁷hedefleme sgRNA içeren bir DNA dizisi tarafından ayrılmış örtüşen EGFP parçaları içeren pCAG-EGxxFP plazmid kullanmaktır. PCAG-EGxxFP ile birlikte sgRNA ve Cas9 transfected hücrelerdeki ifadesi, hangi EGFP ifade reconstitutes Çift Kişilik strand Cas9-aracılı ara (DSB) hedef ile endojen Homoloji-bağımlı mekanizmaları tarafından onarıldı kaset.

1. Astar sgRNA dizileri hedefleme merkezli genomik bölge yükseltmek için tasarım. PCR amplicon yaklaşık 500 olduğunu bp. Bu deneyde, bir DNA derleme PCR güçlendirilmiş bir parçası pCAG-EGxxFP plazmid clone uygulandı.
   Not: Alternatif olarak, 5' sonu PCR astar için uygun kısıtlama siteleri eklenebilir. Kullanılabilir kısıtlama pCAG-EGxxFP vektör BamHI, NheI, PstI, SalI, EcoRI ve EcoRV sitelerdir.
2. Genomik DNA PCR parametreleri aşağıdaki ve formu kullanarak tasarlanmış astar ile yükseltmek. Örnek yük (19,7 µL H₂O; 0.3 10 µL ng/µL fare genomik DNA; 2.5 µL 10 µM EGxxFP-Top2b-F; 2.5 µL 10 µM EGxxFP-Top2b-R; 25 µL PCR ana mix X 2; 50 µL toplam hacim) % 1'özel üzerine jel ve jel bir jel-ekstraksiyon kiti kullanarak PCR parçaları arındırmak. Aşağıdaki reaksiyon koşulları: 95 ° C 3 dakikadır kullanın; o zaman 35 x devredir 98 ° c 20 s, 60 ° C 15 s, 72 ° C 20 s ve 72 ° C için 1 dk; 4 ° C, süresiz olarak.
   Not: Bu deneyde, bir bölgede Top2b exon 1 güçlendirilmiş; Tablo 1' de astar dizileri bulamadı.
3. BamHI ve örnek % 1'özel üzerine yük EcoRI sonra 37 ° c 2 h enzimleri ile pCAG-EGxxFP vektör jel ve jel bir jel-ekstraksiyon kiti kullanarak vektör omurga arındırmak Digest. Aşağıdaki reaktifleri (50 µL toplam hacim) kullanın: X µL plazmid (3 µg); 2 µL BamHI; 2 µL EcoRI; 5 µL 10 x arabellek; x µl GKD₂O.
4. Üreticinin yönergelerine göre DNA derleme tepki¹⁸ ayarlayın ve DH5α yetkili E. colidönüşümü.
5. İki kolonileri aşılamak, içinde her 2 mL LB orta 37 ° c 6 h, en az bir kit, Örneğin, QIAGEN, üzerinden kullanarak bir mini hazırlık DNA yalıtım yapmak ve doğru ekleme (bundan sonra pCAG-örneğin-Top2b-FP anılacaktır) ile kolonileri belirlemek Sanger kullanarak EGxxFP-Top2b-F astar ile sıralama.
6. HEK293T hücre transfect.
   1. Tohum HEK293T hücrelere bir 24-şey plaka transfection önce 24 saat.
      Not: Hücreleri 37 ° C hücre kuluçka makinesine ile % 5 CO_2, DMEM içinde glutamine ek %10 FBS ve % 1'i içeren kültürlü penisilin/streptomisin. Hücreleri transfection gününde % 60 birleşmesi olduğundan emin olun. Bu deneyde, pU6-sgRNA-Cbh-Cre sınamak için stabil SpCas9 ifade kendi kendine yapılan HEK293T hücreleri kullanılır. Ancak, wildtype HEK293T hücreleri bir SpCas9 ifade vektör varsa kullanılabilir.
   2. Polyethylenimine (PEI) reaktif kullanarak HEK293T hücre transfect. 120 ng/iyi pCAG-örneğin-Top2b-FP plazmid¹² hücrelerle ve 120 ng/iyi pU6-sgTop2b-1-Cbh-Cre veya pU6-sgTop2b-2-Cbh-Cre bir 24-şey plaka transfect. Plazmid DNA'lar mix ve glutamin ile unsupplemented DMEM orta 80 µL PEI reaktif 1.8 µL ek ve oda sıcaklığında 15 dakika sonra vortexing kuluçkaya.
   3. 6 h transfection sonra orta kaldırın ve taze orta ile değiştirin.
   4. 20 x büyütme oranında bir floresan mikroskop kullanarak transfection sonra canlı GFP⁺ hücreleri 48 h varlığı izlemek.
      Not: SgRNA hedefleme verimliliğini GFP⁺ hücre sayısını gösterir. Etkin ve etkili-sgRNAs sonuçlarını (sgTop2b-1 ve sgTop2b-2, sırasıyla) Şekil 2Agösterilir.

