Epicardium hücreleri ve büyüme faktörleri miyokardiyal duvara sağlayarak geliştirme ve onarım kalp önemli bir rol oynar. Burada, çalışma ve gelişimsel ve yetişkin özellikleri karşılaştırma sağlar kültür insan birincil epicardial hücreleri yöntemine açıklayın.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Yalıtım ve kültür insan yetişkin ve Fetal kalp örnekler elde edilen birincil Epicardial hücre
Bu makalede
Özet
Özet
Epicardium, Miyokardiyum kapsayan bir epitel hücre katmanı iskemik yaralanma sonra kalp geliştirme sırasında hem de onarım yanıt kalp önemli bir rol vardır. Aktif hale getirildiğinde, epicardial hücreleri epitelyal Mezenkimal geçiş (EMT) hücreleri Yenileyici Miyokardiyum için sağlamak için bilinen bir sürecinden geçmeleri. Ayrıca, epicardium temel parakrin faktörler salgılanmasını katkıda bulunur. Tam takdir epicardium rejeneratif potansiyelini ortaya çıkarmak için bir insan hücre modeli gereklidir. Burada bir roman hücre kültür model birincil epicardial türetilmiş hücre (EPDCs) insan yetişkin ve fetal kalp dokudan türetmek için anahat. EPDCs izole etmek için epicardium kalp numune dışarıdan disseke ve bir tek hücre süspansiyon işlenmiş. Ardından, EPDCs kaplama ve ALK 5-kinaz inhibitörü onların epitel fenotip korumak için SB431542 içeren EPDC ortamda kültürlenir. EMT stimülasyon ile TGFβ tarafından indüklenen. Bu yöntem sağlar, ilk kez, kontrollü bir ortamda insan epicardial EMT sürecinin incelenmesi ve kalp rejenerasyon yardımcı olabilir EPDCs secretome daha fazla anlayış kazanıyor kolaylaştırır. Ayrıca, bu üniforma yaklaşım insan yetişkin ve fetal epicardial davranışını doğrudan karşılaştırma için sağlar.
Giriş
Epicardium, zarflar, olduğunu kalp geliştirme ve (gözden Smits ve ark. tamir için hayati önemi olan bir tek hücreli epitel tabaka 1). proepicardial organ, gelişmekte olan kalp tabanında bulunan küçük bir yapı developmentally, epicardium kaynaklanmaktadır. Gelişimsel güne E9.5 fare ve 4 hafta sonrası anlayışı insan, hücreleri bu karnabahar yapısından geçirmek ve kapak gelişmekte olan Miyokardiyum2başlayın. Bir kez bir tek epitel hücre katmanı oluşturulur, bir kısmını epicardial hücreleri epitel Mezenkimal geçiş (EMT) uğrar. EMT sırasında hücreleri epitel onların niteliklerinden hücre-hücre yapışıklıklar, kaybetme....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
İnsan dokusu numuneler ile tüm deneyler Leiden Üniversitesi Tıp Merkezi Etik Komitesi tarafından onaylanmış ve Helsinki Deklarasyonu için uygundur. Tüm adımlar bir hücre kültür akışı kabine steril ekipmanları ile gerçekleştirilir.
1. hazırlıkları
- EPDC orta Dulbecco'nın değiştirilmiş kartal orta (DMEM düşük-glikoz) ve orta 199 (M199) 1:1 oran içinde karıştırarak hazırlayın. % 10 ısı inaktive fetal sığır serum (FBS, 25 dk 56 ° c için inaktive ısı) ekleyin ve ilave 100 U/mL penisilin ve 100 mg/mL streptomisin ile. 37 ° C su banyosu EPDC ortamda önceden ısıtmak.
