Caspase harekete geçirmek Bimolecular floresan uluslara kullanarak yolları kadar aydınlatma

Caspase proteaz aile kritik rollerine Apoptozis ve doğuştan gelen bağışıklık ¹bilinmektedir. Onların önemi nedeniyle, ne zaman, nerede ve nasıl verimli bir şekilde belirlenmesi belirli caspases aktif çok önemli caspase mekanizmaları harekete geçirmek yolları kazandırabileceğini. Burada açıklanan görüntüleme tabanlı iletişim kuralı caspase harekete geçirmek cascade ilk adımda görselleştirme sağlar. Bu teknik, bu sürücü caspase etkinleştirme dinamik protein: protein etkileşimleri yararlanır.

Caspases iki gruba ayrılabilir: Başlatıcı caspases (caspase-1, -2, -4, -5 -8 -9, -10 ve -12) ve Cellat caspases (caspase-3, -6 ve -7). Cellat caspases ön şekillendirilmesi dimer hücrede mevcut ve büyük ve küçük alt birim ²arasında bir bölünme tarafından aktif hale gelir. Etkinleştirildiğinde, onlar apoptosis ³' te sonuçlanan çok sayıda yapısal ve düzenleyici proteinler ayırmak. Başlatıcı caspases bir yolu var olmak harekete geçirmek ve genellikle Cellat caspases aktivasyonu tetiklemek için ilk caspases vardır. Cellat caspases aksine, başlatıcı caspases dimerization ^4,5tarafından etkinleştirilir. Bu dimerization harekete geçirmek platformlar bilinen belirli büyük molekül ağırlığı kompleksleri için etkin olmayan monomerleri alımı tarafından yönetilir. Derleme etkinleştirme platformlarının bir dizi belirli protein: protein etkileşimler tarafından yönetilir. Bunlar tarafından korunmuş protein etkileşim motifleri mevcut başlatıcı caspase proform aracılı ve ölüm etki alanı (DD), ölüm efektör etki alanı (DED) ve caspase işe alım etki alanı (kart) ⁶ (şekil 1A) içerir. Harekete geçirmek platformlar genellikle bir reseptör protein ve bir adaptör protein içerir. Reseptör genellikle çok sayıda molekülleri Oligomerizasyonda için sağlar bir konformasyonal değişim inducing bir ligand bağlanması üzerine devreye girer. Reseptör sonra da caspase doğrudan veya sırayla getirmek caspase kompleksi için adaptör molekül acemi. Böylece, çok sayıda caspase molekülleri yakın dimerization izin gelmek. Bu indüklenen yakınlık modeli ⁷olarak bilinir. Dimerized sonra caspase aktif enzim ^4,8stabilize etmek için hizmet vermektedir işlenirken uğrar. Örneğin, Apaf1 apoptosome Meclisi yayınlandıktan sonra mitokondri mitokondrial dış membran permeabilization (MOMP) denen bir süreç üzerinden sitokrom c tarafından tetiklenir. Apaf1 caspase-9 her iki proteinler ⁹' mevcut bir kartıyla aracılık ettiği bir etkileşimi aracılığıyla sırayla acemi. Caspase-8 harekete geçirmek yol açan karmaşık sinyal inducing CD95 ölüm (disk) Meclisi benzer protein etkileşimleri sonucunda; caspase-2-ebilmek harekete geçirmek PIDDosome; ve caspase-1 harekete geçirmek ^10,11,12başlatmak çeşitli inflammasome kompleksleri. Böylece, başlatıcı caspases belirli harekete geçirmek platformları için indüklenen yakınlık ve dimerization, hangi olmadan harekete geçirmek gerçekleşmez sonuçlanan bir ortak mekanizma ve suikastler falan.

