Yöntem makalesi

Yanıt koku nöronlar Optogenetic uyarılması olarak Drosophila larva davranışını izlemek

DOI:

10.3791/57353

⸱

21 Mart 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, MS-0314, University of Nevada, 2Integrated Neuroscience Graduate Program, University of Nevada

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu iletişim kuralı Drosophila larva yanıt onun koku nöronlar eşzamanlı optogenetic uyarılması için gezinme davranışını analiz eder. 630 nm dalga boyunda ışık kırmızı kaymıştır kanal rhodopsin ifade bireysel koku nöronlar etkinleştirmek için kullanılır. Larva hareketi aynı anda izlenir, dijital olarak kaydedilmiş ve özel olarak yazılmış yazılım kullanılarak analiz.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Böcekler koku kaynakları doğru gezinme olanağı onların birinci dereceden koku reseptör nöronlar (ORNs) faaliyetleri üzerinde temel alır. Hatırı sayılır miktarda bilgi ile ilgili ORN yanıt odorants için oluşturulan, davranışsal yanıt sürüş belirli ORNs rolü kötü anlaşılır kalır. Bireysel ORNs, birden çok ORNs tek odorants ve koku uyaranlara kullanarak doğal olarak gözlenen zamansal değişimleri çoğaltılıyor zorluk tarafından aktive etkinleştirmek odorants farklı volatilities nedeniyle davranış analizlerde komplikasyonlar ortaya geleneksel koku-teslimat yöntemlerinin laboratuvarda. Burada, yanıt olarak kendi ORNs aynı anda optogenetic uyarılması Drosophila larva davranış analiz eder bir protokol açıklayın. Burada kullanılan optogenetic teknoloji ORN harekete geçirmek özgüllük ve ORN etkinleştirme zamansal kalıplarının hassas kontrol sağlar. Karşılık gelen larva hareketi izlenir, dijital olarak kaydedilmiş ve özel yazılım yazılı kullanılarak analiz. Koku uyaranlara ışık uyaranlara ile değiştirerek, bu yöntem için daha kesin bir denetim bireysel ORN etkinleştirme larva davranış üzerindeki etkilerini incelemek için izin verir. Bizim yöntem daha fazla etkisi ikinci dereceden projeksiyon nöronların (PNs) yerel nöronlar (Ins) yanı sıra larva davranış çalışma için uzun olabilir. Nasıl koku nöron faaliyetleri tamamlayıcı çalışmalar içinde davranış yanıt-e doğru çevirmek ve bu yöntem böylece koku devre işlevi kapsamlı bir diseksiyon sağlayacak.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Drosophila larva'nın ortamında koku bilgilerine yalnızca 21 işlevsel olarak farklı ORNs, faaliyetleri hangisini sonuçta larva davranış1,2,3,4belirlemek hissettim. Henüz, nispeten az hangi tarafından bu 21 ORNs faaliyetlerine duyusal bilgi kodlanmış mantığı hakkında bilinir. Böylece her larva ORN davranış için fonksiyonel katkılarıyla deneysel olarak ölçmek için gerek yoktur.

Drosophila larva ORNs tüm repertuar duyusal yanıt profilini ayrıntılı1,4,5, bireysel ORNs koku devre ve dolayısıyla katkılarıyla eğitim gördü, ancak gezinme davranışı büyük ölçüde bilinmeyen kalır. Zorluklar larva davranış çalışmaları, şimdiye kadar dağınık şekilde ve geçici tek ORNs etkinleştirmek için yetersizlik nedeniyle ortaya çıkmaktadır. Özellikle 19 21 Drosophila larva ORNs'harekete geçirmek odorants oluşan bir panel son zamanlarda açıklanan1idi. Her propil panelde, düşük konsantrasyonlarda, onun soydaş ORN sadece fizyolojik bir yanıt aydınlığa çıkartıyor. Ancak, normalde geleneksel davranış deneyleri için kullanılan yüksek konsantrasyonları her propil birden çok ORNs1,5,6fizyolojik yanıt aydınlığa çıkartıyor. Ayrıca, odorants Bu bölmedeki istikrarlı koku degradeler7,8oluşumu üzerinde bağlı davranış çalışmalar yorumlanması karmaşık hale volatilities çeşitli var. Son olarak, doğal olarak meydana gelen koku uyaranlara laboratuvar koşullarında çoğaltmak zordur zamansal bir bileşen var. Bu nedenle larva davranış aynı anda kayma ve zamansal bir şekilde tek tek ORNs etkinleştirilirken ölçebilen bir yöntem geliştirmek önemlidir.

