3' adapte CDNA hızlı amplifikasyon transkript kanser eşlemek için sona erer

Summary

İki farklı 3' hızlı amplifikasyon cDNA biter (3' yarış) protokolleri açıklanan burada yapmak açık okuma çerçevesi (ORF), kodonu ve tüm 3' UTR RNA kullanarak bir transkript, bir parçasını içeren dizileri iki farklı DNA polimerazlar kullanımı farklı kanser hücre satırlarından elde.

Abstract

Ökaryotik mRNA'ların olgunlaşma Poli(a) kuyruğu ilavesi içerir 3' son oluşumu içerir. Bir gen 3' sonu eşlemek için geleneksel seçim 3' hızlı amplifikasyon cDNA biter (3' yarış) yöntemidir. İletişim kuralları için 3' yarış dikkatli tasarım ve ilgi hedef gen 3' Çevrilmeyen bölgesi (3' UTR) içinde iç içe geçmiş astar yelpazesi gerektirir. Ancak, bir kaç değişiklik ile protokol tüm 3' UTR ve dizileri ORF ve 3' UTR ilişkisi, daha kapsamlı bir görünümünü sağlayan açık okuma çerçevesi (ORF), içinde eklemek için kullanılabilir. Bu Poliadenilasyon sinyal (PAS), yanı sıra yanı sıra geleneksel 3' tarafından yarış sağlanan dilinim ve Poliadenilasyon site kimliğidir. Genişletilmiş 3' yarış alışılmadık 3' UTRs içinde 3' UTR, gen füzyon dahil olmak üzere, algılayabilir ve sırası bilgi AU transkript kararlılığını etkileyebilir öğeleri istikrarsızlaştırıcı zengin yanı sıra potansiyel miRNA bağlayıcı siteleri tahmin etmek için kullanılabilir.

Introduction

3' ucu oluşumu pre-mRNA aşağı Poli(a) kuyruğu^1,2olun ~ 250 untemplated adenines ilavesi ve ardından bir pas bölünme oluşur mRNA olgunlaşma önemli bir adım var. Poli(a) kuyruğu Poli(a) bağlayıcı protein (PABP) bağlanır ve bu mRNA transkript bozulma korur ve çeviri¹kolaylaştırır.

Mevcut tahminlere insan genlerinin % 70'i birden çok giriş ve böylece alternatif Poliadenilasyon, birden fazla 3' biter³' te sonuçlanan geçmesi öneririz. Böylece, nerede Poli(a) kuyruğu kalan 3' UTR verdiği tanımlamak gibi PAS tarafından verilen herhangi bir transkript kullanılan belirlemek önemlidir. Yeni nesil sıralama gelişiyle 3' eşzamanlı kimliği içinde UTRs ve genler binlerce PASs sonuçlandı. Bu artış sıralama özelliği, 3' uç alternatif Poliadenilasyon içeren verileri çözümlemek için bioinformatic algoritma geliştirme gerektirmiştir. De novo algılama veya PAS doğrulanmasını ve dolayısıyla 3' ucu bireysel genlerin büyük ölçekli sıralama veri eşleme için 3' yarış yönteminin seçimi^4,5kalır. Normalde, 3' yarış cDNA ürünleriyle birlikte sıraları yalnızca bir bölümünü 3' Poli(a) kuyruğu, bölünme sitesi, PAS ve akıntıya karşı dizisi PAS içerir UTR'nin içerir. Tasarım ve gen belirli ileriye ve geriye doğru astar kullanımını gerektiren PCR 3' yarış sadece iki gen belirli iç içe ileri astar gerektirir. Dolayısıyla, PCR nükleotid dizisi güçlendirilmiş^4,6olmak gen büyük bir bölgeye ilişkin daha ayrıntılı bir bilgi gerektirir. 3' yarış başlandığından beri aynı Poli(a) kuyruğu poliadenile RNA transkriptlerinizin için hedefleri, yalnızca ileri astar gen belirli, böylece, yalnızca mRNA önemli ölçüde daha küçük bir bölge bilgisi gerektiren gerekir astar ters. Bu kimin dizileri değil tam olarak karakterize^4,7olan bölgelerdeki amplifikasyon sağlar. Bu 3' yarış sadece bir gen 3' sonu belirlemek için aynı zamanda belirlemek ve büyük bölgelerinde akıntıya karşı önemli bir kısmını 3' UTR formu PAS karakterize için kullanılmak üzere izin verdi. 5' ile değiştirilmiş 3' büyük bazı bölümleri 3' UTR ve kanat bölgeleri içeren yarış yarış birleştirerek, tamamen sıra ya da onun 3' son⁸5' uç üzerinden tüm bir mRNA transkript klon mümkündür.