3. rahim içinde Elektroporasyon gerçekleştirmek

1. 6-8-hafta-yaşlı fareler doğurmak ve araçları rahim içinde adım için hazır olun. Erkek homozigoz Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP çapraz kadın CD-1 fareler ile fareler. (E0.5) CD-1 fareler vajinal fişi günden itibaren gebelik algılanan süresi. Embriyo electroporated gün E13.5 vardır.
   1. Borosilikat cam kılcal çekin (iç çapı: 0,6-0,8 mm) ile bir micropipette çektirmenin. Aşağıdaki ayarları kullanın: P = 500, ısı 560, çekme = 150, Vel = = 75, saat = 250. Kapiller ucu enjeksiyon sırasında daha iyi görselleştirme için siyah mürekkep ile etiketleyin. Kapiller konik bir cetvel kullanarak bir stereomicroscope altında döşeme ve iğne cımbız keskin ve yaklaşık 6 mm uzunluğunda ucunda trim.
   2. Deneme tekrarlanabilir tutmak için kılcal birlik korumak. Tek taraflı eğimli kenarı bölünmesi sırasında oluşturun. Ucunu kolay nüfuz rahim duvarı ve embriyo doku hasarı önlemek için mümkün olduğunca gibi keskin olmalıdır.
      Not: Alternatif olarak, bir 35 ° açı¹⁹ayarlamak için bir mikro öğütücü kullanın. Kılcal 10 cm Petri kabına patojen-Alerjik koşullar altında oda sıcaklığında muhafaza edilebilir.
   3. Otoklav cerrahi aletler.
   4. SgRNA-plazmid eşit parçaya pT2K-IRES-Luc için en az 1 µg/µL her plazmid ve renk için son bir konsantrasyon ile plazmid çözüm hızlı yeşil (son konsantrasyonu % 0.05) ile karıştırın. Distile su endotoksin-alerjik ve filtre ile hisse senedi çözüm %1 hızlı yeşil boya parçacıkları çözümden kaldırmak için 0,22 µm filtresi ile hazır olun.
      Not: Co transfection pT2K IRES-Luc isteğe bağlıdır ancak bioluminescence Imaging'i kullanma doğumdan sonra uygun electroporated hayvanların tanımlanması için sağlar. Adım 3.5 bakınız. Plazmid-mix yeterli miktarda ameliyat olmak için hamile fareler toplam sayısı için hazırlayın. Hakkında kullanın fare 15-20 µL mix (~ 12 embriyo). Hemen ameliyat ile devam edin.
2. Fareler ameliyat için hazırlayın.
   1. Hamile CD-1 fareler isoflurane ile anestezi. Anestezi kutusundaki metinle 3-4 vol % isoflurane teşvik (oksijen akış hızı: 1, 5 L/dak) ve burun konisi ile ameliyat sırasında 2 vol-% ile sürdürmek.
      Not: Tam cerrahi uzun almamalıdır 30 dk. azaltmak sayısından enjekte ve electroporated embriyo, gerekirse. Steril eldiven ameliyat için kullanın.
   2. Sırtında bir Isıtma yastık üzerinde fareyi getirin ve anestezi ayarlayın.
   3. Analjezik enjekte (Metamizol, 800 mg/kg vücut ağırlığı, subkutan (SC), 24 h depo).
      Not: Diğer yetkili analjezikler Metamizol daha kullanabilir.
   4. Ameliyat sırasında göz kuruluğu önlemek için göz merhem uygulamak.
   5. Bacaklarda bant ile düzeltmek ve karın bir dezenfektan ile sterilize. Fare sadece cerrahi alan maruz bırakarak gazlı bez ile kapak. % 70 etanol cerrahi alan ve gazlı bez yayıldı.
   6. Uzunluğu yaklaşık 2 cm cilt kesi yapmak ve boşluğu yavaşça skalpel makasla genişletmek. Bulun linea alba ve doku kullanarak periton ile biraz daha küçük bir ikinci giriş makas künt ucu ile yapmak.
   7. Açılan karın boşluğu önceden ısıtılmış steril 1 ile nemlendirin PBS x.
   8. Dikkatli bir şekilde rahim boynuzları halka forseps kullanarak Karın boşluğundan ayıklayın. İki komşu embriyo sarısı sacs arasındaki boşluğu sadece rahim duvarı tarafından kapma yavaşça çekin. Embriyo üzerinde herhangi bir baskı belgili tanımlık kesme kablolarıylaberaber kaçının. Belgili tanımlık kesme gerekirse büyütmek ve uterin arter yoluyla kan akışını sıkıştırmak değil iken karın üzerine rahim boynuzları konumlandırmak için ekstra dikkat.