Burada, yukarıda açıklanan larva izleme üzerinde avantajları vardır bir yöntem1,8deneyleri göstermektedir. Gershow ve ark. içinde açıklanan izleme tahlil elektronik kontrollü vanalar koku davranış arena8istikrarlı bir degrade korumak için kullanır. Ancak, karmaşık mühendislik koku uyarıcı kurulum oluşturmak ilgili düzeyi nedeniyle, bu yöntem diğer laboratuvarlarda çoğaltmak zordur. Ayrıca, özellikle tek ORNs etkinleştirmek için odorants kullanılmasıyla ilgili konuları çözülmemiş kalır. Mathew vd içinde açıklanan izleme tahlil daha basit bir koku iletim sistemi kullanır, ancak ortaya çıkan koku degrade test propil volatilite bağlıdır ve tahlil1uzun süreler için kararsız. Böylece, koku bir çekim gücü ile hafif bir çekim gücü yerine, bizim yöntem özgüllük avantajları ve ORN etkinleştirme kesin zamansal bir denetim vardır ve farklı güçlü koku degradeler oluşumu üzerinde bağımlı değildir.

Bizim yöntem kurmak kolaydır ve araştırmacılar Drosophila larva gezinti yönlerini ölçme baktılar için uygundur. Araştırmacı kendi favori sistemin neuron(s) tercih CsChrimson ifadede sürücü yapabiliyor olması koşuluyla bu tekniği diğer sistemleri modellemek için adapte. CsChrimson kanal rhodopsin, kırmızı kaymıştır bir sürümüdür. Larva'nın fototaksis sisteme görünmez dalga boylarında, aktif. Biz bu nedenle nöronların özgüllük, güvenilirlik ve tekrarlanabilirlik9ile faaliyet manipüle edebiliyoruz. Özel yazılım konuların boyut değişiklikleri için hesap yazılı değiştirerek, bu yöntem kolayca gezinme larvaları diğer böcek türleri için adapte olabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. bir davranış Arena inşa ve donanım Optogenetic stimülasyon davranış arenada etkinleştirmek için hazırlanıyor

  1. Bir ışık yoksun davranış arena inşa için 89 x 61 x 66 cm3 boyutta bir kutu oluşturmak (35" L x 24" W x 26" H) (bkz: Malzemeler tablo) siyah renkli pleksiglas akrilik levhalar (3 mm kalınlığında) yaptı. Böyle bir kutu oluşturmak için malzemeleri yerel donanım mağazalarında mevcut olmalıdır. Bu kutusunu masa üstü davranış odasında (şekil 1A) yerleştirin.
  2. Tek renkli bir USB 3.0 CCD kamera ile donatılmış bir IR uzun taramalı 830 nm filtre ve bir 8 mm F1.4 C-mount lens ile Dağı ( Tablo malzemelerigörmek) kara kutu tavan ortasına. Yer iki kızılötesi LED ( Tablo malzemelerigörmek) (Resim 1A) karanlık arenada larva aydınlatmak için masa üstü şeritler.
  3. LED platform oluşturmak için bir 22 cm × 22 cm kare alüminyum levha (tercihen sprey herhangi bir yansımaları ortadan kaldırmak için siyah mat ile boyalı) edinin. Plaka Merkezi'ndeki CCD kamera sığmayacak kadar büyük bir delik bir metal kesici kullanarak.
  4. (Bkz. Tablo reçetesi) kırmızı LED şerit ışıklar ile metal plaka kapak. Serisi LED ışık şerit teller lehim ve şerit kablo ahududu Pi 2B mikro işlemcisi tarafından denetlenen bir optocoupler geçiş içine yem ( Tablo malzemelerigörmek) (Resim 1B ve 2).
  5. Yükleyin ve optocoupler geçiş için LED şeritler bağlanmadan önce ahududu Pi işlemci üzerinde Ubuntu dostum/Raspian Jesse/Linux esaslı iş sistem yapılandırın. Güç LED şeritler ve optocoupler (Şekil 2) için bir güç kaynağına takın (bkz. Tablo malzeme). CCD kamera (şekil 1B) çevresinde LED platformu bağlayın.
    Not: Ubuntu dostum v16.04 işletim sistemi serbestçe kullanılabilir. Basit temel Python komut LED ışık uyaranlara (sözdizimi dosyasına bakın) programı alışkanlıkları kolayca adapte edilebilir.
  6. Homojen olma davranışı arenada çeşitli noktalarda olun. Arena yüzeyi bir Spektrometre yardımıyla mutlak olma ölçmek ve ~1.3 W/m2 arena yüzeyi boyunca olmasını belirler.
    Not: Bu yoğunlukta deneyler boyunca sıcaklığında hiçbir önemli değişiklikler gözlendi. Başka bir çalışmada10 ~1.9 W/m2 bir daha yüksek olma kullanılan ve hiçbir değişiklik sıcaklık deneyleri boyunca gözlendi.