Son kimliği roman CCND1-MRCK füzyon gen transkript Mantle hücreli Lenfoma hücre satırlarından ve kanser hastaları bu uygulanması değiştirilmiş 3' yarış bir örnektir. 3' UTR üzerinden CCND1 ile MRCK gen dizilerinin oluşuyordu ve miRNA Yönetmeliği⁹' a inatçı. İki iç içe geçmiş CCND1 belirli ileri astar hemen bitişik ve CCND1 kodonu aşağı bölgeye tamamlayıcı. Her ne kadar bütün transcriptome sıralama belirli bioinformatic araçları ile birlikte gene füzyon¹⁰3' UTR içinde algılamak için kullanılan, birçok labs mali kaynak veya yapmak için bioinformatic uzmanlık eksikliği bu teknoloji kullanın. Bu nedenle, 3' yarış de novo tanıma ve onaylama 3' UTR içeren roman füzyon genlerin yerine kullanılabilir. Köklü bildirilen füzyon genlerin sayısını artırmak gibi transkript okuma göz önüne alındığında, 3' yarış gen dizileri^11,12karakterize güçlü bir araç haline gelmiştir. Buna ek olarak, son yıllarda yapılan çalışmalarda bu farklı diziler içinde 3' UTR yanı sıra uzunluğu 3' UTR mRNA transkript istikrar, yerelleştirme, translatability ve işlev¹³etkileyebilir göstermiştir. Kısmen artan ilgi nedeniyle transcriptome eşleme, orada laboratuar olarak kullanılmak üzere geliştirilen farklı DNA polimerazlar sayısındaki bir artış olmuştur. Ne tür değişiklikler 3' için DNA polimerazlar kullanılabilir repertuar yararlanmak için sipariş yarış protokolünde yapılabilir belirlemek önemlidir.

Bu eser 3' tüm 3' UTR eşlemek için yarış uyum raporları, PAS ve 3' sonu bölünme bir site kullanarak ANKHD1 transkript astar transkript ve iki farklı DNA polimerazlar ANKHD1 bölümünde iç içe geçmiş.

Protocol

Önlük, eldiven ve koruyucu gözlük bu protokol için tüm yordamları gerçekleştirirken her zaman giymek. Konteyner/tüpler fenol ve guanidin isothiocyanate reaktif içeren yalnızca bir Sertifikalı hood ve dispose fenol atık belirlenmiş bir kap içinde açılan emin olun. Dnaz/RNAse-Alerjik steril tüpler, ipuçları ve Kimyasalları kullanın.

1. hücre kültürü

1. HeLa hücre satır ve iki süspansiyon manto hücre Lenfoma hücre hatları, Granta-519 ve Jeko-1, % 10 içeren DMEM büyümek FBS ve 100 U/mL penisilin/streptomisin 37 ° C'de % 5 CO₂ ile oksijen bir kuluçka Hücreleri 1:10 sulandırmak ve parçacık sayaç¹⁴kullanarak say.
2. RNA çıkarma için 500.000 hücreler/iyi 6 iyi plaka (2 mL medya iyi başına) plaka. 24 h için kuluçka sonra RNA hücrelerden toplamak.

