Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

İnsan Pluripotent kök hücre kültürü ile Xeno-Alerjik koşullar altında değişik sertlik polivinil alkol-Co-İtakonik asit Hydrogels

8.5K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/57314

⸱

3 Şubat 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemical and Materials Engineering, National Central University, 2Department of Botany and Microbiology, King Saud University, 3Cathay Medical Research Institute, Cathay General Hospital, 4Graduate Institute of Systems Biology and Bioinformatics, National Central University, 5Department of Medical Microbiology and Parasitology, Universiti Putra Malaysia, 6Department of Internal Medicine, Taiwan Landseed Hospital, 7Department of Zoology, Bharathiar University, 8Thiruvalluvar University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Bir protokol olan ve olmayan oligopeptides, biyomalzemeler farklılaşması üzerine sertliği etkisini ve yayılması araştırmak için aşılı değişen sertlik ile polivinil alkol-co-İtakonik asit hydrogels hazırlamak için sunulan kök hücreler. Hydrogels sertliği crosslinking zaman tarafından kontrol ediliyordu.

Özet

Biyomalzeme yayılması üzerine sertliği ve kök hücre, farklılaşma gibi fiziksel yardımlar etkisi çeşitli araştırmacılar tarafından araştırmış. Ancak, çoğu bu müfettişler çalışmalarına kök hücre kültüründe polyacrylamide hydrogels kullanılmaktadır. Bu nedenle, bu sonuçlar polyacrylamide belirli özellikleri ve Biyomalzeme fiziksel işaret (sertlik) kaynaklı çünkü onların sonuçları tartışmalı. Burada, biz nerede çeşitli kök, insan embriyonik kök (ES) hücre de dahil olmak üzere hücreleri ve İnsan İndüklenmiş pluripotent kök (IPS) hücreler, kültürlü polyacrylamide üzerinde temel almayan hydrogels hazırlanması için bir protokol tanımlamak. Hydrogels değişen sertlik ile bioinert polivinil alkol-co-İtakonik asit (P-IA) crosslinking zaman değiştirerek crosslinking derecesi tarafından kontrol edilen sertlik ile hazırlanmıştır. Ve hücre dışı matriks türetilmiş oligopeptides olmadan aşılı P-IA hydrogels kök hücre kültür ve farklılaşma için gelecek bir platform olarak araştırıldı. Kültür ve amniyotik sıvı kök hücre, kök hücre yağ elde edilen, insan ES hücreleri ve insan IP'leri hücreleri ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Chowing P-IA hydrogels sertlik özelliklerini tarafından indüklenen üstün performans gösterdi. Bu iletişim kuralı biomaterial, sertlik özelliklerini ve son olarak, kök hücre kader xeno-Alerjik kültür koşul kullanma üzerindeki etkilerini kontrol ile birlikte onların yüzey işleme sentezi bildirir. Son çalışmalar üzerinde bağlı olarak, değiştirilmiş gibi yüzeylerde desteklemek ve farklı bağlantılar için farklı kök hücre satır kaderi yönlendirmek için gelecekteki platformlar olarak işlev görebilir; ve ayrıca, yeniden ve kayıp organ veya doku işlevlerini geri yüklemek.

Giriş

Kök hücre farklılaşması hücre ve kök hücreleri, özellikle İnsan İndüklenmiş pluripotent (IPS) hücreleri ve insan embriyonik kök (ES) hücreleri, uzun vadeli yayılması belirli bir soy içine kaderi inhibitörleri, büyüme faktörleri, düzenlenmiş olması bilinmektedir ve / ya da küçük biyoaktif moleküller kültür medya. Son zamanlarda, biyomalzemeler, özellikle hücre kültür Biyomalzeme, sertliği fiziksel ipuçları kök hücre çoğalması ve farklılaşma1,2kaderi rehberlik önemli bir faktör olarak kabul edilmiştir, 3,4,5,6. Bu nedenle, çeşitli araştırmacılar kök hücre farklılaşması, üzerine hydrogels üzerinde kültürlü, kaderi araştırmak esas olarak polyacrylamide hydrogels ile değişen sertlik kullanmaya başlamıştır.

Biyomalzeme sertliği odak yapışıklıklar, hücre morfolojisi, hücre fenotip ve özellikle de iki boyutlu (2B) ekimi1,2,3,5kök hücre adezyon denetleyebilirsiniz. Mekanik algılamalı Biyomalzeme kök hücreleri tarafından genellikle odak yapışma integrin reseptörleri sinyal tarafından kontrol edilir. NMMIIA, nonmuscle myosin IIA-bağımlı contractility aktin sitoiskeleti, 2-B hücre işleme sistemleri3,4,5, kök hücrelerin mechanosensing sürecinde kritik bir rol oynar 7,8,9,10,11.