2. davranış analizleri için Drosophila larva hazırlanması

  1. Standart sinek Gıda sinekler korumak ( Tablo malzemelerigörmek) 25 ° C, % 50-60 RH ve 12 h/12 h açık/koyu döngüsü.
  2. CsChrimson ORNs tek bir çift hızlı için bakire kadın UAS-IVS-CsChrimson bir OrX-Gal4 satırından erkekler için çizgiyi ('X' 21 larva koku reseptör birine karşılık gelen (ya da) her birinde benzersiz olarak ifade edilir genler ORNs 21 çiftlerini)9,11.
    1. Alternatif olarak, CsChrimson tüm 21 larva ORNs içinde hızlı için çapraz bir UAS-IVS-CsChrimson bakire kadın erkekler için ('Orco' tüm 21 ORNs ifade edilen ortak reseptör olduğu) bir Orco-Gal4 satırından satır.
    2. UAS-IVS-CsChrimson çizgi kendisi tarafından bir denetim bu deneyler olarak kullanın.
      Not: burada listelenen sinek stokları Bloomington Drosophila hisse senedi merkezinde mevcut tüm bulunmaktadır ( Tablo malzemelerigörmek).
  3. Sonra erkek ve dişi sinekler çapraz dostum ve 48 h için yumurtalarını bırakmak için izin verilir, yetişkinler için taze bir şişe aktarın.
    1. Yumurta içeren gıda şişe yüzeye 400 µL Dimetil sülfoksit (DMSO) çözünmüş 400 µM all-trans retinal (ATR) ve distile suda 89 mM Sükroz içeren bir karışımı ekleyin.
      Not: Sükroz az miktarda larva ATR çözümünün beslenme teşvik etmektedir. ATR bir kofaktör CsChrimson ifade9,10etkinleşmiş için gerekli olduğunu. ATR ışığa duyarlı olduğunu.
    2. ATR yumurta içeren gıda şişeleri eklendikten sonra bir ek 72 h için karanlık şişeleri kuluçkaya.
      Not: Bu çalışma ve yukarıdaki iki çalışmaları nedeniyle ATR besleme larva davranışı üzerindeki etkileri gözlemledik değil iken, ATR ATR içermiyor yukarıdaki karışımı aynı miktarda sınama satırlarındaki subjecting tarafından besleme etkileri için kontrol önerilir.
  4. Üçüncü-biçim larva (~ 120 yumurta döşeme sonra h) bir yüksek yoğunluklu (% 15) Sükroz çözüm kullanarak yüzen tarafından sinek gıda yüzeyinden ayıklayın. Bir P1000 kullanarak micropipette 1000 mL cam kabı içine Sükroz çözüm yüzeyinde yüzen larva ayırın.
  5. Larvalar 3-4 kez her zaman 800 mL distile su cam ölçek değiştirerek yıkayın. Larvalar 10 dakikadır davranış tahlil tabi önce dinlenmek izin verir.

3. davranış tahlil

  1. (22-25 ° C arasında) tutarlı ısısını korumak ve davranış odasında (50 ile %60 RH) nem.
  2. Larva gezinme orta 22 cm x 22 cm kare Petri kabına içine erimiş özel (% 1.5) tarafından dökme 150 mL hazırlayın. Bir Petri kabına tahlil, 8 – 10 deneme deneme başına her deneme için dökülür. Özel kuvvetlendirmek ve 1-2 h Petri yemekler için davranış assay olarak kullanmadan önce soğumaya izin.
    1. En fazla 20 hazırlandı üçüncü-biçim larva Merkezi, Petri yemek için (Resim 1C) aktarın. Petri kabına kapağı ile kapak. CCD kamera altında davranış arenada Petri kabına yerleştirin.
      Not: bağlı olarak deneme, davranış deneyleri genellikle 3-5 min için yapılmaktadır. Bir propil rehberlik yardım sağlamak için tahlil kullandıysanız, ortaya çıkan koku degrade için yaklaşık15 dk sabit kalır gözlenmiştir. Uzun tahlil kez tavsiye edilmez. Larva su kaybı nedeniyle veya uzun süreli 630 nm kırmızı ışık pozlama üzerinde zararlı etkileri bu zaman noktaları içinde gözlenen değil.
  3. Larva video görselleştirmek için turn ON 850 nm kızılötesi LED ışık kaynağı. Larva hareketi kaydetmek üzere CCD kamerayla başlatın.
  4. Ahududu Pi işlemci, program uygun desen kırmızı ışık stimülasyon yönetmek için bu yordamı ile ilişkili yazılım kullanarak.
    Not: Bir basit dayalı Python komut kümesi LED ışık uyaranlara (sözdizimi dosyasına bakın) programı desenleri kolayca adapte edilebilir.

