İki farklı 3' hızlı amplifikasyon cDNA biter (3' yarış) protokolleri açıklanan burada yapmak açık okuma çerçevesi (ORF), kodonu ve tüm 3' UTR RNA kullanarak bir transkript, bir parçasını içeren dizileri iki farklı DNA polimerazlar kullanımı farklı kanser hücre satırlarından elde.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
3' adapte CDNA hızlı amplifikasyon transkript kanser eşlemek için sona erer
Bu makalede
Özet
Özet
Ökaryotik mRNA'ların olgunlaşma Poli(a) kuyruğu ilavesi içerir 3' son oluşumu içerir. Bir gen 3' sonu eşlemek için geleneksel seçim 3' hızlı amplifikasyon cDNA biter (3' yarış) yöntemidir. İletişim kuralları için 3' yarış dikkatli tasarım ve ilgi hedef gen 3' Çevrilmeyen bölgesi (3' UTR) içinde iç içe geçmiş astar yelpazesi gerektirir. Ancak, bir kaç değişiklik ile protokol tüm 3' UTR ve dizileri ORF ve 3' UTR ilişkisi, daha kapsamlı bir görünümünü sağlayan açık okuma çerçevesi (ORF), içinde eklemek için kullanılabilir. Bu Poliadenilasyon sinyal (PAS), yanı sıra yanı sıra geleneksel 3' tarafından yarış sağlanan dilinim ve Poliadenilasyon site kimliğidir. Genişletilmiş 3' yarış alışılmadık 3' UTRs içinde 3' UTR, gen füzyon dahil olmak üzere, algılayabilir ve sırası bilgi AU transkript kararlılığını etkileyebilir öğeleri istikrarsızlaştırıcı zengin yanı sıra potansiyel miRNA bağlayıcı siteleri tahmin etmek için kullanılabilir.
Giriş
3' ucu oluşumu pre-mRNA aşağı Poli(a) kuyruğu1,2olun ~ 250 untemplated adenines ilavesi ve ardından bir pas bölünme oluşur mRNA olgunlaşma önemli bir adım var. Poli(a) kuyruğu Poli(a) bağlayıcı protein (PABP) bağlanır ve bu mRNA transkript bozulma korur ve çeviri1kolaylaştırır.
Mevcut tahminlere insan genlerinin % 70'i birden çok giriş ve böylece alternatif Poliadenilasyon, birden fazla 3' biter3' te sonuçlanan geçmesi öneririz. Böylece, nerede Poli(a) kuyruğu kalan 3' UTR verdiği tanımlamak gibi PAS tarafından verilen herhangi bir tra....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Önlük, eldiven ve koruyucu gözlük bu protokol için tüm yordamları gerçekleştirirken her zaman giymek. Konteyner/tüpler fenol ve guanidin isothiocyanate reaktif içeren yalnızca bir Sertifikalı hood ve dispose fenol atık belirlenmiş bir kap içinde açılan emin olun. Dnaz/RNAse-Alerjik steril tüpler, ipuçları ve Kimyasalları kullanın.
1. hücre kültürü
- HeLa hücre satır ve iki süspansiyon manto hücre Lenfoma hücre hatları, Granta-519 ve Jeko-1, % 10 içeren DMEM büyümek FBS ve 100 U/mL penisilin/streptomisin 37 ° C'de % 5 CO2 ile oksijen bir kuluçka Hücreleri 1:10 sulandırmak ve parçacık sayaç14kullanar....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
İç içe geçmiş ileri astar arama:
Özel jel Şekil 1 , hangi kullanım aynı ama farklı ters astar astar ileri iki ayrı PCR jel ürün (şerit 1 ve 2) gösterir. Lane 3 ayrı bir PCR ürünü ve farklı ileriye ve geriye doğru astar vardır. Dayalı PCR reaksiyon için kullanmak için ideal astar bir ayrı PCR ürün (Lane 3) vermek bunlar. Şerit 1 ve 2 kullanılan ileri astar en güçlü grup verir ve (beklen.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bir gen gen olarak büyük paralel sıralama teknolojileri gelişiyle rağmen 3' yarış PAS ve nükleotid Poli(a) kuyruğu bitişik tanımlamak için en kolay ve en ekonomik yöntem kalıyor. Burada açıklanan adaptasyon kullanarak 3' yarış hem yükseltmek ve ORF, kodonu ve tüm 3' UTR ANKHD1 mRNA transkript, bir bölümünü içeren dizileri eşlemek için genişler. 3' yarış bir büyük avantajı birkaç küçük uyarlamalar ile diğer vektörel çizimler aşağı akım sorgulama işlevinin miRNA hedefleme, istikrar deneyleri gibi diğer mekanik den.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar ifşa gerek yok.