2. RNA çıkarma

1. Hücre hasat
   Not: Santrifüjü adım dışında bir doku kültürü hood kısırlık korumak için listelenen adımları gerçekleştirin.
   1. Süspansiyon hücreleri (Jeko-1 ve Granta-519):
      1. Hücreleri (birlikte medya 2 mL) 15 mL tüp için transfer ve 5 dk. aspiratı medya 1,725 x g, santrifüj kapasitesi ve hücre Pelet tüpün dibinde bırakın.
      2. Hücre Pelet 1 fosfat Buffered Saline (PBS) x 50 µL resuspend. Monophasic fenol ve guanidin isothiocyanate reaktif 500 µL 1.5 mL microcentrifuge tüp her örnek ekleyin. Mix iyi ve her 1 dk. terk microcentrifuge tüp ters çevirme sırasında oda sıcaklığında (RT) 5 min için.
   2. (HeLa) yapışık hücreleri için:
      1. Her şey hücre kültür ortamından Aspire edin. Enkaz yıkamak için her şey için PBS 1 mL ekleyin.
      2. PBS kaldırın ve her şey için monophasic fenol ve guanidin isothiocyanate reaktif 500 µL ekleyin.
      3. RT hafif sallanan ile 5 min için kuluçkaya. 1.5 mL microcentrifuge tüp aktarın.
2. Hücre lizis
   1. Fenol ve guanidin isothiocyanate hücre karışımı 1 h için-20 ° C'de dondurmak.
      Not: Mix-20 ° c gece veya ihtiyaç kadar bırakılabilir.
   2. Fenol ve guanidin isothiocyanate hücre karışımı buz çözme. Kloroform 100 µL PCR başlıklı microcentrifuge tüp ekleyin. Girdap karışımı pembe ve opak kadar 10-15 s için örnek. Örnek 15 dakika (4 ° C'de) buz üzerinde kuluçkaya.
   3. Örnek 20,800 x g ve 4 ° c de 15 dakika santrifüj kapasitesi Dikkatli bir şekilde çıkarın üst renksiz sulu faz (~ 200 µL) ve yeni bir 1.5 mL microcentrifuge tüp aktarmak.
3. RNA Yağış
   1. İsopropanol eşit bir hacmi her örnek için ekleyin. Coprecipitant 1 µL ekleyin (her bir taşıyıcı RNA olarak davranmaya örnek ve sonraki adımda RNA görselleştirmek yardımcı Malzemeler tablobkz:). Örnek-80 ° c en az 4 h için kuluçkaya. En iyi sonuçlar için gecede-80 ° C'de kuluçkaya
   2. Örnek için soğutmalı santrifüj aktarın. 20,800 x g, 35 dk santrifüj / 4 ° C; RNA tüp altındaki mavi bir nokta görünür. Dikkatli bir şekilde alınan örneğin isopropanol çıkarın. 500 µL % 80 etanol ekleyin ve kısa bir süre için 3 vortexing tarafından Pelet resuspend s.
   3. 5 dakika süreyle santrifüj örneği de RT 20,800 x g ' örnek tüm etanol kaldırın. Let örnek kuruması için RNAse free su 35 µL içinde örnek yaklaşık 10 dk. Resuspend. RNA tam çözümde olduğundan emin olmak 5 min için bir ısı blok (65 ° C) yerleştirin ve hemen tüp Buza koyun.
   4. Toplam RNA daha önce açıklanan, RNA Örnek 1,5 µL yerine 1 µL¹⁵kullanmak dışında bir Spektrofotometre kullanarak konsantrasyonu belirlemek. İsteğe bağlı olarak, toplam RNA'ın 1 µg RNA bütünlük belirlemek için % 1'özel jel üzerinde çalıştırın.