4. veri işleme ve analiz

  1. Kaydedilen videoyu her deneme Matlab gibi kullanılabilir herhangi bir programlama yazılım alın.
  2. Bir film her larva XY koordinatları bir fonksiyonu olarak elde edilir. İzleme yazılımı sınırlamalar dayalı, 15-20 üçüncü-biçim larva bir tek film1,8' izlenebilir.
    Not: Bir dizi (sözdizimi dosyasına bakın) uygun koşullarına uygun kolayca adapte edilebilir basit Matlab kodları ('Tracklarva') sağlanır. Bu program tüm denemeler bir deneyde birleştirir ve her larva XY koordinatları assay süresi boyunca verir (bkz: kod sözdizimi aşağıda). Alternatif olarak, araştırmacılar için serbestçe kullanılabilir çeşitli açık kaynak tabanlı programlar ihtiyacım var. Örneğin JAABA (http://jaaba.sourceforge.net/)12.
  3. Oluşturulan XY koordinatları larva yörüngeleri çizilecek ve larva hareket daha ileri düzeyde çözümlemek için kullanın.
    1. Davranış analizleri için hız, yol eğriliği, başlık açı, gibi seyir istatistikleri çalışır ve döner dizileri alternatif içine bireysel larva yörüngeleri segmentlere ayırmak için kullanın.
    2. İshal sürekli dönemlerinde ileri hareketi tanımlanır. Sırayla art arda gelen ishal ayırın. Döner bayraklı değişiklikleri yörünge yönlendirme açılarla yaşındayken > 45° (sözdizimi dosyasına bakın).
  4. Çalışma hızı, uzunluk, çalışma yönü ve diğer parametreleri gerektiği gibi çalışması için ortalama değerleri hesaplar.
    Not: 'İshal' ve 'durur' larva yörüngeleri ayıklamak için basit sözdizimi bir dizi sağlanan (sözdizimi dosyasına bakın). Basit Matlab veya Excel tabanlı işlevleri uzunluğu hesaplamak değerleri 'çalışma hızı', 'çalıştırmak için ' ayıklanan veriler için uygulanabilir vs.
  5. ± SEM Yani davranış her ölçüm için veri temsil etmek