Engler ve meslektaşları gibi kemik iliği kök (BMS) hücre hücre kültür Biyomalzeme bu belirli dokuların için benzer bir sertlik ile ekili erişkin kök hücreleri kökenli hücrelerine ayırt etmek eğilimindedir ilginç bir fikir geliştirdi belirli doku5. 2-B yumuşak polyacrylamide hydrogels ben (ile beyin dokuları karşılaştırılabilir bir sertlik) genişleme medya kendiliğinden indüklenen erken nöron soy ayırt etmek için üzerinde BMS hücreler kültürlü ise kollajen türüyle kaplı üzerinde BMS hücreleri inkübe hydrogels kas veya kolajen kemik doku, benzer bir sertlik ile erken soy içine farklılaşma miyositler ve dokusunu, sırasıyla, 2-B polyacrylamide hydrogels3,5tarihinde ikna etmek için bulunamadı. Pek çok araştırmacı farklılaşma kök hücre kaderi araştırdık kültürlü polyacrylamide üzerinde kollajen ile immobilize hydrogels tip ı12,13,14,15,16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21.1,bazı çelişkili raporlar belirtilmelidir ancak,18,22,23,24 var Engler tarafından önerilen tanınmış fikir için vd. 5 bunun nedeni Engler'ın fikir5 sadece polyacrylamide hydrogels üzerinde geliştirilmiştir ve sonuçları belirli özelliklerini biomaterial (polyacrylamide) ve değil sadece fiziksel işaret (sertlik) ortaya çıkmış olmasıdır biomaterial. Bu nedenle, hangi-ebilmek var olmak güdümlü sertlik hydrogels polietilenin tarafından hidrojel, başka bir tür geliştirmek önemlidir. Bu amaçla, bioinert hydrogels, polivinil alkol-co-İtakonik asit (P-IA) crosslinking derecesi ile bir değişen crosslinking saat25, tarafından kontrol farklı bir sertlik ile hazırlanmıştır geliştirilmiştir 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32. kök hücreleri ekstrasellüler matrisler (ECMs) ve oligopeptides ile aşılı P-IA hydrogels yanı sıra nonmodified P-IA hydrogels ekili. Bir önceki çalışma25içinde insan hematopoetik kök hücreleri (hHSCs) göbek kordon kanı, P-IA hydrogels üzerinde nerede fibronektin veya bir chowing türetilen 30 kPa depolama modülü 3 kPa arasında değişen farklı sertlik değerleri ile ekili fibronektin (CS1, EILDVPST) P-IA hydrogels aşılı. Yüksek ex vivo hHSCs kat genişlemesi CS1 veya 12 kPa 30 kPa-25arasında değişen bir ara sertlik görüntülenen fibronektin ile aşılı P-IA hydrogels gözlendi.

İnsan ES ve IPS hücre ECMs, vitronectin veya onların pluripotency korumak için laminin gibi belirli bağlama gerektirdiği için insan IP ve ES hücreleri geleneksel doku kültürü polistiren (TCP) yemekleri33,34 üzerinde ekili olamaz uzun vadeli kültür sırasında. Bu nedenle, chowing aşılı P-IA hydrogels en iyi sertlik özelliklere sahip olan birkaç yapılar tasarlanmış ve oluşumları tek bir zinciri, tek bir zinciri ile ortak bir segment, bir çift zincir ortak bir kesimi ve dallı türü ile hazırlanan zincir32. Chowing dizileri ECMs integrin ve glikozaminoglikan bağlayıcı etki alanlarından seçildi. Yaklaşık 25 kPa depolama modülü olan vitronectin elde edilen oligopeptides ile bir çift zincir veya ortak segment, aşılı P-IA hydrogels insan ES ve IPS hücreleri uzun vadeli kültür xeno-Alerjik ve kimyasal altında 12 pasajlar için desteklenen tanımlanmış koşulları32. Ortak segment ve hücre adezyon molekülleri hydrogels üzerinde çift zincirle yayılması kolaylaştırdı ve pluripotency insan ES ve IPS32hücreleri. Burada, P-IA hydrogels (ile 10 kPa bir depolama modül için havada ıslak şartlar altında ölçülen 30 kPa) hazırlanması için bir protokol olan ve olmayan oligopeptides aşılı veya ECMs açıklanmıştır. Nasıl kültür ve birkaç kök hücreleri (amniyotik sıvı kök hücre, kök hücre yağ elde edilen, insan ES hücreleri ve insan IP'leri hücreleri dahil) geçiş gösterilmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu çalışmada deneylerde Tayvan Landseed hastane (IRB / 13 / 05) ve ulusal merkez Üniversitesi etik komiteleri tarafından kabul edildi. Tüm deneyler bu çalışma sırasında tüm alakalı ve uygun hükümet ve kurumsal kurallara ve düzenlemelere uygun şekilde yapılmıştır.