Harekete geçirmek platformu takip caspase indüklenen yakınlık doğrudan görselleştirme izin başlatıcı caspases, harekete geçirmek bu ilk adımda ölçmek için geliştirilmiş bir görüntüleme tabanlı tahlil Caspase Bimolecular floresan uluslara (BiFC) olduğunu derleme. Bu yöntem, split floresan protein Venüs özelliklerini yararlanır. Venüs olduğunu bir daha parlak ve daha photostable sürümü iki sigara floresan ve biraz örtüşen parçalara ayrılmış sarı floresan protein (YFP): N-terminus Venüs (Venüs N veya VN) ve C-terminus, Venüs (Venüs C veya VC). Bu parçaları yeteneği refold ve yakın ¹³zaman floresan haline korur. Her Venüs parça harekete geçirmek platforma bağlar caspase çok az bölümü olan caspase, prodomain için erimiş. Bu caspases enzimatik aktivite korur ve bu nedenle eşzamanlı akış aşağı olaylar endojen olaylar ile ilişkili olası analizidir sağlar. Ne zaman caspase prodomains harekete geçirmek platforma işe ve indüklenen yakınlık tabi Venüs e saldırı indirgenmesi parçaları. (Şekil 1B). Elde edilen Venüs Floresans doğru ve özellikle hücre altı yerelleştirme, kinetik ve başlatıcı caspase harekete geçirmek platformlar Tek Kişilik hücrelerde Meclisi etkinliğini izlemek için kullanılabilir. Veri görüntüleme confocal mikroskopi veya standart floresan mikroskopi elde edilebilir ve dahil olmak üzere farklı mikroskobu yaklaşımlar bir dizi için adapte edilebilir: hızlandırılmış caspase harekete geçirmek gerçek zamanlı; izlemek için görüntüleme yüksek kararlılık düşsel hücre altı yerelleştirme kesin tayini için; ve bitiş noktası miktar verimlilik etkinleştirme.

Bu teknik ilk caspase-2¹⁴aktivasyonu araştırmak için geliştirilmiştir. Caspase-2 için harekete geçirmek platform PIDDosome olduğu düşünülen iken, reseptör PIDD (protein p53 kaynaklı bir ölüm etki ile) oluşan ve adaptör RAIDD (RIP ilişkili Ich-1/CAD-3 homolog protein ölüm etki alanı ile), PIDDosome bağımsız caspase-2 aktivasyon bildirilmiştir. Bu ek harekete geçirmek platformlar için caspase-2 ^15,16var olduğunu göstermektedir. Caspase-2 aktivasyon platformun tam bileşenleri bilmeden rağmen caspase BiFC tekniği başarılı sorgulama moleküler düzeyde ^14,17caspase-2 sinyal yollar için izin verdi. Biz de başarıyla bu protokol inflamatuar caspases (caspase-1, -4, -5 ve -12) için adapte olması ¹⁸ ve prensip olarak, aynı yaklaşımı benzer şekilde her kalan başlatıcı caspases analiz için yeterli olmalıdır. Bu iletişim kuralı benzer şekilde adapte olabilir diğer yolları araştırmak için dimerization büyük aktive sinyal edilmistir. Örneğin, STAT protein fosforilasyon Janus kinaz (JAK) ¹⁹tarafından takip dimerization tarafından etkinleştirilir. Böylece, BiFC sistemi için STAT harekete geçirmek hem de dinamik protein etkileşimler tarafından düzenlenmiş birçok yollar görselleştirmek için kullanılabilir. Aşağıdaki iletişim kuralı resim alma ve çözümleme için gazetecilere hücreye giriş için adım adım yönergeler yanı sıra yöntemleri sağlar.

1. hücre ve kültür yemeklerin hazırlanması

Not: Bir doku kültürü laminar akış mahallede 1-3 adımları gerçekleştirin. Eldiven giymek.

