Biz enfeksiyon antikor bağımlı geliştirme tarafından Zika virüs nekahat serum dang virüs muhabir Viral parçacıkların kullanarak ölçmek için basit ve kolay bir iletişim kuralı tanımlamak.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Basit Akış Sitometresi Vitro antikor bağımlı Enhancement-in dang virüs Zika virüs nekahat Serum kullanarak belirlemek için tahlil dayalı
Bu makalede
Özet
Özet
Antikor bağımlı geliştirme enfeksiyon Dang viral patogenezinde önemli bir rol oynamaktadır göstermiştir. Antikorlar veya serum enfeksiyon söyleyebileceğin hücre hatlarında geliştirmek kapasitesini ölçmek geleneksel deneyleri üzerinde kullanarak viral çıkış plak deneyleri tarafından takip medya enfeksiyon ölçmek için güveniyorlar. Son zamanlarda, bu deneyleri dang virüs (DENV) enfeksiyonu fluorescently etiketli antikorları kullanarak hücre hatlarında inceledik. Her iki bu yaklaşım bu teknikler yaygın kullanımı kısıtlamak kısıtlamalar bulunmaktadır. Burada, biz yeşil flüoresan protein ve K562 hücreleri antikor bağımlı geliştirme (ADE) DENV enfeksiyon rhesus elde edilen serum kullanarak incelemek için hızlı dang virüs muhabir viral parçacıkların (RVPs) kullanarak bir basit vitro tahlil tarif maymunların Zika virüs (ZIKV) ile enfeksiyon sonra 16 hafta. Bu teknik güvenilirdir, hücreleri en az manipülasyonu içerir, canlı çoğaltma yetkili virüs kullanımı gerektirmez ve Akış Sitometresi kullanarak bir nicel okuma almak için yüksek işlem hacmi biçimde gerçekleştirilebilir. Ayrıca, bu tahlil kolayca antikor bağımlı geliştirme (ADE) sarı humma virüsü (YFV), Japon Equine Ensefalit virüsü (JEEV), Batı Nil virüsü (WNV) burada RVPs kullanılabilir vb gibi diğer flavivirus enfeksiyonların incelemek için adapte edilebilir. Tahlil ayarlama kolaylığı, veri analizi ve sonuçları yorumlama çoğu laboratuvar ayarları için son derece uysal yapar.
Giriş
Antikor bağımlı geliştirme (ADE) enfeksiyon sayede virüs serotip tarafından indüklenen kısmen cross-reactive antikor yanıt artırır artan viral çoğaltma ve viremi yol virüs, başka bir serotip alımını bir süreçtir. ADE kapsamlı dang virüs (DENV) enfeksiyonları dört büyük serotipleri yaygın nerede belgelemiştir. Hastaların alt kümede, ADE Dang kanamalı ateşi (DHF) ile ilişkilidir. Biz son zamanlarda Zika virüs (ZIKV) enfeksiyon DENV ADE içinde vitro neden oldu ve büyük olasılıkla DENV viremi vivo içinde1 iyileştirmesini katkıda DENV cross-reactive antikor yanıt düzeyi önemli ölçüde yüksek indüklenen göstermiştir ,
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Burada açıklanan protokol göstermek için kullanılan serum numuneleri ilişki değerlendirme ve Akreditasyon laboratuvar hayvan bakımı için ev ve bakım için uygun olarak yerel, eyalet ve federal ilkelerinde edildi rhesus makak elde International (AAALAC)-akredite tesis. Tüm hayvan deneyleri gözden geçirilmiş ve kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi tarafından onaylanmış ve örnekleri paylaşım protokolü bir doku ile elde.
1. gün 1
Not: bir BSL-2 laboratuvar doku kültürü için kullanılan steril laminar akış Biyogüvenlik kabini içinde aşağıda açıklanan tüm adımları gerçekleştirin.