1. çözüm ve medyası hazırlama

  1. Polimer arıtma
    1. P-IA karboksilik asit grubunun derecesi ile hidroliz ile arındırmak > %96,5 P-IA etanol ile yıkama tarafından. Bir 500 mL konik ölçek P-id 20 g 200 mL etanol içine yerleştirin ve her 8-10 h 24-30 h. Exchange ile taze etanol etanol için manyetik karıştırıcı üzerinde tahrik.
    2. P-id etanol tarafından filtrasyon Büchner huni kullanarak kaldırın.
    3. P-IA vakum kurutma için 24 saat oda sıcaklığında tarafından kuru.
      Not: tuzak etanol P-IA. üzerinden büyük miktarda çıkarıldıktan sonra tıkalı olma eğilimindedir çünkü bu tuzak vakum kurutma sistemi (etanol kaldırma tarafından) sık sık, özellikle ilk birkaç saat sırasında temizlemek için tavsiye edilir
  2. P-IA çözüm hazırlanması
    Not: polimer yavaşça çözücü (su) ekleyebilirsiniz. Bu P-IA çözücü eklemek için en az 15 dk almak için tavsiye edilir. Çözücü polimer eklediyseniz, polimer tamamen çözülmüş değil. Patlayıcı P-IA çözümü kaynama oluşturmamanız için dikkatli olun. P-IA çözüm hazırlanması sırasında koruyucu gözlük kullanın. P-IA çözüm Isıtma işlemi kristal P-IA. çözülmeye esastır Önerilen (ve tercih edilir) P-IA çözüm nispeten temiz deneysel bir odada, mümkünse hazırlamak için.
    1. P-IA 0,050 ağırlığı % konsantrasyon hücre ekimi deneme için veya bir 0,50 ağırlığı % konsantrasyon rheometer ölçüm için saf suda çözülür: Örneğin, P-IA 50 mg 100 mL saf su için hücre kültürü ve P-IA 500 mg 100 ml de dağıtılması iyonize (DI) su rheometer ölçümler için.
    2. Sıcak plaka üzerinde 1 h için P-IA çözüm tahrik.
      Not: patlayıcı kaynar önlemek için çözüm üzerinde 95 ° c ısı değil Patlayıcı polimer çözüm yüksek bir ısıda kaynama cilt yanıkları oluşturabilir. Bu nedenle, P-IA Isıtma çok dikkatli bir şekilde gerçekleştirmek ve P-IA çözüm sıcaklığını Isıtma sırasında izleyebilirsiniz.
    3. P-IA çözüm ortam sıcaklığında soğutmalı sonra P-IA çözüm 48 h. bırak sıcak P-IA çözüm Isıtma olmadan sıcak tabakta için oda sıcaklığında kışkırtmak ve sonra olmadan ajitasyon, oda sıcaklığında 20-24 h hava kabarcıkları olduğundan emin olmak için bırakın P-IA çözümde mevcut değil.
  3. Crosslinking çözüm hazırlanması
    1. Crosslinking çözüm 1.0 ağırlık % oxazolidin %25 sulu oxazolidin çözüm oluşturmak olsun, %20.0 Na2kilo kadar%4 99 kullanımı > saflık ve 1.0 ağırlık % H2kadar4. Örneğin, bir 6 veya 12 için hücre kültür tabak iyi, oxazolidin çözüm, 2 g sodyum sülfat ve sülfürik asit 100 µL 100 µL 10 mL saf su ekleyin.
  4. İnsan ES/PS hücre kültür medya
    Not: Kullanım DMEM/F12 medya, temel 6 medya ve hücre kültürü için temel 8 medya.
    1. 50 X temel 8 özel sayı: çözüm için yavaş yavaş gecede 4 ° C buzdolabında çözdürme tarafından dondurulmuş dönün.
    2. 50 X temel 8 özel sayı: temel 8 Bazal medya bir şişe içine bir şişe ekleyin. Küçük aliquots (50 mL her) 100 mL aralıklarla tüpler içine medya ayrı sonra medya-20 ° C'de depolayın

2. P-IA hidrojel yemek hazırlama

  1. P-IA film hazırlık
    1. 1 mL aliquot P-IA çözümün bir 35 mm TCP tabak içine enjekte ve temiz bir Bank bir P-IA film için 2 gün 45 ° C fırında Bulaşık Makinası.
  2. P-IA hidrojel yemekleri polietilenin
    1. P-IA filmleri 0.5, 1, 2, 4, 6, 12, 24 ve 48 saat için bir sulu crosslinking çözüm içine bırakın.
      Not: ' P-IA -X' P-IA hidrojel çapraz X h (örneğin, 12 h) için (örneğin, P-IA-12 h) başvurur.
    2. Crosslinking sonra ortam sıcaklığında P-IA hydrogels saf su ile durulayın ve daha sonra temiz bir Bank ortam sıcaklığında saf suda hydrogels tutmak.
    3. P-IA hydrogels 1 dk bir 75,0 volume/volume% etanol çözümde daldırma tarafından sterilize etmek, altı kez P-IA hydrogels saf suda yıkayın ve sonra P-IA hydrogels hücre tarım için kullanılan kadar saf su bulundurun.
  3. P-IA hidrojel yemekleri chowing veya ECM ile aşılı hazırlanması
    1. P-IA hydrogels 1 mL daldırma 10 mg/mL N-(3-Dimethylaminopropyl) - içeren sulu bir çözüm üzerinden etkinleştirinN'- ethylcarbodiimide hidroklorid (EDC) ve 10 mg/mL N- hydroxysuccinimide (NHS) 1 37 ° C veya 4 h s 4 ° C'de
    2. Durulama fosfat 1 mL ile P-IA hydrogels tamponlu tuz (PBS, pH 7.2) 3 kez ve P-IA hydrogels 4 ° C'de 24 h için chowing (100-1.500 µg/mL) veya ECM (10-100 µg/mL) 1 mL içeren bir PBS çözümde bırakın
      Not: Chowing dizileri ve kök hücre kültürü için kullanılan ECMs Tablo 1' de özetlenmiştir.
    3. Chowing veya ECM aşılama sonra 3 kez P-IA hydrogels saf su ile yıkayın.
      Not: Y µg/mL ile chowing veya ECM (Z) aşılı P-IA hydrogels bundan sonra P olarak adlandırılır-IA -Xh -Z veyaBurada X crosslinking saat (h) gösterir, P-IA-Xh -Z-Y, Y gösterir chowing veya ECM, konsantrasyon ve Z farklı chowing veya ECM gösterir.