Teşekkürler
Bettine Gibbs teknik yardım kabul etmek istiyoruz.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| HeLa hücreleri | ATCC | CCL-2 | Rahim ağzı kanseri hücre hattı. |
| Jeko-1 hücreleri | ATCC | CRL-3006 | Manto hücreli lenfoma hücre hattı. |
| Granta-519 hücreleri | DSMZ | ACC-342 | Manto hücreli lenfoma hücre hattı. |
| Fetal Sığır Serumu | Sigma Aldrich | F6178 | Hücre kültürü için fetal sığır serumu. |
| Penisilin / Streptomisin | ThermoFisherScientific | 15140122 | Antibiyotik ve antimikotik. |
| GlycoBlue | Ambion | AM9545 | Eş Çökeltici. |
| DMEM | ThermoFisherScientific | 10569044 | Gibco marka GlutaMAX içeren hücre kültürü ortamıdır. |
| Nükleaz Serbest Su, | ThermoFisherScientific | AM9938 | Ambion, DNaz ve RNAse içermeyen su (DEPC ile arıtılmamış). |
| Dulbecco' s Fosfat Tamponlu Çözelti | Corning | 21-030 | 1X PBS. |
| Kloroform | Sigma Aldrich | C7559-5VL | |
| 2-propanol | Sigma Aldrich | I9516 | |
| Reaktif Alkol | Sigma Aldrich | 793175 | Etanol |
| Etidyum Bromür çözeltisi | Sigma Aldrich | E1510 | |
| TRIzol Reaktif | ThermoFisherScientific | 15596026 | Monofazik fenol ve guanidin izotiyosiyanat reaktifi. |
| 2X Genişletici PCR-Jel Master Karışımı | Amresco | N867 | 2X PCR-to-Gel Master Mix rutin hızlı PCR tahlillerinde ve astar aramasında kullanılan yükleme boyası içerir. |
| 10mM dNTP | Amresco | N557 | |
| RQ1 RNaz İçermeyen DNase | Promega | M6101 | Dnase tedavi kiti. |
| Jel Yükleme Boyası Turuncu (6X) | New England BioLabs | B7022S | |
| 2X Phusion Yüksek Kaliteli PCR Master Karışımı, HF tamponlu | ThermoFisherScientific | F531S | 2X PCR MasterMix, Pyrococcus benzeri bir düzeltme polimerazına ve diğer reaktiflere kaynaşmış bir DNA bağlanma alanından oluşan bir kimerik DNA polimeraz içerir. |
| PfuUltra II Fusion HS DNA polimeraz | Agilent Technologies | 600670 | Pyrococcus furiosus'tan (Pfu) Modifiye DNA Polimeraz. |
| RevertAid RT Ters Transkripsiyon Kiti | Thermo Fischer | K1691 | mRNA'nın cDNA sentezine ters transkripsiyonu için kullanılır. Kit içeriği Ribolock RNAse inhibitörü, RevertAid M-MuLV ters transkriptaz ve el yazması olarak listelenen diğer reaktifler. |
| Saf boyutu: 1Kb merdiven | 5 Prime | 2500360 | Moleküler ağırlıklı DNA merdiveni. |
| Alpha Innotech FluorChem Q MultiImage III | Alpha Innotech | Etidyum bromür lekeli agaroz jeli görselleştirmek için kullanılır. | |
| Düşük Moleküler Ağırlıklı Merdiven | New England BioLabs | N3233L | Moleküler ağırlıklı DNA merdiveni. |
| Vorteks Karıştırıcı | MidSci | VM-3200 | |
| Mini Santrifüj | MidSci | C1008-R | |
| Kuru Banyo | MidSci | DB-D1 | |
| NanoDrop 2000C | ThermoFisherScientific | ND-2000C | Spektrofotometre. |
| Geniş Mini-Sub Cell GT Yatay Elektroforez Sistemi | BioRad | 1704469 | kurmak için elektroforez ekipmanı-aparatı |
| BioRad | 1645050 | Jel elektroforezi için güç kaynağı. | |
| Agarose | Dot Scientific | AGLE-500 | |
| Mastercycler Gradient | Eppendorf | 950000015 | PCR termocycler. |
| Santrifüj | Eppendorf | 5810 R | |
| Santrifüj | Eppendorf | 5430R | |
| Sihirbaz SV Jel ve PCR Parçası DNA Temizleme Sistemi | Promega | A9281 | |
| Sıfır Künt TOPO PCR Klonlama Kiti, Tek Atış TOP10 Kimyasal Olarak Yetkin E. coli hücreleri | ThermoFisherScientific | K280020 | |
| MyPCR Hazırlama İstasyonu Mystaire | MidSci | MY-PCR24 | PCR çalışmasına özel başlık. |
| Hamilton SafeAire II çeker ocak | ThermoFisherScientific | çeker ocak. | |
| Beckman Coulter Z1 Parçacık Sayaç | Beckman Coulter | 6605698 | Parçacık sayacı. Kaplamadan önce hücreleri saymak için RNA ekstraksiyonu için. |
| Applied Biosystems Sequence Scanner Yazılımı v2.0 | Applied Biosystems (ThermoFisherScientific aracılığıyla) | Sanger sıralama verilerini analiz etmek için yazılım. |
Kaynaklar
- Mandel, C., Bai, Y., Tong, L. Protein factors in pre-mRNA 3'-end processing. Cell Mol Life Sci. 65 (7-8), 1099-1122 (2008).
- Danckwardt, S., Hentze, M., Kulozik, A. 3' end mRNA processing: Molecular mechanisms and implications for health and disease. EMBO J. 27
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