3. Dnaz tedavi

1. Sonra miktar RNA'ın Dnaz tedavi genomik DNA aşağılamak için toplam RNA üzerinde gerçekleştirin. Her örnek için bir ayrı microcentrifuge tüp içinde karıştırın bir 20 µL Toplam tepki yapmak RNAse free Dnaz Takımı'ndan aşağıdaki reaktifler ekleyin:
   1. Mix 2 µL Dnaz 10, reaksiyon arabellek X 4,4 µg toplam RNA ile. Su ile 14 µL toplam getirmek.
   2. Dnaz RNase free 2 µL ekleyin. RNase inhibitörü (ters transkripsiyon takımı)'ndan 30 dakika 2 µL huzurunda 37 ° C'de kuluçkaya.
   3. Dnaz enzim devre dışı bırakabilirsiniz için 70 ° c 10 min için bir ısı blokta 2 µL çözüm durdurmak ve ısı ekleyin.
      Not: Dnaz tedavi seçime bağlıdır.

4. cDNA sentezi

50 µL son tepki hacmi için:

1. 50 µL son tepki hacmi için: Transfer 22 µL Dnaz, yeni tüp veya transfer 4 µg yeni bir tüp için 22 µL toplam hacmiyle ekledi su ile toplam RNA'ın RNA tedavi. T7 oligo dT₂₅ astar 2 µL 10 µM astar çözümden ekleyin. 5'-GCCGGTAATACGACTCACTATAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3 sırasıdır T7 oligo dT₂₅ astar için '.
2. Ters transkripsiyon teçhizat--dan 2 µL RNase inhibitörü (20 U/µL), 5 x reaksiyon arabelleğinin 8 µL, 10 mM dNTPs 4 µL ve transkriptaz (200 U/µL) 2 µL ekleyin.
   Not: bir tepki ters transkriptaz olmadan bir negatif kontrol hareket için ayarlayın.
3. 42 ° c için 1 h. Transfer doğrudan buz kuluçkaya. Tüp 5 min için 75 ° C'de ısı ve tüp Buza koyun.

5. Astar arama Fusion Gene transkript için

1. Astar tasarım
   1. CDNA sıra Ensemble genom tarayıcı (ENST00000360839.6/NM_017747) indirmek ve hedef transkript (ANKHD1) akıntıya karşı kodonu ORF içinde bir bölge tanımlar. Kopyalama ve yapıştırma dizisi akıntıya karşı kodonu içine astar tasarım yazılımı sıra giriş bölgesi içeren tüm bölgenin (700 nukleotid) (< https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index>).
   2. Göster özel tasarım seçeneğini seçip 10 astar sayısı için sistem (sonuçlar dönmek için) üretmek ve tüm diğer parametreleri ayarla varsayılan olarak bırakın.
   3. Beş ileri astar ve örtüşmeyen iki ters astar seçin. Astar sipariş ve RNAse/Dnaz-ücretsiz su 10 µM son bir konsantrasyon ile yeniden oluşturma. PCR için genel astar tasarım hakkında daha fazla bilgi başka bir yerde kaplıdır¹⁶.
2. PCR kullanılmak üzere sonraki 3' yarış potansiyel astar tanımlamak için
   Not: tepki olarak kullanmak için son ileri astar, tasarlanmış astar PCR başlıklı düzenli PCR ileriye ve geriye doğru astar farklı birleşimlerini ayarlayarak sınayın.
   1. CDNA (2 µL) taze 0.5 mL PCR tüp aktarın. 1 µL ileri astar ve 1 µL ters astar (bir çözümden 10 mM astar) ekleyin. İlâ 12.5 µL 8,5 µL nükleaz ücretsiz su ekleyerek getirin. 12.5 µL PCR jel Master Mix x 2 ekleyin.
   2. Aşağıdaki PCR termal bisiklet koşullarını kullanın: 95 ° C için 2 dk ardından 29 devredir 30 95 ° c s, 30 60 ° C s ve 72 ° C 1 dk. için 7 dk. 68 ° C'de son döngüsü ayarlamak.
   3. PCR sonra ürünler arasında etidyum bromür ile lekeli bir % 1'özel jel çalıştırın. Elektroforez ayrıntılarını daha önce bir kaç değişiklik¹⁷ile açıklanmıştır.
      1. Özel Tris-asetat (TAE) arabellekte bir 250 mL şişe 100 ml 1 g geçiyoruz. Bir mikrodalga fırında kaynatın.
      2. 1 dakika serin ve etidyum bromür çözüm (10 mg/mL stok) 7.5 µL duman mahallede eklemek için izin. De şişeye dönen tarafından mix ve bir yatay jel aparatı dökün. RT duman mahalle kuvvetlendirmek jel izin vermek en az 30 dk için bırakın.
      3. Jel 1 x TAE arabellek ile kapak ve 10 µL PCR ürünü özel jel ile birlikte 3-5 µL DNA molekül ağırlığı merdivenin üzerine yükleyin. 10 dk. görselleştirmek için bir görüntüleyici kullanarak ürün 175 V çalıştırıyorsa ve daha fazla ürün ayrılması gerekiyorsa, ek bir 5-10 dk için jel.
3. İç içe geçmiş astar için 3' ırk seçimi
   1. Farklı, güçlü ve tek PCR müzik grubunuz mu var astar seçmek için PCR özel jel sonuçlarını çözümlemek. 5'-en astar kullanmak (ANKHD15'-CCTTCCCAGCGAGTTTCTAC-3') ile birlikte çalıştırmak ilk PCR T7 oligodT₂₅ astar.
   2. Nehrin aşağısında bulunduğu ilk astar iç içe geçmiş astar seçin (ANKHD1 5'-CGTTGGACACAGTGGAATCT-3') ve T7 astar ile kullanabilirsiniz (5'-GGCCTAATACGACTCACTATAG-3') PCR reaksiyonları ikinci kümedeki.