3. insan ES/IPS hücre kültürü

  1. Geçit ve farklılaşmamış insan ES ve IPS hücreleri bakım yöntemi
    1. İnsan ES (örneğin, WA09 veya H9) korumak hücreleri veya insan IP'leri (örneğin, HS0077) temel 8 medya standart insan ES/IPS kullanarak 6 cm yemekler Matrigel üzerinde hücreleri hücre kültür protokolleri28,32.
    2. Kuluçkaya birleşmesi yakınındaki insan ES/IPS hücrelerle 2.0 mg/mL dispase II DMEM/F-12 medya için 8-10 dk. 37 ° C'de ve insan ES/IPS hücreleri iki kez DMEM/F12 medya ile durulayın.
    3. DMEM/F-12 medya insan ES/IPS hücre kültür yemekleri, 2 mL ilavesi ayırdıktan sonra hücre kazıyıcı kullanarak zayıf yapisan kolonileri ya da pipetting tarafından.
    4. 15 mL aralıklarla tüpler içine insan ES/IPS hücreleri toplamak ve 37 ° C'de 5 min için 160 × g de insan ES/IPS hücreleri santrifüj kapasitesi
    5. Santrifüjü sonra DMEM/F12 atmak ve 1 mL E8 medya insan ES/IPS hücrelerinde askıya alma ve sonra hücre yoğunluğu saymak için bir hücre karşı kullanma.
    6. ES/IPS hücreleri içine yeni kültür yemekler (P-IA hydrogels chowing veya ECM ile aşılı) uygun yoğunluk ayarı (x 104 hücreleri cm2 passaging için ya da belirtildiği gibi başına 1-5) sonra aşılamak.