1. Cam alt yemekleri kullanıyorsanız, fibronektin ile cam ceket. Adım 1.2 için plastik yemekleri kullanıyorsanız atlayın.
   1. Fibronektin bir 0.1 mg/mL solüsyon olun: 1 mL 1 mg/mL fibronektin çözeltisi 1 X PBS 9 ml seyreltik.
   2. Kapak cam kuyunun her 0.5-1 mL fibronektin ve oda sıcaklığında 1-5 min için kuluçkaya.
   3. Bir pipet kullanarak, fibronektin çözüm toplamanız ve 4 ° C'de
      Not: Fibronektin çözüm birden çok kez yeniden kullanılabilir.
   4. Bir kez 1-2 mL 1 X PBS ile cam yıkama ve PBS Aspire edin.
2. 6-şey plaka 2 ml (bkz. Tablo 1 için farklı büyüklükte kuyular için kullanılacak cep numaralarını) uygun hücre kültür ortamının kuyu başına 1 x 10⁵ hücre plaka. Stabil (konuya bakın) caspase BiFC bileşenleri ifade eder bir hücre kültürünü kullanıyorsanız, 2 x 10⁵ hücreleri plaka ve tedavi tutamaçlarından (Adım 3).
3. Gecede 37 ° C'de bir doku kültürü kuluçka çanak uygun hücrelere izin.

2. caspase BiFC bileşenleri tanıtmak transfection hücre

1. Uygun transfection reaktif hücrelerle transfect.
   Not: Bu protokol Lipofectamine 2000, en az toksisite için optimize edilmiş talimatı özetliyor. Bu iletişim kuralı başarıyla Hela hücreleri, MCF7 hücreleri ve LN18 hücreleri kullanılmaktadır. Ek kullanarak transfection reaktifler üreticinin yönergeleri izleyin ve gerektiği şekilde en iyi duruma getirme.
   1. Transfection reaktif 12 µL düşük serum medya steril tüp içinde 750 µL ekleyin.
   2. 5 min için oda sıcaklığında kuluçkaya.
   3. 10 eklemek bir muhabir plazmid (floresan bir protein transfected hücreleri etiketlenir örneğin kırmızı floresan protein [RFP], kodlama bir plazmid) ng steril 1,5 mL tüp transfected her şey için.
   4. 20 eklemek her caspase BiFC plazmid ng (örneğin, 20 ng caspase-2 prodomain [C2 Pro]-VC ve 20 ng C2 Pro-VN) her Tube (Tablo 2).
   5. Her tüp 100 µL toplam hacmi kadar düşük serum medya ekleyerek getir.
   6. P200 pipet kullanarak, transfection reaktif çözeltinin 100 µL 2.1.2 adımından plazmid karışıma dropwise bir şekilde ekleyin.
   7. Plazmid-transfection reaktif karıştırmak için oda sıcaklığında 20 dk kuluçkaya.
   8. Ve sonra kullanarak p1000 pipet pipet 800 µL serum Ücretsiz medya yavaşça aşağı kuyunun medya bir pipet kullanarak hücreleri veya emme Aspire edin.
   9. P200 pipet kullanarak dropwise DNA-lipid kompleks 200 µL her şey için ekleyin.
   10. 3 h için bir doku kültürü kuluçka makinesi-37 ° C'de hücrelerde kuluçkaya.
   11. Değil monolayer bozabilir, aspirasyon emme kullanarak veya bir pipet ile DNA-lipit kompleksi içeren serum boş ortam kaldırmak için dikkat çekici.
   12. Önceden ısıtılmış (37 ° C) tam büyüme medya yavaşça aşağı her şey tarafında 2 mL pipet.
2. Doku kültürü kuluçka için en uygun protein ifade için 24-48 h 37 ° C'de hücreler kuluçkaya.

3. indüksiyon caspase harekete geçirmek

1. Bir uyuşturucu veya uyarıcı caspase harekete geçirmek yaklaşık 24 s sonrası transfection ikna ile tedavi.
   1. Uyuşturucu için istenen konsantrasyonu önceden sıcak (37 ° C) görüntüleme medya (Hepes [20 mM, pH 7.2-7,5] ve 2-mercaptoethanol [55 µM] ile desteklenmiş tam büyüme medya) ve karışımı yavaşça ekleyin (Tablo 3).
   2. Ve sonra bir pipet kullanarak, yavaşça aşağı kuyunun 3.1.1 çözümden 2 mL pipet medya bir pipet kullanarak hücreleri veya emme Aspire edin.
   3. Uyuşturucu olmadan görüntüleme medya için bir şey tedavi edilmemiş bir denetim ekleyin.
2. Doku kültürü kuluçka 37 ° C'de hücreler kuluçkaya veya adım 4.3 için hızlandırılmış bir deneme için devam edin.