6. 3' yarış 3' UTR iki farklı enzimler kullanarak eşleştirmek için en iyi duruma getirme

Not: PCR için kullanılan DNA polimerazlar çeşitliliği bir artış olmuştur; Bu nedenle, farklı enzimler 3' için yarış PCR reaksiyonları kullanırken bile uygulanan standart koşullar belirlemek istedim. Herhangi bir transkript için ters astar sabit tutulur; Tek değişiklikler için hedef transkript özgü iç içe ileri astar bulunmaktadır.

1. 1:3 protokol ' den Pyrococcus furiosus (Pfu) değiştirilmiş DNA polimeraz kullanarak yarış
   1. İlk PCR
      1. CDNA 1 µL PCR tüp aktarmak ve 10 x Pfu tepki arabelleği 5 µL ekleyin. İlk iç içe ileri astar 1 µL, 1 µL T7 oligodT₂₅ astar ve dNTPs 1 µL (10 mM eriyik--dan) ekleyin.
      2. 49 µL Toplam hacim 40 µL su ekleyerek getirin. Pfu DNA polimeraz 1 µL ekleyin ve iyice karıştırın. Tablo 1' de PCR profili kullanarak PCR çalıştırın.
   2. İkinci PCR
      1. 2 µL ürünlerin ilk PCR yeni bir PCR tüp aktarmak ve 10 x PfuUltra II tepki arabellek 5 µL ile karıştırın. İkinci iç içe geçmiş PCR astar 1 µL, 1 µL T7 astar ve dNTPs (10 mM çözüm) 1 µL ekleyin.
      2. 49 µL toplam reaksiyon cilt 39 µL su ekleyerek getirin. Pfu DNA polimeraz 1 µL ekleyin. PCR ilk PCR kurulum (Tablo 1) aynı PCR profili kullanarak çalıştırın.
2. 2:3 protokol ' için Pyrococcuserimiş bir DNA bağlayıcı etki oluşan chimeric DNA polimeraz kullanarak yarış-polimeraz PCR ana mix yazım denetleme gibi
   1. İlk PCR
      1. CDNA 1 µL PCR tüp aktarın. 1 µL ilk iç içe ileri astar ve T7 oligodT₂₅ astar 1 µL ekleyin. En çok 25 µL 22 µL su ekleyerek getirin.
      2. 25 µL PCR Master Mix x 2 ekleyin ve iyice karıştırın. Tablo 2' de açıklanan PCR bisiklet koşullarını kullanın.
   2. İkinci PCR
      1. 2 µL ürünlerin ilk PCR yeni bir PCR tüp aktarın. İkinci iç içe geçmiş PCR astar 1 µL T7 ters astar ile birlikte 1 µL ekleyin.
      2. En çok 25 µL 22 µL su ekleyerek getirin. 25 µL PCR Master Mix X 2 ekleyin. PCR ilk PCR kurulum (Tablo 2) aynı PCR profili kullanarak çalıştırın.