4. insan ES/IPS hücre karakterizasyonu karakterizasyonu

  1. Alkalen fosfataz (AP) etkinliği değerlendirilmesi
    1. Standart alkalin fosfataz Canlı Boyama kullanarak insan ES/IPS hücreleri alkalen fosfataz (AP) etkinliğini ölçmek.
  2. Immunostaining
    1. Tra-1-81, SSEA-4, Sox2 ve Oct3/4 immunostaining hES ve kalça hücreleri üzerinde geleneksel iletişim kuralı28,32takip pluripotency araştırmak için gerçekleştirin.
    2. Hangi insan ES/IPS hücreler kültürlü ve daha sonra yemekler 4 ° C'de hücreler düzeltmek için 15 dakika kuluçkaya 24 her iyi çanak içine %4 (birim/birim) paraformaldehyde 0.5 mL hacmi ekleyin.
    3. Her şey paraformaldehyde çözümden Aspire edin. Daha sonra PBS 1 mL de başına ekleyin ve hücreleri durulama için PBS Aspire edin. Yıkama işlemi 3 kez uygulayın.
    4. Hücre zarlarında % 0,3 (birim/birim) PBS Triton-X 100 çözümde, oda sıcaklığında 30 dk için 0.5 mL ekleyerek permeabilize.
    5. Triton-X 100 çözüm Aspire edin ve %2 (ağırlık/hacim) sığır serum albumin (BSA) 300 µL PBS (arabellek kütük parçası) her kuyunun içine ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dk için kuluçkaya.
    6. Pipetting tarafından engelleme arabellek kaldırın ve daha sonra istediğiniz birincil antikorlar ekleyin (Oct3/4 (1: 200), Sox2 (1: 200), SSEA-4 (1: 200) ve Tra-1-81(1:200) tarafından pipet, bkz: Tablo 2) burada 1: 200 gösterir antikorlar seyreltilmiş her kuyuya PBS ile 200-fold ve bir gün 4 ° C'de inkübe
    7. Birincil antikor çözüm Aspire edin ve %0,05 300 µL hücrelerle yıkayın ara 20 PBS çözüm 3 kat, oda sıcaklığında.
    8. İkincil antikorların 300 µL ekleyin (1: 200, Tablo 2' ye bakın), birincil IgG alt türü için belirli olan, %2 (ağırlık/hacim) BSA çözümünde her şey ve karanlık oda sıcaklığında 1 h için kuluçkaya.
    9. %0,05 300 µL hücrelerle yıkama ara 20 3 kat, oda sıcaklığında karanlık PBS çözümde.
    10. Lekeli hücreleri floresan mikroskopi veya confocal mikroskobu tarafından analiz.
  3. Embryoid vücut oluşumu
    1. Embryoid vücut (EB) oluşumu, pasajlar 10 ve 20 tarafından insan ES/IPS hücreler Pluripotent araştırmak.
      Not: % 80'i 6-şey tabak içinde EB oluşumu hazırlanması için yeterli görkemlidir.
    2. İnsan ES veya IP'leri hücreleri 2 mL DMEM/F-12 medya ile iki kez durulama ve temel 6 medya 1,5 mL hücrelerde bırakın.
    3. % 80 Konfluent insan ES veya IP'leri hücreleri 200 µL ipuçlarını kullanarak yaklaşık 32 parçalar halinde kesin. Daha sonra bulaşıkları hücrelerinden hücre kazıyıcı kullanarak bağlantısını kesin.
    4. İnsan ES/IPS hücreleri ve transfer bir 6-şey ultralow eki tabak içine toplamak.
    5. Temel 6 medya eski medya pipetting ve 2 günde taze medya ekleme değişimi.
      Not: süspansiyon hücrelerde % 5 CO237 ° C'de 2 hafta kültür.
    6. EBs rastlanılmaması askıya sonra temel 6 medyada, EBs 24-şey TCP yemekleri 0.1 ağırlığı % jelatin ile kaplı kültür aktarmak ve hücrelerin temel 6 medya için ek bir hafta kültür.
    7. İşaretçileri üç embriyonik germline katmanlardan elde edilen hücre karşı antikor hücrelerle leke [AFP (endoderm), GFA (ektoderm), β III-tübülin (ektoderm) ve SMA (mesoderm)] ve yukarıda açıklanan immunostaining yöntemi tarafından hücreleri değerlendirmek.
  4. Teratoma oluşumu
    1. İnsan ES/IPS hücreler Pluripotent teratoma oluşumu, pasajlar 10 ve 20 tarafından araştırmak.
      Not: % 80 izdiham içinde 6-şey plakaları yakınındaki 5 yemekleri teratoma oluşumu için yeterli (en az 3 x 106 hücre teratoma oluşumu deneyler için gerekli).
    2. 2 mL DMEM/F-12 medya hücrelerle iki kez durulayın ve 1.5 mL DMEM/F-12 medya hücre kültür yemekleri için ekleyin.