- Tripsin önceden sıcak 0.25%/EDTA (1:37 ° C su banyosunda ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Burada, EPDCs insan yetişkin ve fetal kalp dokusu (şekil 1) izole etmek için basit bir protokol anahat. Bu iletişim kuralı, kalp (şekil 1A) dışarıdan epicardium kolay erişilebilecek bir konuma yararlanır. Diseksiyon temel subepicardial hücre dışı matriks ve miyokard dokusu bozulmamış (şekil 1J) kalırken WT1 + epicardium kaldırılır gösterir sonra kalp auricle boyama. Geniş karakterizasyonu, EPDCs hızl.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Burada bir yalıtmak için detaylı Protokolü ve birincil epicardial hücreleri insan yetişkin ve fetal kalp türetilmiş kültür açıklar. Kapsamlı bu hücrelerin karakterizasyonu önceden yayınlanan17oldu. Biz her iki hücre tipleri ALK5 kinaz inhibitörü SB431542 ile kültürlü zaman epitel Arnavut kaldırımlı benzeri hücreler olarak muhafaza edilmesi göstermiştir. EMT geliştirme ve sonrası yaralanma yanıt sırasında epicardial harekete geçirmek içinde vivo ayrılmaz bir parçası olduğunu. EMT bu yöntem.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar ifşa gerek yok.
Teşekkürler
Bu araştırma Hollanda organizasyon bilimsel araştırma (NWO) (VENI 016.146.079) için ve bir LUMC araştırma bursu hem AMS ve LUMC Bontius Stichting (MJG) tarafından desteklenmektedir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Dulbecco' s değiştirilmiş Kartal' s orta + GlutaMAX | Gibco | 21885-025 | |
| Orta 199 | Gibco | 31150-022 | |
| Fetal Sığır Serumu | Gibco | 10270-106 | |
| Tripsin% 0.25 | Canlandırıcı | 25200-056 | |
| Penisilin G sodyum tuzu | Roth | HP48 | |
| Streptomisin sülfat | Roth | HP66 | |
| Tripsin 1:250 sığır pankreasından | Serva | 37289 | |
| EDTA | Sigma | E4884 | |
| Domuz derisinden elde edilen jelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Kültür plakaları 6 kuyulu | Greiner bio-one | 657160 | |
| Kültür plakaları 12 kuyulu | Corning | 3512 | |
| Kültür plakaları 24 kuyulu | Greiner bio-one | 662160 | |
| SB 431542 | Tocris | 1614 | |
| Dimetil Sülfoksit (DMSO) | Merck | 102931 | |
| 100-1000&mikro; L Filtreli Pipet Uçları | Corning | 4809 | |
| 10 ml pipet | Greiner bio-one | 607180 | |
| 5 ml pipet | Greiner bio-one | 606180 | |
| Hücre kültürü kabı 100/20 mm | Greiner bio-one | 664160 | |
| PBS | Gibco | 10010056 | Veya ev yapımı ve sterilize |
| edilmiş Eppendorf tüpleri 1,5 mL | Eppendorf | ||
| 15 ml'lik santrifüj tüpleri | Greiner bio-one | 188271 | |
| 50 ml'lik santrifüj tüpleri | Greiner bio-one | 227261 | |
| 10 mL Şırınga | Becton Dickinson | 305959 | |
| İğneler 19 Gauge | Becton Dickinson | 301700 | |
| İğneler 21 Gauge | Becton Dickinson | 304432 | |
| EASYstrainer Hücreli Elekler, 100 & m | Greiner bio-one | 542000 | |
| TGF ve beta; 3 | Ar-Ge D sistemleri | 243-B3 | |
| Monoklonal Anti-Aktin, &alfa;-Düz Kas | Sigma | A2547 | |
| Anti-Fare Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A31570 | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Invitrogen | A12379 | |
| < güçlü > Ekipman< / güçlü > | |||
| < güçlü > Adı< / güçlü > | < güçlü > Şirket< / güçlü > | < güçlü > Katalog Numarası< / güçlü > | < güçlü > Yorumlar< / güçlü> |
| Pipet P1.000 | Gilson | F123602 | |
| Pipet kontrolörü | Integra | 155 015 | |
| Stereomikroskop | Leica | M80 | |
| Ters Işık Mikroskobu | Olympus | CK2 | |
| Santrifüj | Eppendorf | 5702 | |
| Su banyosu | GFL | 1083 |
Kaynaklar
- Smits, A. M., Dronkers, E., Goumans, M. J. The epicardium as a source of multipotent adult cardiac progenitor cells: Their origin, role and fate. Pharmacological research. 127, 129-140 (2017).
- Risebro, C. A., Vieira, J. M., Klotz, L., Riley, P. R.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