7. ikinci PCR ürünü olan 3' yarış doğrulayın.

1. Almak 5-10 µL ikinci PCR ürünü (yanı sıra ürün Eğer transkript bol ifade PCR ilk turda) ve bir özel jel kaçıyor. Jel ayarla ve daha önce açıklandığı gibi Elektroforez (Adım 5.2.3.1-5.2.3.3) çalıştırın. Bir Imager sonuçlarına görselleştirin.

8. ürün arıtma ve sıralama

1. Jel ve PCR parçası DNA temizleme sistemi başı olarak üreticinin iletişim kuralını kullanarak ikinci PCR jel PCR Urun arındırmak.
2. Sanger gerçekleştirmek sıralama (alternatif olarak, jel saf PCR ürün örnekleri ve uygun sıralama astar bir sıralama laboratuara gönder). Sanger sonra sıralama verileri analiz sıralama.
3. Sıra analiz yazılımı indirmek ( Tablo malzemelerigörmek) ve izleme dosyaları yazılım alın. Kullanım bireysel saf Bankası QVs (Kalite Bankası elde etmek için değerler) bilgi¹⁸ara. Kromatografik ile yüksek kaliteli izlemeler görüntülemek için indirin.
   İsteğe bağlı: Jel arıtılmış ürün uygun bir klonlama kiti ve Sanger için gönderilen izole klonlar kullanma klonlanmış sıralama.

Results

İç içe geçmiş ileri astar arama:

Özel jel Şekil 1 , hangi kullanım aynı ama farklı ters astar astar ileri iki ayrı PCR jel ürün (şerit 1 ve 2) gösterir. Lane 3 ayrı bir PCR ürünü ve farklı ileriye ve geriye doğru astar vardır. Dayalı PCR reaksiyon için kullanmak için ideal astar bir ayrı PCR ürün (Lane 3) vermek bunlar. Şerit 1 ve 2 kullanılan ileri astar en güçlü grup verir ve (beklen...