    3. Yaklaşık % 80'i Konfluent insan ES veya IP'leri hücreleri 200 µL ipuçlarını kullanarak yaklaşık 32 parçalar halinde kesin. Daha sonra bulaşıkları hücrelerinden hücre kazıyıcı kullanarak bağlantısını kesin.
    4. 15 mL aralıklarla tüp içine insan ES/IPS hücreleri toplamak ve 37 ° C'de 5 min için 160 × g de hücreleri santrifüj kapasitesi
    5. Santrifüjü sonra hücre topakları içinde 100 µL askıya DMEM/F12 ve sonra karışımı hücre yemi ile 100 µL Matrigel (1:1 hacim oranı).
    6. Hücre süspansiyon-20 ° C önceden soğutulmuş enjektör aktarın. Enjekte, toplam, en az 3 × 106 hücre subkutan erkek NOD-SCID (başını SALLAMAK. CB17 -Prkdascid/JNarl) fareler (5-8 hafta).
    7. 5-8 hafta sonra teratomas incelemek, %4.0 (ağırlık/hacim) paraformaldehyde çözüm fix ve 4 ° C'de depolayın
    8. Parafin ile teratoma düzeltmek, parafin gömülü teratomas dilim ve leke Hematoksilen ve Eozin (H & E) ile bir standart iletişim kuralı28,32kullanarak.
      Not: Araştırmacılar teratomas dilim parafin gömülü teratomas, parafin ile düzeltmek ve örnek ile H & E, genellikle patoloji Bölümü hastanelerde kullanılan leke için şirket sabit teratoma doku gönderebilir.
  5. İnsan yağ kaynaklı kök (ADS) hücre kültürü
    1. Sıcak kültür medya (DMEM) % 1 antimycotic antibiyotik ve % 10 fetal sığır serum (FBS) içeren, tripsin-EDTA ve PBS %0.25 37 ° c kullanmadan su banyosu önce.
    2. İnsan reklamlar hücreleri tarafından PBS pipetting 10 mL nerede hücreler kültürlü her 6 cm kültür çanak içine yıkayın.
    3. 1 mL tripsin-EDTA çözeltisi (% 0,25) 6-cm kültür yemekleri ekleyin ve 5 min için 37 ° C'de çözüm kuluçkaya.
    4. 6 cm kültür yemekleri hücreler ayrılır onaylamak için mikroskobu altında hücrelerde gözlemlemek.
    5. 15 mL santrifüj tüpüne hücreleri toplamak ve kültür ortamının eşit bir birim eklemek (DMEM % 1 antimycotic antibiyotik ve % 10 içeren FBS) santrifüj tüpü tripsin-EDTA nötralize içine.
    6. 37 ° C'de 5 min için 250 × g de hücreleri santrifüj kapasitesi
    7. Santrifüjü sonra süpernatant dikkatle pipetting tarafından hücre Pelet bozmadan atmak.
    8. Kültür medya hücrelerde resuspend ve sonra hücreleri içine yeni kültür yemekler (P-IA hydrogels ve oligopeptides ve ECM olmadan aşılı) uygun yoğunluğu (5-10 cm2 passaging için ya da belirtildiği gibi başına 103 hücre x), temel olarak belirler.
  6. İnsan amniyotik sıvı kök (AFS) hücre kültürü
    1. Sıcak yetiştirme ortamı (DMEM/MCDB 201 (2:3) içeren %20 fetal sığır serum (FBS), 5 ng/mL bFGF ve % 1 antimycotic antibiyotik), tripsin-EDTA ve PBS %0.25 37 ° c kullanmadan su banyosu önce.
    2. İnsan AFS hücresi tarafından PBS nerede hücreler kültürlü her 6 cm kültür tabağına pipetting 10 mL yıkayın.
    3. 1 mL tripsin-EDTA çözeltisi (% 0,25) 6-cm kültür yemekleri ekleyin ve 5 min için 37 ° C'de hücreler kuluçkaya.
    4. 6-cm kültür yemekleri hücreleri onaylamak için mikroskobu altında hücreler ayrılır gözlemlemek.
    5. 15 mL santrifüj tüpüne hücreleri toplamak ve tripsin-EDTA nötralize etmek için santrifüj tüpüne kültür ortamının (DMEM/MCDB 201 (2:3) içeren % 20 fetal sığır serum (FBS), 5 ng/mL bFGF ve % 1 antimycotic antibiyotik) eşit bir birimi ekleyin.
    6. 37 ° C'de 5 min için 250 × g de hücreleri santrifüj kapasitesi
    7. Santrifüjü sonra süpernatant dikkatle pipetting tarafından hücre Pelet bozmadan atmak.
    8. Yetiştirme ortamı hücrelerde resuspend ve sonra hücreleri içine yeni kültür yemekler (P-IA hydrogels ile ve ezelî chowing ve ECM aşılı) uygun yoğunluğu (5-10 cm2 passaging için ya da belirtildiği gibi başına 103 hücre x), temel olarak belirler.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