4. Caspase BiFC veri toplama

1. Caspase BiFC tek zaman nokta toplama
   1. Mikroskop ve üreticinin yönergeleri izleyerek Floresan ışık kaynağı açın.
   2. RFP filtre ve muhabir gen Floresans odaklanmak altındaki hücreleri bulmak.
   3. Bir el-taksitli karşı kullanarak, görme alanı içinde RFP pozitif hücrelerin tümünü say. Kaydedin.
   4. Aynı görme alanı korurken, geçiş GFP filtre (veya YFP filtre varsa) ve el-taksitli sayaç kullanarak, aynı zamanda yeşil kırmızı hücreleri saymak (Venüs-pozitif). Sadece kırmızı hücreleri Venüs-pozitif için değerlendirilmesini sağlamak için bu iki filtrenin arasında ileri geri geçiş. (Şekil 3) kaydedin.
   5. Her plaka üç bireysel alanların en az 100 RFP pozitif hücreleri saymak.
   6. Her alanda Venüs-pozitif transfected hücreleri (Yani aynı zamanda yeşil olan alyuvar) yüzdesini hesaplamak. Standart sapma almak için elde edilen yüzde ortalama.
2. Caspase BiFC, üç boyutlu görüntüleme
   1. Üreticinin yönergelerini izleyerek mikroskobunun açmak ve satın alma yazılımı başlatmak.
   2. 60 x veya 63 x petrol hedefi seçin ve bir damla yağı hedefte yer
   3. Kültür çanak doğru plaka sahibi kullanma mikroskop sahne alanı üzerine yerleştirin.
   4. Ya bir epifluorescence ışık kaynağı ve mikroskop göz parça veya confocal lazerler ve bilgisayar ekranı kullanarak, ilgi bir alana gidin.
   5. RFP lazer veya filtre kullanarak muhabir Floresans odaklan.
   6. Epifluorescence bu noktaya kadar kullanılan varsa, ışık kaynağı confocal lazerler geçer ve kamera tarafından alınan ve bilgisayar ekranında edinme yazılımı tarafından görüntülenen hücrelerin canlı görüntü görselleştirmek.
   7. Böylece hücreleri vizör ortasına joystick kontrolü ve odak tekerleğin kullanımı, ince odak ve hücrelerin konumunu ayarını yapın. Birbirinden ayrılır ve olmayan üst üste gelen hücreleri seçin.
   8. Yüzde lazer gücü % 50 ve 100 ms, pozlama süresi için deneme için kullanmak için en iyi ayarları belirlemek için bir başlangıç noktası olarak Venüs ve RFP için giriş.
   9. Canlı yakalama açmak ve ortaya çıkan görüntü ve eşlik eden görüntü çubuk her iki kanal için incelemek.
   10. Görüntü sinyali iyi görünüyor kadar sinyali düşük ise ve görüntü yapmak zordur, artışlarla yüzde lazer güç ve/veya pozlama süresini artırın.
   11. Sinyal doygunluk ulaşmak değil emin olun. Farklı bir zirve için her fluor görünür olduğundan emin olmak için ekran histogram bakarak kontrol edin. Tüm histogram ekran zirve kapsar, giriş alt lazer güç ve pozlama ayarlarını (Şekil 2).
   12. Kontrol (tedavi edilmemiş veya sigara transfected) hücreleri sinyal belirli olduğundan emin olmak için aynı koşullar altında görselleştirin.
       Not: Tek renkli transfectants de denetimine crossover için kullanılabilir, ancak sinyalleri dağınık şekilde farklı (örneğin karşı sitozolik mitokondrial) ise bu gerekli değildir.
   13. Z yığın modülü içinde belgili tanımlık mikroskop bilgisayar yazılımı açın veya seçin.
   14. Odak topuzu, yaklaşık hücrenin merkezine karşılık gelen odak konumunu kullanarak.
   15. Hücre görünene kadar bir yönde odak ayarlamak, bu olarak üst konumunu seçin.
   16. Hücreyi yeniden artık görünür duruma gelene kadar ters yönde odak ayarlamak ve bu alt pozisyon seçin.
   17. En uygun adım boyu (genellikle yaklaşık 20 µm) seçin ve otomatik olarak üst ve alt pozisyonlar arasında 20 µm adımların her biri, her kanaldaki tek bir görüntü çekmek için kamera istemek için satın başlar.
   18. 3D görüntü (şekil 4film 1) yeniden oluşturmak için 3B oluşturma yazılımını kullanın.
3. Caspase BiFC zaman hata görüntüleme
   1. Deneme önce en az 1 h mikroskobunun açın ve 37 ° c sıcaklık ayarlayın
   2. 40 x 60 x veya 63 x petrol hedefi seçin ve bir damla yağı hedefte yerleştirin.
   3. Kültür çanak doğru plaka sahibi kullanma mikroskop sahne alanı üzerine yerleştirin.
   4. CO₂ kaynak kullanılabilir durumdaysa, CO₂ teslimatı (CO₂sunar tüp bağlı genellikle bir pleksiglas kapak) plaka sahibi üstüne yerleştirin. CO₂ düzey 5 %'ye ayarlarsanız ve yazılım içinde CO₂ denetleyicisinden açmak. CO₂ kaynak yoksa, 20 mM Hepes tampon medya dahil.
   5. Transfected hücrelerinin bir alana gidin ve kamera tarafından alınan ve edinme yazılımlar RFP lazer kullanarak bilgisayar ekranında görüntülenen hücrelerin canlı görüntü görselleştirmek.
   6. Adımları 4.2.8-4.2.12, giriş ayarları için yüzde lazer güç ve pozlama kez RFP lazer. Bu değerler hala floresan sinyali algılamak mümkün olurken mümkün olduğunca düşük tutmak.
   7. Olumlu bir denetimi kullanarak örnek (bakınız Tablo 3 örnekler için), takip için yüzde lazer güç ve pozlama kez YFP lazer ışık ayarları giriş için adımları 4.2.8-4.2.12. Bu değerler hala Venüs sinyali algılamak mümkün olurken mümkün olduğunca düşük tutmak.
   8. Plaka her şey için bir veya daha fazla hücre muhabir ifade içeriyor farklı pozisyonların sayısını seçin.
   9. Her kare kare alınması hızlandırılmış ve toplam sayısı arasındaki zaman aralığını girin. Sonraki kare alınması için önce tüm seçilen pozisyonlar elde etmek için zaman olduğundan emin olun.
   10. Her bir pozisyon yeniden ziyaret edin ve düzeltin ve odak gerektiği gibi güncelleştirin.
   11. Değişiklikleri sıcaklık veya dış titreşimler neden olabilir odak drift için düzeltmek için odak kayması düzeltme sistemi üzerinde (varsa) açın.
   12. Hızlandırılmış başlar ve verileri kaydetmek.
   13. Kullanılabilir görüntüleme yazılımı (şekil 5Film 2) kullanarak verileri analiz.