      Not: bazı durumlarda, bu bir rahim boynuz teker teker ayıklamak ve ikinci rahim boynuz işlemine devam etmeden önce değiştirmek için tavsiye edilir.
3. Enjeksiyon ve plazmid DNA'lar Elektroporasyon
   1. Yaklaşık 15 µL renkli plazmid-çözüm hazır cam kapiller ile Aspire edin. Bu işlem sırasında herhangi bir hava kabarcıkları kaçının.
      Not: Eğer onun konsantrasyonu yüksek plazmid çözüm ucu kolayca yapışmasına neden olabilir. Kılcal bazı DNA enjeksiyon önce serbest bırakarak sınayın.
   2. Yavaşça embriyo halka forseps ile tutun ve boyun bölgesi bulun.
      Not: embriyo enjekte etmek zor durumda ise, o atlayın ve sonraki embriyo için gidin. Artan embriyo yeniden konumlandırma onlara zarar şansını artırabilir.
   3. Yavaş yavaş dorsal arka beyin delici tarafından önceden hazırlanmış cam kapiller ucu ile dördüncü ventrikül işlemek ve daha sonra yaklaşık 1 µL plazmid karışımı enjekte. Boyalı DNA beyinden sızdırılmış değil ve bir elmas şeklindeki yapısı görülebilir emin olun.
      Not: isteğe bağlı olarak, 2.5-fold Büyüteç gözlük dördüncü ventrikül daha iyi görselleştirme için kullanın ve çevreleyen kan damarları. Sonra hemen enjeksiyon difüzyon plazmid çözümünün diğer ventrikül önlemek için elektrik darbeleri teslim.
   4. Elektrik kare bakliyat geçerlidir (5 Bakliyat, 32 mV, 50 ms-on, 950 ms-off) forseps benzeri platin cımbız (bkz: Malzemeler tablo) ile. Elektrotlar yanal kulak ve serebellar primordium rahim duvarı konumlandırılmış pozitif Kutbu kapsayan negatif kutup ile yer. 5 mm çapında elektrot plakaları E13.5 embriyo etkili Elektroporasyon için kullanın.
      Not: embriyo dam başına toplam sayısının 2/3'den az^rd manipüle ederek kurtulma ve yavrularını artırın. Embriyo çok yakın rahim için kaçının. Manipüle, Doğum sırasında komplikasyonlara neden ve tüm çöp tehlikeye olabilir. Elektrotlar çok Eğer embriyo'nın kalbine yakın bu kalp krizine neden olabilir.
4. Post-Elektroporasyon ve ameliyat sonrası bakım
   1. Dikkatli bir şekilde rahim boynuzları karın boşluğuna yerleştirin ve dolgu ile önceden steril 1 ısındı PBS x. Doğal bir pozisyon içine rahim boynuzları slayt izin.
   2. Ayrıca basit sürekli dikiş ile cilt Karın zarını kapatın.
      Not: rahim duvarı delip Karın zarını dikiş zaman değil ekstra dikkat.
   3. Anestezi kapatma ve hayvanın karın aşağı yeni bir kafesin içine yerleştirin.
   4. Hayvan uyanık faz ve 24 h sırasında tekrar ameliyattan sonra izlemek. Isıtma lambası altında belgili tanımlık kafes, titreyen içinde bir 15 dk zaman dilimi düzelmezse ve hayvan tımar başlamıyor koyun.
   5. Başarılı Elektroporasyon luciferase görüntüleme tarafından onaylayın.
      1. İşletilen barajlar anda (E19.5) embriyo bırakın emin olun.
         Not: Doğum tarihi için ertesi gün muhtemelen işlemi nedeniyle gecikebilir.
      2. Electroporated yavruları (P5-P7) % 2.5 isoflurane ile anestezi ve (mayi (IP)) D-biyoluminesans (3 mg/kg vücut ağırlığı) ile 5 dk önce görüntüleme enjekte.
      3. Luciferase sinyalleri bioluminescence Imager kullanarak electroporated pups içinde algılamak.
         Not: 1 dk pozlama süresi luciferase sinyal tespit etmek yeterli olur. Parlaklık (p/s/cm²/sr) olduğunu yaklaşık > 1 x 10⁶.