P-IA hydrogels ECM kaynaklı chowing (oligoECM) ile aşılı veya ECM farklı elasticities ile hazırlanan tepki düzeni takip ederek şekil 1A', görüldüğü gibi oligoECM (şekil 1B) farklı türleri kullanarak. Hydrogels elasticities uygulanan crosslinking yoğunluğu (zaman) (şekil 1 c) tarafından düzenlenmiş. P-IA hydrogels 25,3 kPa (24 h crosslinking saat) bir depolama modülü olan vitronectin elde edilen oligo...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

P-IA-oligoECM ve P-IA-ECM hydrogels değişen sertlik ile uzun vadeli genişlemesi insan ES ve IPS hücreleri onların pluripotency xeno-Alerjik koşullar üzerinden pasajlar, yanı sıra insan AFS hücresi, reklamlar hücre kültürünü korumak için geliştirilmiştir, ve hematopoetik kök hücre25,28,32. P-IA hydrogels oligoECM ile immobilize hücre kültür malzeme türleri kök hücreler gibi Primer hücre çoğalması ve farklılaşma kaderi üzerinde et...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Bu araştırma kısmen grant numaraları'nın altında 106-2119-M-008-003, 105-2119-M-008-006 ve 104-2221-E-008-107-MY3 Bakanlığı bilim ve teknoloji, Tayvan tarafından desteklenmiştir. Bu araştırma da Tayvan Landseed hastane Projesi (NCU-LSH-105-A-001) tarafından desteklenmiştir. Bilimsel araştırma (sayı 15K 06591) Milli Eğitim Bakanlığı, kültür, spor, bilim ve teknoloji Japonya için bir Grant-in-Aid da kabul edilmektedir. A. Higuchi lisansüstü çalışmalar ve araştırmalar, Kral Suud Üniversitesi, Riyad 11451, Suudi Arabistan için uluslararası bilimsel ortaklık programı (ISPP-0062) Yardımcısı Rektörlüğü için kabul etmek istiyorum.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
GTPGPQGIAGQRGVVPH JaponyayokŞartname: Oligopeptid < br / > Kısaltma: Döngüsel RGD, cRGD
GACRGDCLGAPH Japonyayok Şartname: Oligopeptid < br / > Kısaltma: FN1
KGGAVTGRGDSPASSPH JaponyayokŞartname: Oligopeptid < br / > Kısaltma: CS1
EILDVPSTPH JaponyayokŞartname: Oligopeptid < br / > Kısaltma: VN1
KGGPQVTRGDVFTMPPH JaponyayokŞartname: Oligopeptid < br / > Kısaltma: HBP1
GKKQRFRHRNRKGPH Japonyayok Şartname: Oligopeptid < br / > Kısaltma: HBP2C
CGGGKKQRFRHRNRKGPH JaponyayokŞartname: Oligopeptid
Kısaltma: VN1G
GGGGKGGPQVTRGDVFTMPPH JaponyahiçbiriÖzellikler: Oligopeptid < br / > Kısaltma: VN2C
PH JaponyayokŞartname: Hücre dışı matris < br / > Kısaltma: rVN
VitronectinThermo Fisher bilimselA14700Şartname: Hücre dışı matris < br / > Kısaltma: FN
FibronektinSigma-AldrichF2006Şartname: Ticari olarak temin edilebilen kaplama malzemesi
Kısaltma: Synthemax II
Synthemax IICorning3535Şartname: Polimer
Polivinilalkol-ko-itakonik asitJaponya VAM & PovalAF-17Özellikleri:
Kimyasal GlutaraldehitSigma-AldrichG5882Şartname: Kimyasal
Na2< / sub>SO4< / sub>Sigma-Aldrich239313Şartname: Kimyasal
H2< / sub>SO4< / sub>Sigma-Aldrich339741Şartname: Kimyasal
Kısaltma: EDC
N- (3-Dimetilaminopropil) -N'-etilkarbodiimid hidroklorürSigma-AldrichE7750Şartname: Kimyasal
Kısaltma: NHS
N-hidroksisüksinamidSigma-Aldrich56480Şartname: Kimyasal
ParaformaldehitSigma-AldrichP6148Şartname: Kimyasal
Triton-X100Sigma-AldrichT8787Şartname: Hücre kültürü sarf malzemesi
Hücre kazıyıcıCorning3008Şartname: Hücre kültürü sarf malzemesi
Dispase IISigma-AldrichSI-D4693Şartname: Hücre kültürü ortamı
Esansiyel 6Thermo Fisher bilimselA1516401Şartname: Hücre kültürü ortamı
Esansiyel 8Thermo Fisher bilimselA1517001Şartname: Hücre kültürü ortamı
DMEM / F12Thermo Fisher scientific11330-032Şartname: Hücre kültürü ortamı
DMEMThermo Fisher scientific12800-017Şartname: Hücre kültürü ortamı
MCDB 201Sigma-AldrichM6770Şartname: ES hücresi
İnsan ES hücresiWiCell Research Institute, Inc.WA09Özellikleri: iPS hücresi
İnsan iPS hücresiRiken Hücre BankasıHS0077Özellikler: 35 mm < br / > Kısaltma: TCP
TCP çanakCorning353001Özellikler: 60 mm < br / > Kısaltma: TCP
TCP çanakCorning353002Şartname: 24 kuyulu çanak
24 kuyulu çanakCorning353047Şartname: Engelleme ajan
Sığır serum albüminiSigma-AldrichA8806Şartname: Algılama reaktifi
Alkalin fosfataz canlı lekeThermo Fisher scientificA14353Şartname: Algılama reaktifi
Hematoksilen ve eozinSigma-Aldrich1.05175Şartname: EB oluşum çanağı
6 kuyulu ultra düşük bağlantı çatağıCorning3471Şartname: Kaplama malzemesi
jelatinSigma-AldrichG9391Şartname: Kaplama malzemesi
MatrigelCorning354230Şartname: Fareler
NOD-SCID farelerUlusal Uygulamalı Araştırma LaboratuvarlarıYokŞartname: Serum
Fetal sığır serumuBiyolojik Endüstriler04-001-1AŞartname: Antibiyotik
antimikotik antibiyotikThermo Fisher scientific15240-062Şartname:
NanogInvitrogenMA1-017Şartname:
SSEA4Abcamab16287Antikoru Şartname:
OCT3/4InvitrogenPA5-27438Antikoru Şartname:
Sox2 içinInvitrogen48-1400Şartname:
Düz Kas AktinInvitrogenPA5-19465Antikor Antikoru Şartname:
AFPInvitrogenPA5-21004Antikoru Şartname: Antikor
Antikoru GFAPInvitrogenMA5-15086Şartname: Antikor
Alexa Fluor 555 – konjuge Keçi anti-Fare antikoruInvitrogenA-21422Şartname: Antikor
Alexa Fluor 488 – konjuge Keçi anti-Tavşan antikoruInvitrogenA-11008Şartname: Antikor
GCGGKGGPQVTRGDVFTMP için Antikor Antikoru için Antikor için Antikor Antikor Antikoru için için Antikor