Discussion

Bir gen gen olarak büyük paralel sıralama teknolojileri gelişiyle rağmen 3' yarış PAS ve nükleotid Poli(a) kuyruğu bitişik tanımlamak için en kolay ve en ekonomik yöntem kalıyor. Burada açıklanan adaptasyon kullanarak 3' yarış hem yükseltmek ve ORF, kodonu ve tüm 3' UTR ANKHD1 mRNA transkript, bir bölümünü içeren dizileri eşlemek için genişler. 3' yarış bir büyük avantajı birkaç küçük uyarlamalar ile diğer vektörel çizimler aşağı akım sorgulama işlevinin miRNA hedefleme, istikrar deneyleri gibi diğer mekanik den...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
HeLa hücreleri	ATCC	CCL-2	Rahim ağzı kanseri hücre hattı.
Jeko-1 hücreleri	ATCC	CRL-3006	Manto hücreli lenfoma hücre hattı.
Granta-519 hücreleri	DSMZ	ACC-342	Manto hücreli lenfoma hücre hattı.
Fetal Sığır Serumu	Sigma Aldrich	F6178	Hücre kültürü için fetal sığır serumu.
Penisilin / Streptomisin	ThermoFisherScientific	15140122	Antibiyotik ve antimikotik.
GlycoBlue	Ambion	AM9545	Eş Çökeltici.
DMEM	ThermoFisherScientific	10569044	Gibco marka GlutaMAX içeren hücre kültürü ortamıdır.
Nükleaz Serbest Su,	ThermoFisherScientific	AM9938	Ambion, DNaz ve RNAse içermeyen su (DEPC ile arıtılmamış).
Dulbecco' s Fosfat Tamponlu Çözelti	Corning	21-030	1X PBS.
Kloroform	Sigma  Aldrich	C7559-5VL
2-propanol	Sigma Aldrich	I9516
Reaktif Alkol	Sigma Aldrich	793175	Etanol
Etidyum Bromür çözeltisi	Sigma Aldrich	E1510
TRIzol Reaktif	ThermoFisherScientific	15596026	Monofazik fenol ve guanidin izotiyosiyanat reaktifi.
2X Genişletici PCR-Jel Master Karışımı	Amresco	N867	2X PCR-to-Gel Master Mix  rutin hızlı PCR tahlillerinde ve astar aramasında kullanılan yükleme boyası içerir.
10mM dNTP	Amresco	N557
RQ1 RNaz İçermeyen DNase	Promega	M6101	Dnase tedavi kiti.
Jel Yükleme Boyası Turuncu (6X)	New England BioLabs	B7022S
2X Phusion Yüksek Kaliteli PCR Master Karışımı, HF tamponlu	ThermoFisherScientific	F531S	2X PCR MasterMix, Pyrococcus benzeri bir düzeltme polimerazına ve diğer reaktiflere kaynaşmış bir DNA bağlanma alanından oluşan bir kimerik DNA polimeraz içerir.
PfuUltra II Fusion HS DNA polimeraz	Agilent Technologies	600670	Pyrococcus furiosus'tan (Pfu) Modifiye DNA Polimeraz.
RevertAid RT Ters Transkripsiyon Kiti	Thermo Fischer	K1691	mRNA'nın cDNA sentezine  ters transkripsiyonu için  kullanılır. Kit içeriği  Ribolock RNAse inhibitörü, RevertAid M-MuLV ters transkriptaz ve el yazması olarak listelenen diğer reaktifler.
Saf boyutu: 1Kb merdiven	5 Prime	2500360	Moleküler ağırlıklı DNA merdiveni.
Alpha Innotech FluorChem Q MultiImage III	Alpha Innotech		Etidyum bromür lekeli agaroz jeli görselleştirmek için kullanılır.
Düşük Moleküler Ağırlıklı Merdiven	New England BioLabs	N3233L	Moleküler ağırlıklı DNA merdiveni.
Vorteks Karıştırıcı	MidSci	VM-3200
Mini Santrifüj	MidSci	C1008-R
Kuru Banyo	MidSci	DB-D1
NanoDrop 2000C	ThermoFisherScientific	ND-2000C	Spektrofotometre.
Geniş Mini-Sub  Cell GT Yatay Elektroforez Sistemi	BioRad	1704469	kurmak için elektroforez ekipmanı-aparatı
BioRad		1645050	Jel elektroforezi için güç kaynağı.
Agarose	Dot Scientific	AGLE-500
Mastercycler Gradient	Eppendorf	950000015	PCR termocycler.
Santrifüj	Eppendorf	5810 R
Santrifüj	Eppendorf	5430R
Sihirbaz SV Jel ve PCR Parçası DNA Temizleme Sistemi	Promega	A9281
Sıfır Künt TOPO PCR Klonlama Kiti, Tek Atış  TOP10 Kimyasal Olarak Yetkin E. coli hücreleri	ThermoFisherScientific	K280020
MyPCR Hazırlama İstasyonu Mystaire	MidSci	MY-PCR24	PCR çalışmasına özel başlık.
Hamilton SafeAire II çeker ocak	ThermoFisherScientific		çeker ocak.
Beckman Coulter Z1  Parçacık  Sayaç	Beckman Coulter	6605698	Parçacık sayacı. Kaplamadan önce hücreleri saymak için  RNA ekstraksiyonu için.
Applied Biosystems Sequence Scanner Yazılımı v2.0	Applied Biosystems (ThermoFisherScientific aracılığıyla)		Sanger sıralama verilerini analiz etmek için yazılım.