4. Electroporated Cerebella Cryosections hazırlamak

1. Electroporated P7 pups ötenazi ve beyincik incelemek.
   Not: Bir epifluorescent stereoscope kullanarak GFP sinyal görülebilmektedir.
2. Cerebella gecede beyin % 4'lük başına 5 mL fix PFA PBS 4 ° C'de içinde
3. Sabit cerebella geceleme 4 ° C'de % 30 sükroz PBS içinde beyin başına 10 mL transfer
   Not: Doku kuluçka sükroz çözümde sonra bir 15 mL tüp alt ulaştırılması gerekmektedir.
4. Bir parça selüloz filtre kağıdı ile kalan sükroz çözüm iliklerine kadar sonra bir en uygun kesme sıcaklık (OCT) bir tek kullanımlık plastik kalıp içine bileşik beyincik bırakın ve kuru buza dondur. Kriyojenik blok kadar kullanmak-80 ° C'de muhafaza edilebilir.
   Not: Protokol burada duraklatılmış.
5. Bir cryostat kullanarak kalınlığı 10 µm bölümlerle kriyojenik blok oyulmuş ve bölümleri-80 ° C'de kullanımda kadar devam.
   Not: Bir OKT PBS ile bileşik yıkama sonra GFP ifade, bölümlerde onaylayabilirsiniz.

5. Cryosections Immunostaining

1. Slaytlar için 30 dk room temperature ve yıkama PBS 10 min için iki kez kuru.
2. Bölümleri sıvı engelleyici kalemle daire ve engelleme bir çözüm bölümlerde kuluçkaya (% 10 normal eşek serum içinde % 0,1 içeren PBS Triton-X100) Oda sıcaklığında 1 h için.
3. Birincil antikorlar karşı molekülleri (Örneğin, GFP ve topoizomeraz II beta (Top2B) Bu çalışmada) ilgi engelleme çözüm ekleyin ve bir gecede 4 ° C'de kuluçkaya
   Not: Tablo malzemelerkullanılan antikor konsantrasyonları ve adları listelenir. GFP sinyalleri geliştirmek için bir anti-GFP antikor isteğe bağlı olarak diğer antikorlar ile birlikte kullanılabilir.
4. 10 dk. Incubate için %0,1 PBST 3 X Triton içeren slaytlarla oda sıcaklığında 1 h için bölümleri bir fluorophore Birleşik ikincil antikor DAPI içeren engelleme çözümde seyreltilmiş yıkayın.
5. PBS 3 X 10 dk. Mount için slaytları slaytlar yıkama ve 4 ° C'de görüntüleme kadar tutun.
   Not: Protokol burada duraklatılmış.

6. görüntüleme ve çözümleme

1. 20 x büyütme oranında confocal mikroskop kullanma bölümlerine görüntü.
2. GFP pozitif hücrelerinin ifade hedef protein kaybetme saymak. Temsili resim Şekil 2Biçinde gösterilir.
3. Üzerine ablasyon GNPs ve onların ettiklerinizden hedef genlerin moleküler fenotip immuostaining¹²ile kontrol edin.

Results

Vivo fonksiyonel analiz için eksojen gene(s) içine girmiştik hücrelerini tanımlamak için önemlidir. GFP sigara Proliferasyona hücrelerdeki uzun süre takip gibi bir işaretleyici ifade, sinyal sırayla Proliferasyona hücrelerde kayboluyor. Bu efekt bir çizimi Şekil 1' de gösterilmiştir. Ayak izi LOF analizlerde transfected hücrelerinin kaybetme aşmak için biz Elektroporasyon tabanlı gen teslim CRISPR/Cas9 teknoloji ile birleştirerek yeni bir yaklaşım ge...

Discussion

Exo utero Elektroporasyon kullanarak, daha önce Atoh1 in vivo siRNA tabanlı fonksiyonel analizleri serebellar granül erken bir aşamada farklılaşma⁸hücre bildirdin. SiRNA seyreltme/bozulma ve embriyoların rahim duvarı dışında maruz kalma nedeniyle, fenotipik analiz electroporated granül hücre embriyonik aşamada sınırlıydı. Ancak, geçerli yöntem postnatal hayvanların fenotip analizini etkin.