- Serum numuneleri, oda sıc....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Sera 4 rhesus makak ZIKV ile enfeksiyon sonra toplanan 16 hafta vardı ve potansiyellerini DENV-1 geliştirmek test üzerinden, 2, 3 ve 4 enfeksiyon K562 hücrelerdeki. Hayvanlar tepe viremi ~ 1 105 kopya ZIKV RNA/mL plazma x 7 gün sonra enfeksiyon tarafından algılamayı sınırın altındaki edildi düzeyleri reddetti enfeksiyon sonra 3 gün vardı. Hiçbir viremi 16 hafta sonrası enfeksiyon, plazma algılandı. O zaman, RVP tahlil gerçekleştirilmiş ve toplanan verilerin, yukarıdaki protokol.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Flaviviruses DENV ve ZIKV gibi önemli kanıt homoloji birbirleri ile13,14cross-react antikor üreten her iki onların yapısal ve yapısal olmayan proteinlerde paylaşmak. Bu cross-reactive antikor yanıt-e doğru geliştirmek gösterilmiştir enfeksiyonu ile ilgili vivo içinde ve vitro Contegra serotip veya diğer flaviviruses1,2. Çapraz enfeksiyon geliştirmek için potansiyel hastalık yönetimi hem .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar ifşa gerek yok.
Teşekkürler
Açıklanan proje JJM için Uniformed Hizmetleri Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü'nden fon tarafından desteklenmiştir. Görüş ya da burada yer alan iddialar yazarların özel olanları ve resmi veya yansıtıcı olarak görüşlerini Savunma Bakanlığı, Uniformed Hizmetleri Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü veya başka bir Ajansı ABD olmak yorumlanacaktır değildir Hükümet.
WGV tüm deneylerin gerçekleştirilen ve veri analiz; JJM tasarlamış ve çalışma denetlenir; WGW ve JJM kağıt yazdı.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| DENV 1-4 RVP | İntegral Moleküler | RVP-501 | |
| K562 hücreleri | ATCC | CCL-243 | |
| RPMI | Corning | 10-040-CV | |
| FBS | GE yaşam koşulları | SH 30910.03 | |
| Penisilin-Streptomisin | MP biyomedikallerinde | 1670049 | 100 IU Pen/mL, 100 ug Strep/mL RPMI-10 |
| HEPE'de | Cellegro | 25-060-Cl | 0.025M RPMI-10 |
| MEM Esansiyel Olmayan Amino Asit Çözeltisinde (100&kez;) | Sigma | M7145 | 1x in RPMI-10 |
| Sodyum Piruvat | Cellegro | 25-000-Cl | 1mM in RPMI-10 |
| L-glutamin | Fisher Scientific | MT25005CI | |
| Steril V-tabanlı plakalar | Thomas Scientific | 333-8001-01V | |
| BD Falcon Polipropilen 5 ml FACS tüpleri | VWR | 60819-728 | |
| Steril olmayan U-tabanlı plakalar | Falcon | Ref 353910 | FACS tüplerine yüksek verimli bir alternatif |
| 5 mL, steril, serolojik pipet | Denville | P7127 | |
| 200uL steril pipet uçları | Denville | P3020 CPS | |
| 20uL steril pipet uçları | Denville | P1121 | |
| 50-200uL çok kanallı pipet | Denville | P3975-8-B | |
| 5-50uL çok kanallı pipet | Denville | P3975-9-B | |
| %20 formadehit | Tousimis | #1008B | |
| Su Banyosu | ThermoFisher | TSCOL35 | |
| termomikser | Eppendorf | 2231000387 | Isı inaktivasyonu için bir su banyosuna alternatif |
| CO2 İnkübatörü | ThermoFisher | 13-998-213 | |
| Etanol | Sigma Aldrich | E7023 | |
| Sıvı Çamaşır Suyu | Fisher Scientific | NC9724348 | |
| Flowjo 9.8 | TreeStar, Inc. | Akış sitometrisi analiz yazılımı | |
| BD FACSDiva 6.1.2 | Becton Dikinson | ||
| BD LSR II akış sitometresi | Becton Dikinson | ||
| Sıvı Çamaşır Suyu | Fisher Scientific | NC9724348 |
Kaynaklar
- George, J., et al. Prior exposure to zika virus significantly enhances peak dengue-2 viremia in rhesus macaques. Sci Rep. 7 (1), 10498(2017).
- Stettler, K., et al. Specificity, cross-reactivity, and function of antibodies el....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