Caspase-2 BiFC DNA hasar tarafından indüklenen örneği şekil 3' te gösterilmiştir. Camptothecin, bir topoizomeraz ı inhibitörü, DNA hasarı ve caspase-2 aktivasyon ikna etmek için kullanıldı. Kırmızı floresan protein mCherry bir muhabir olarak hücreleri BiFC sonda hızlı göstermek için ve hücre toplam sayısı görselleştirmek yardımcı olmak için kullanılmıştır. Venüs Floresans yeşille gösterilmiş ve büyük puncta temsil eden caspase-2 yakınlık indüklenen. Bu hücreler Venüs-pozitif hücreler yüzdesini belirlemek için sayılabilir. Hücre altı yerelleştirme hakkında sonuçlar da böyle görüntülerden yapılabilir. Gösterilen örnekte de olduğu gibi sitoplazma 17çekirdekçik caspase-2 indüklenen yakınlık tespit edilmiştir. Yüksek çözünürlüklü görsel olarak caspase harekete geçirmek karmaşık hücre altı lokalizasyonu sağlamak için tek hücreleri üç boyutlu olarak yansıması. Şekil 4 tür 3D görüntüleri göstermek için iki yol gösterir. İlk hücrenin 3D bir yeniden yapılanma oluşturmaktır. Camptothecin kaynaklı caspase-2 BiFC yeşil ve kırmızı çekirdeği görülmektedir. 3D imar her iki fluorophores göreli lokalizasyonu hücreleri gösterir. Bu tür bir sonuçları görüntüleme hücre (film 1) tek bir eksen etrafında dönen bir film olarak görüntülendiğinde özellikle etkilidir. İkinci panelin aynı hücreyi ortogonal görünümüdür. Bu hücre hücrenin belirli bir noktasında, xy, xzve yz görselleştirme sağlar. 2D bir biçimde sunulan 3D verileri yorumlamak kolay olan sonuçları bu şekilde tasvir gibi kağıt sunuyu bir dergi makalesi için daha uygun olabilir. Şekil 5 proteasome inhibitörü bortezomib ile tedavi glioblastoma hücre kültürünü caspase-2 BiFC zaman hata görüntüleme örneği gösterir (Ayrıca bkz: Movie 2). Grafik ( 20' den uyarlanmıştır) hücre sayısı arasında ortalama hücre başına ortalama Venüs yoğunluk artışı gösterir. Bu tür veri tek hücre izleri bir grafik üzerinde bir numara olarak da görüntülenebilir. Gösterilen örnekte yaklaşık 2 h tedavi aşağıdaki indüklenen caspase yakınlık başlangıcı var.