Bizim önceki çalışma tümör baskılayıcı Ptch1 rahim...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa 488 Keçi anti-Tavuk	ThermoFisher	A11039	1:400 seyreltme
Alexa 568 Eşek Anti-Fare Yaşam Teknolojileri		A-10037	1:400 seyreltme
Alexa 594 Eşek anti-Tavşan	ThermoFisher	A21207	1:400 seyreltme
Alexa 647 Eşek anti-Tavşan Yaşam	Teknolojileri	A31573	1:400 seyreltme
Alkali Fosfataz (FastAP)	ThermoFisher	EF0654
Otoklav bandı	Kisker Biotech	150262
BamHI (HF)	NEB	R3136S
BbsI (FastDigest)	ThermoFisher	FD1014
Selüloz Filtre Kağıdı (Whatman)	Sigma-Aldrich	WHA10347525
Bezi	Tork	530378
Konfokal lazer tarama mikroskobu	Zeiss	LSM800
D-Luciferin	biovision	7903-1
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542	1:1000 seyreltme
Tek kullanımlık plastik kalıplar (Tissue-Tek Cyromold)	VWR	4566
DMEM Glutamax	ThermoFisher	31966047
Eşek serumu	Sigma-Aldrich	D9663
EcoRI (HF)	NEB	R3101S
Elektro Kare Poratör	BTX	ECM830
Endofree Maxi Kit	Qiagen	12362
Etanol	Merck	107017
Göz merhemi (Bepanthen)	Bayer	81552983
Hızlı Yeşil	Merck	104022
FBS	ThermoFisher	10270-016
Filtre (0.22 & mikro; m)	Merck	F8148
Floresan hücre görüntüleyici (ZOE)	Biorad	1450031
Forseps düz	Güzel Bilim Araçları	91150-20
Gazlı Bez (X100 ES-pedler 8f 10 x 10 cm)	Fisher Scientific	15387311
GFP antikoru	Abcam	ab13970	1:1000 seyreltme
Gibson Assembly Master Mix	NEB	E2611S
Filamentli Cam Kılcal	Narishige	GD1-2
Isıtma Yastığı	ThermoLux	463265 / -67
Görüntü İşleme yazılımı (ImageJ ve Fiji)
şırıngası (B. Braun OMNICAN U-100)	Carl Roth	AKP0.1
Isofluran	Zoetis	TU061219
IVIS Lumina LT Serisi III Kaliper	Perkin Elmer	CLS136331
Kalt Sütür İğneleri	Güzel Bilim Araçları	12050-02
KAPA HIFI HOTSTART HAZIR karışımı	Kapa Biosystems	KK2601
Ki67 antikoru	Abcam	ab15580	1:500 seyreltme
Işık İşaretçisi	Fotonik	PL3000
Sıvı engelleyici kalem	Kisker Biyoteknoloji	MKP-1
Metamizol	WDT-Mikroöğütücü
	Narishige	EG-45
Mikroenjektör	Narishige	IM300
Mikropipet Çektirme	Sutter Instrument Co.	P-97
Mikroskop yazılımı ZEN		Zeiss-Non-steril
İpek Sütür İpliği (0.12 mm)	Güzel Bilim Araçları	18020-50
OCT Bileşik (Doku-Tek)	VWR	4583
p27 antikoru	BD bioscience	610241	1:200 seyreltme
Paraformaldehit	Roth	335.3
PBS ( 1x)	Yaşam Teknolojileri	14190169
pCAG-EGxxFP	Addgene	50716
Polietilenimin	Sigma-Aldrich	408727
pX330 plazmid	Addgene	42230
QIAprep Spin Miniprep Kiti	Qiagen	27104
QIAquick Jel Ekstraksiyon Kiti	Qiagen	28704
Hızlı Ligasyon Kiti	NEB	M2200S
Halka Forseps	Güzel Bilim Araçları	11103-09
Slaytlar (SuperFrost)	ThermoFisher	10417002
Biyoistatistik Yazılımı (Prizma 7)	GraphPad Yazılımı,	Inc-Spitacid
	EcoLab	3003840
Stereomikroskop	Nikon	C-PS
Sucrose	Sigma-Aldrich	S5016
Cerrahi makas	Güzel Bilim Araçları	91460-11
Künt uçlu cerrahi makas	Güzel Bilim Araçları	14072-10
Sütür (Supramid schwarz DS 16, 1.5 (4/0))	SMI	220340
T4 DNA Ligasyon Tamponu	NEB	B0202S
T4 PNK	NEB	M0201S
Doku makası Künt (11,5 cm)	Güzel Bilim Araçları	14072-10
TOP2B antikoru	Santa Cruz	sc13059	1:200 seyreltme
Tripsin (%2,5)	ThermoFisher	15090046
Cımbız, 5 mm ve Oslash ile; disk elektrotları Platinum	Xceltis GmbH	CUY650P5
Buharlaştırıcı	Drä gerwerk AG	GS186