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ORN harekete geçirmek özgüllük göstermek için bizim yöntem başarıyla iki farklı ORN (ORN::7a & ORN::42a) etkisini belirlemek için uygulandı (Or7a veya Or42a ifade ORNs) etkinleştirme larva davranış (şekil 3). Son çalışmalar bireysel ile tutarlı larva ORNs işlevsel olarak farklı1,10,13, CsChrimson ifade ORN::7a ışık tarafından uyardığında vardı bizim temsilcisi ve...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, Drosophila larva davranış aynı anda optogenetic harekete geçirmek koku nöronların karşılık olarak ölçülmesi için izin veren bir yöntem açıklanmıştır. Daha önce açıklanan larva izleme yöntemleri1,8 farklı koku teslim teknolojisini kullanıyor ORNs harekete geçirmek. Ancak, bu yöntemleri özgüllük veya zamansal desenleri ORN etkinleştirme için kontrol edemiyorum. Bizim yöntem bu açıkları ORN harekete geçirmek daha hassas kontrol için koku uyaranlara ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu eser University of Nevada, Reno fonlarından başlangıç ve Ulusal Sağlık Enstitüsü grant numarası P20 GM103650 altında NIGMS tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
< güçlü > Larva hareketini yakalamak için video kamera< / güçlü >
CCD Kamera Edmund Optics106215
M52 - M55 Filtre İpliği AdaptörüEdmund Optics59-446
Görüntüleme Lensleri için 2" Kare Dişli Filtre Tutucu Edmund Optics59-445
RG-715, 2" Sq. Uzun Geçiren FiltreEdmund Optics46-066
Optogenetik kurulum için elektronik
Raspberry Pi 2BRASPBERRY-PI.orgRPI2-MODB-V1.2
3 Kanal programlanabilir güç kaynağınewegg.com9SIA3C62037092
8 Kanal optokuplör röleamazon.com6454319
630nm Dört sıralı LED şerit ışıklarenvironmentallights.comkırmızı3528-450 makaralı
850nm LED şeritlerenvironmentallights.com wp-4000K-CC5050-60x2-kit
Software 
MatlabMatematik İşleri A.Ş.
Ubuntu MATE v16.04Nubuntuhttps://github.com/yslo/nubuntu
Diğer öğeler
Pleksiglas siyah akrilikEv DeposuMC1184848bl
Fly gıda ve diğer reaktifler
Nutrifly sinek yemiGenesee Scientific66-112
Agaroz tozuGenesee Scientific20-102
22cm X 22cm kare petri tabakVWR Inc.25382-327
DMSOSigma-AldrichD2650
SükrozSigma-Aldrich84097
Tüm trans-retinalSigma-AldrichR2500
Sinekler
UAS-IVS-CsChrimson  Bloomington Drosophila Stok Merkezi55134
Orco-Gal4Bloomington Drosophila Stok Merkezi26818
Or42a-Gal4Bloomington Drosophila Stok Merkezi9970
Or7a-Gal4Bloomington Drosophila Stok Merkezi23907

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mathew, D., et al. Functional diversity among sensory receptors in a Drosophila olfactory circuit. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 2134-2143 (2013).
  2. Ramaekers, A., et al. Glomerular maps without cellular redundancy at successive levels of the Drosophila larval olfactory circuit. Current biology : CB. 15, 982-992 (2005).
  3. Couto, A., Alenius, M., Dickson, B. Molecular, anatomical, and functional organization of the Drosophila olfactory system. Current biology : CB. 15, 1535-1547 (2005).
  4. Kreher, S. A., Kwon, J. Y., Carlson, J. R. The molecular basis of odor coding in the Drosophila larva. Neuron. 46, 445-456 (2005).
  5. Kreher, S. A., Mathew, D., Kim, J., Carlson, J. R. Translation of sensory input into behavioral output via an olfactory system. Neuron. 59, 110-124 (2008).
  6. Hallem, E. A., Carlson, J. R. Coding of odors by a receptor repertoire. Cell. 125, 143-160 (2006).
  7. Monte, P., et al. Characterization of the larval olfactory response in Drosophila and its genetic basis. Behav Genet. 19, 267-283 (1989).
  8. Gershow, M., et al. Controlling airborne cues to study small animal navigation. Nature methods. 9, 290-296 (2012).
  9. Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nature methods. 11, 338-346 (2014).
  10. Hernandez-Nunez, L., et al. Reverse-correlation analysis of navigation dynamics in Drosophila larva using optogenetics. eLife. 4, (2015).
  11. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
  12. Kabra, M., Robie, A. A., Rivera-Alba, M., Branson, S., Branson, K. JAABA: interactive machine learning for automatic annotation of animal behavior. Nature methods. 10, 64-67 (2013).
  13. Newquist, G., Novenschi, A., Kohler, D., Mathew, D. Differential contributions of Olfactory Receptor Neurons in a Drosophila olfactory circuit. eNeuro. 3, (2016).
  14. Schulze, A., et al. Dynamical feature extraction at the sensory periphery guides chemotaxis. eLife. 4, (2015).
  15. Tastekin, I., et al. Role of the Subesophageal Zone in Sensorimotor Control of Orientation in Drosophila Larva. Current Biology. 25, 1448-1460 (2015).
  16. Famiglietti, E. V., Kolb, H. Structural basis for ON-and OFF-center responses in retinal ganglion cells. Science. 194, 193-195 (1976).
  17. Luo, L., et al. Bidirectional thermotaxis in Caenorhabditis elegans is mediated by distinct sensorimotor strategies driven by the AFD thermosensory neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 2776-2781 (2014).
  18. Berck, M. E., et al. The wiring diagram of a glomerular olfactory system. eLife. 5, (2016).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Koku Devresi FonksiyonuKo u Uzunlu u AnaliziCsChrimson EkspresyonuK z l tesi LED ArenaAgaroz S r nme Ortamnc Instar Larvalarzel Yaz l m Analizi

İlgili makaleler