Şekil 1: caspase yapısı ve bimolecular floresan uluslara (BiFC) metodolojisi şematik. (A) bir başlatıcı caspase genel yapısı. Prodomain, büyük ve küçük alt birimleri ve aktif sistein içerir korunmuş QACRG motifi tasvir edilmektedir. (B) BiFC yalnız floresan olmayan ancak floresan molekül etkileşen proteinler için erimiş reform ilişkilendirebilirsiniz split floresan proteinler kullanır. Caspase BiFC, prodomain (Pro) için ya da tam uzunlukta caspase N-terminal için yarı erimiş (Venüs-N) ve C-Terminal yarısı Venüs'ün (Venüs-C). Monomeric durumlarında caspase füzyon protein flüoresan değildir. İşe Alım için PIDDosome gibi bir harekete geçirmek platformu üzerine burada gösterildiği gibi iki yarıyı da Venüs'ün Derneği artış Venüs Floresans ölçülür indüklenen caspase yakınlık gösteren uygulanır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 2: ekran histogram kullanarak doygunluk tanımak için temsili resim. En iyi (üst paneli) ve doymuş sinyalleri (alt paneli) örnekleri gösterilir. Venüs (sarı tepe) ve RFP (kırmızı tepe) sinyalleri gösterilir. X ekseni yoğunluğu gösterir ve y ekseni sayı piksel. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 3: DNA hasar takip Caspase-2 bimolecular floresan uluslara (BiFC). Caspase-2 BiFC bileşenleri ifade Hela hücreleri tedavi edilmemiş (A) yaptı veya camptothecin (100 µM) ile tedavi (B) qVD-OPH (20 µM) huzurunda. mCherry co floresan muhabir olarak ifade edilir. Temsili resim caspase-2 BiFC (Yeşil) hücrelerdeki 16 h tedavi aşağıdaki camptothecin tedavi ile hücreleri (kırmızı) gösterir. Ölçek çubukları temsil 20 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 4: caspase-2 bimolecular floresan uluslara (BiFC) lokalizasyonu. Caspase-2 BiFC bileşenleri ve floresan nükleer muhabir ifade Hela hücreleri qVD-OPH varlığında (20 µM) camptothecin (20 µM) ile tedavi edildi. 3D rekonstrüksiyonlar oluşan görüntülerden 0,1 mikron seri confocal- z-hücre boyutunda 24 h sonra yapılmış ve çekirdek yeşil kırmızı ve caspase-2 BiFC gösterir. Sol panelinde 3D maksimum yoğunluk projeksiyon işleme yeniden gösterir (Ayrıca bkz: film 1). Doğru kapı aynası aynı hücreyi dikey dilimleri görünümünü gösterir. Orta (mavi) xy düzlemi kutusudur, sağdaki kutu (sarı) yz uçak ise üstteki kutuda (beyaz) xz uçak. Yz ve xz uçaklar göre çapraz çizgileri kesiştiği. Ölçek çubukları temsil 10 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 5: hızlandırılmış caspase bimolecular floresan uluslara (BiFC), (A) caspase-2 BiFC bileşenleri ile LN18 glioblastoma hücreleri transfected ve bir kırmızı floresan mitokondrial marker (DsRed-mito, kırmızı) bortezomib ile tedavi (15 nM) qVD-OPH (20 µM) huzurunda. Hücreleri üzerinde 37 ° C'de confocal mikroskop yerleştirildi ve görüntüleri 8 h. görüntüleri için her 2 dk temsilcisi hücre iki caspase-2 BiFC bileşenleri indüklenen yakınlığı artış Venüs floresan ( sonuçlanan hızlandırılmış show dan alındı Yeşil) Zaman içinde. (B) Venüs, her zaman bir noktada her hücrede ortalama yoğunluğu ölçüldü. Venüs Floresans bortezomib tedaviden sonra zamanla arttı. Tedavi edilmemiş kontrol bölümü lazer ışık (şekil 20' den uyarlanmıştır) şartlarından düşük veya ihmal edilebilir toksisite belirtti. Ölçek çubukları temsil 20 µm. hata çubukları temsil standart hata değerlerin ortalamasının (SEM) 8 (kontrol) ve 14 (bortezomib) tek tek hücreleri (Ayrıca bkz: Movie 2). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Tablo 1: hücre plaka numaraları için yönergeleri. Stabil caspase bimolecular floresan uluslara (BiFC) bileşenleri ifade hücreleri kullanıyorsanız, burada gösterilen tutarlar çift plaka.