Kaynaklar

  1. Higuchi, A., Ling, Q. D., Chang, Y., Hsu, S. T., Umezawa, A. Physical cues of biomaterials guide stem cell differentiation fate. Chem. Rev. 113, 3297-3328 (2013).
  2. Higuchi, A., et al. Physical cues of cell culture materials lead the direction of differentiation lineages of pluripotent stem cells. J. Mater. Chem. B. 3, 8032-8058 (2015).
  3. Wen, J. H., et al. Interplay of matrix stiffness and protein tethering in stem cell differentiation. Nat Mater. 13, 979-987 (2014).
  4. Murphy, W. L., McDevitt, T. C., Engler, A. J. Materials as stem cell regulators. Nat. Mater. 13, 547-557 (2014).
  5. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
  6. Higuchi, A., et al. Polymeric design of cell culture materials that guide the differentiation of human pluripotent stem cells. Prog. Polym. Sci. 65, 83-126 (2017).
  7. Chen, W. Q., et al. Nanotopography Influences Adhesion, Spreading, and Self-Renewal of Human Embryonic Stem Cells. ACS Nano. 6, 4094-4103 (2012).
  8. Chowdhury, F., et al. Material properties of the cell dictate stress-induced spreading and differentiation in embryonic stem cells. Nat. Mater. 9, 82-88 (2010).
  9. McBeath, R., Pirone, D. M., Nelson, C. M., Bhadriraju, K., Chen, C. S. Cell shape, cytoskeletal tension, and RhoA regulate stem cell lineage commitment. Dev. Cell. 6, 483-495 (2004).
  10. Li, D., et al. Integrated biochemical and mechanical signals regulate multifaceted human embryonic stem cell functions. J. Cell Biol. 191, 631-644 (2010).
  11. Yang, M. T., Fu, J. P., Wang, Y. K., Desai, R. A., Chen, C. S. Assaying stem cell mechanobiology on microfabricated elastomeric substrates with geometrically modulated rigidity. Nat. Protoc. 6, 187-213 (2011).
  12. Shih, Y. R. V., Tseng, K. F., Lai, H. Y., Lin, C. H., Lee, O. K. Matrix Stiffness Regulation of Integrin-Mediated Mechanotransduction During Osteogenic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells. J. Bone Miner. Res. 26 (4), 730-738 (2011).
  13. Du, J., et al. Integrin activation and internalization on soft ECM as a mechanism of induction of stem cell differentiation by ECM elasticity. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 108, 9466-9471 (2011).
  14. Xue, R., Li, J. Y., Yeh, Y., Yang, L., Chien, S. Effects of matrix elasticity and cell density on human mesenchymal stem cells differentiation. J. Orthop. Res. 31 (9), 1360-1365 (2013).
  15. Mao, A. S., Shin, J. W., Mooney, D. J. Effects of substrate stiffness and cell-cell contact on mesenchymal stem cell differentiation. Biomaterials. 98, 184-191 (2016).
  16. Witkowska-Zimny, M., et al. Effect of substrate stiffness on differentiation of umbilical cord stem cells. Acta Biochim. Pol. 59 (2), 261-264 (2012).
  17. Witkowska-Zimny, M., et al. Effect of substrate stiffness on the osteogenic differentiation of bone marrow stem cells and bone-derived cells. Cell Biol. Int. 37 (6), 608-616 (2013).
  18. Macri-Pellizzeri, L., et al. Substrate stiffness and composition specifically direct differentiation of induced pluripotent stem cells. Tissue Eng. Part A. 21 (9-10), 1633-1641 (2015).
  19. Cozzolino, A. M., et al. Modulating the Substrate Stiffness to Manipulate Differentiation of Resident Liver Stem Cells and to Improve the Differentiation State of Hepatocytes. Stem Cells Int. , 5481493(2016).
  20. Mattei, G., Ferretti, C., Tirella, A., Ahluwalia, A., Mattioli-Belmonte, M. Decoupling the role of stiffness from other hydroxyapatite signalling cues in periosteal derived stem cell differentiation. Sci. Rep. 5, 10778(2015).
  21. Zouani, O. F., Kalisky, J., Ibarboure, E., Durrieu, M. C. Effect of BMP-2 from matrices of different stiffnesses for the modulation of stem cell fate. Biomaterials. 34 (9), 2157-2166 (2013).
  22. Ye, K., Cao, L., Li, S., Yu, L., Ding, J. Interplay of Matrix Stiffness and Cell-Cell Contact in Regulating Differentiation of Stem Cells. ACS Appl. Mater. Interfaces. 8 (34), 21903-21913 (2016).
  23. Hogrebe, N. J., Gooch, K. J. Direct influence of culture dimensionality on human mesenchymal stem cell differentiation at various matrix stiffnesses using a fibrous self-assembling peptide hydrogel. J. Biomed. Mater. Res. A. 104 (9), 2356-2368 (2016).
  24. Olivares-Navarrete, R., et al. Substrate Stiffness Controls Osteoblastic and Chondrocytic Differentiation of Mesenchymal Stem Cells without Exogenous Stimuli. PLoS One. 12, e0170312(2017).
  25. Kumar, S. S., et al. The combined influence of substrate elasticity and surface-grafted molecules on the ex vivo expansion of hematopoietic stem and progenitor cells. Biomaterials. 34, 7632-7644 (2013).
  26. Higuchi, A., Iijima, T. DSC investigation of the states of water in poly(vinyl alcohol) membranes. Polymer. 26, 1207-1211 (1985).
  27. Higuchi, A., Iijima, T. DSC investigation of the states of water in poly(vinyl alcohol-co-itaconic acid) membranes. Polymer. 26, 1833-1837 (1985).
  28. Higuchi, A., et al. Long-term xeno-free culture of human pluripotent stem cells on hydrogels with optimal elasticity. Sci Rep. 5, 18136(2015).
  29. Wang, P. Y., et al. Pluripotency maintenance of amniotic fluid-derived stem cells cultured on biomaterials. J Mater Chem B. 3, 3858-3869 (2015).
  30. Muduli, S., et al. Proliferation and osteogenic differentiation of amniotic fluid-derived stem cells. J Mater Chem B. 5, 5345-5354 (2017).
  31. Muduli, S., et al. Stem cell culture on polyvinyl alcohol hydrogels having different elasticity and immobilized with ECM-derived oligopeptides. JPoly Eng. 37, 647(2017).
  32. Chen, Y. M., et al. Xeno-free culture of human pluripotent stem cells on oligopeptide-grafted hydrogels with various molecular designs. Sci Rep. 7, 45146(2017).
  33. Higuchi, A., Ling, Q. D., Ko, Y. A., Chang, Y., Umezawa, A. Biomaterials for the feeder-free culture of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells. Chem Rev. 111 (5), 3021-3035 (2011).
  34. Higuchi, A., et al. Design of polymeric materials for culturing human pluripotent stem cells: Progress toward feeder-free and xeno-free culturing. Prog Polym Sci. 39, 1348-1374 (2014).
  35. Higuchi, A., et al. Stem cell therapies for myocardial infarction in clinical trials: bioengineering and biomaterial aspects. Lab Invest. 97, 1167-1179 (2017).
  36. Higuchi, A., et al. Stem cell therapies for reversing vision loss. Trends Biotechnol. 35, 1102-1117 (2017).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

İnsan Pluripotent Kök HücreleriP-IA HidrojelleriKseno-Free KültürHidrojel Sertlik KontrolüOligopeptit AşılamaKök Hücre DiferansiyasyonuFloresan MikroskopiHücre Pasajlama ProtokolüBiyomalzeme SenteziHücre Dışı Matriks
İnsan Pluripotent kök hücre kültürü ile Xeno-Alerjik koşullar altında değişik sertlik polivinil alkol-Co-İtakonik asit Hydrogels
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.