Tablo 2: geçici transfection için kullanılan reaktifler hacimleri önerilir. Not: plazmid önerilen miktarı yalnızca bir başlangıç noktasıdır. Sinyal tespit edilirse, bu 20-200 ng 6-şey plaka kuyu başına gelen plazmid titre tavsiye edilir.

Tablo 3: caspase bimolecular floresan uluslara (BiFC) için olumlu denetim örnekleri. Beklenen sonuçlar ve koşulları temel alan üzerinde yayımlanan veri Pro kullanarak 14,17,18oluşturur. Ortak ifade plazmid BiFC plazmid (Adım 2.1.4) transfected

Film 1: caspase-2 bimolecular floresan uluslara (BiFC) 3D yerelleştirme. 3D yeniden yapılanma, döndürülmüş y-eksen- zconfocal görüntülerin-boyutunda bir Hela hücreleri ifade caspase-2-BiFC bileşenleri ve floresan nükleer muhabir için 16 h camptothecin (20 µM) ile tedavi. Film caspase-2 BiFC (Yeşil) ve çekirdek (kırmızı) gösterir. Bu videoyu izlemek için lütfen buraya tıklayın. (İndirmek için sağ tıklatın.)

Movie 2: caspase-2 bimolecular floresan uluslara (BiFC), hızlandırılmış. LN18 glioblastoma hücreleri caspase-2 BiFC bileşenleri ile transfected ve bortezomib ile tedavi (15 nm) her 2 dk 8 h için görüntüsü. Film caspase-2 BiFC (Yeşil) ve mitokondri (kırmızı) gösterir. Bu videoyu izlemek için lütfen buraya tıklayın. (İndirmek için sağ tıklatın.)

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.