Yöntem makalesi

Yüksek işlem hacmi SiRNA tarama için polis ve hidrojen florür kaynaklı kornea epitel hücre hasarı

DOI:

10.3791/57372

⸱

16 Haziran 2018

 ,  ,  , 
1US Army Medical Research Institute of Chemical Defense

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yüksek işlem hacmi küçük inhibitör RNA tarama daha hızlı moleküler mekanizmalar kimyasal kornea epitel yaralanma aydınlatmak için yardımcı olabilecek önemli bir araçtır. Burada, biz geliştirme ve pozlama modelleri ve kornea epitel yaralanma hidrojen florür ve polis indüklenen yüksek aktarım tarama yöntemlerini doğrulama mevcut.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kimyasallar hızla önemli doku hasar potansiyeline sahip çünkü oküler yaralanma toxicant kaynaklı bir gerçek oküler acil durum. Belirli hiçbir tedavi var yaraların tedavisi için kornea yaralanma toxicant kaynaklı tedavisi genellikle destekleyici şunlardır. Tedaviler ve tedavi için poz bakım geliştirmek için çabalarında yaraların moleküler ve hücresel mekanizmaları anlamak önemli olabilir. Önerdiğimiz kullanımı yüksek işlem hacmi küçük inhibitör RNA (siRNA) tarama daha hızlı moleküler mekanizmalar kimyasal kornea epitel yaralanma aydınlatmak için yardımcı olabilir önemli bir araç olabilir. siRNA Homoloji siRNA için olan 19-25 nükleotit uzun ve mRNA düşmesine yol susturmak çoğu gen kullanmak çift telli RNA molekülleri vardır. Bu gen toxicant hücresel yanıt olarak işlev görmeye yaydıkları maruz kalan hücrelerdeki belirli bir gen ifadesi elde edilen azalma daha sonra çalıştı. Geliştirme ve vitro pozlama modelleri ve yöntemleri (HTS) hidrojen florür-(HF) ve polis indüklenen-(CP) oküler yaralanma eleme yüksek üretilen iş için doğrulama Bu makalede sunulmaktadır. Biz bu iki toxicants seçilmiş olsa da, bizim yöntemleri diğer toxicants çalışma odasına yaydıkları pozlama Protokolü küçük değişiklikler ile geçerlidir. SV40 büyük T antijen SV40-HCEC çalışması için seçilen insan kornea epitel hücre satırı ölümsüzleştirdi. Hücre canlılığı ve Il-8 üretim tarama protokol bitiş noktaları olarak seçildi. Birkaç zorluklar yaydıkları pozlama gelişimi ile ilişkili ve hücre kültür yöntemleri HTS çalışmaları için uygun sunulmaktadır. HTS modelleri için bu toxicants kurulması için potansiyel therapeutics kimyasal oküler yaralanma yaralanma ve ekran mekanizması daha iyi anlamak daha fazla çalışmaları sağlar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kimyasallar hızla önemli doku hasar potansiyeline sahip çünkü oküler yaralanma toxicant kaynaklı bir gerçek oküler acil durum. Belirli hiçbir tedavi var yaraların tedavisi için ne yazık ki, kornea yaralanma toxicant kaynaklı tedavisi sadece genellikle destekleyici şunlardır. Geçerli tedavi stratejisi belirsiz ve öncelikle yağlama maddeleri, antibiyotik, gibi topikal tedavi tedaviler içerir ve cycloplegics takip antiinflamatuar (Örneğin, steroid) tarafından bir kez kornea1 yeniden epithelialized ,2. En iyi mevcut tedavi seçenekleri rağmen uzun vadeli prognoz genellikle ilerici kornea clouding ile neovaskülarizasyon2,3nedeniyle kötüdür.

Hayvan modelleri geleneksel kimyasal toksisitesi araştırmak ve yaralanma mekanizmaları anlamak için kullanılmaktadır. Ancak, zaman alıcı ve pahalı hayvan çalışmaları vardır. Ayrıca çabaları hayvan test azaltmak için vardır. Örneğin, REACH mevzuatı (EC 1907/2006) Avrupa Birliği'nde hayvan test azaltmak amacıyla hükümler vardır. Hükümler şirketler hayvan test ve Önerilen testleri hayvanlar üzerinde gerçekleştirmeden önce Avrupa Kimyasallar Ajansı onayı önlemek için veri paylaşmak bir gereklilik içerir. REACH hükümleri altında hayvan testleri son çare olmalı. Avrupa kozmetik kozmetik hayvanlarda test dışarı aşamalı yönetmelik (EC 1223/2009) da vardır. Hayvan çalışmaları yürütülen zaman 3Rs ilkeleri tarafından yönlendirilir (arıtma, azaltma ve değiştirme) hangi daha insancıl hayvan araştırma, kullanılan hayvan sayısını azaltarak ve hayvan-alternatifleri kullanma için bir çerçeve sağlamak Mümkünse. Bu nedenlerden dolayı toksikoloji alan toksisite moleküler mekanizmaları içgörü sağlayabilir ve daha yüksek üretilen iş4' te yapılabilir vitro deneyleri benimsemeye araştırmıştır. Bu toxicants onların işlevini yerine yalnızca onların Kimya tarafından tanımlandığı bir işlevsel toksikoloji yaklaşımdır. Bir adım daha ileri, fonksiyonel alınan toxicogenomics aramak toxicants5etkileri belirli genler oynamak rolleri anlamak. SiRNA teknoloji uygulaması ile moleküler ve hücresel yanıt-e doğru toxicants işlevinde gen araştırmak üzere filtreleri yüksek üretilen iş yapılabilir. siRNA 19-25 nükleotit bu yazı transkripsiyon gen silencing yolu tüm memeli hücreleri6' mevcut yararlanmak uzun olan çift iplikçikli RNA molekülleri vardır. Bunlar sentetik yapılır ve belirli bir gen hedeflemek için tasarlanmış. Bir hücreye tanıttığında, siRNA işlenir ve bir iplikçik, Kılavuzu strand, RNA-induced silencing tesisin (RISC) yüklenir. Bir mRNA molekülü tamamlayıcı bir bölgesine RISC siRNA yönlendirir ve RISC mRNA düşer. Bu belirli bir gen ifadesi azalma olur. Bu gen toxicant hücresel yanıt olarak işlev görmeye yaydıkları maruz kalan hücrelerdeki belirli bir gen ifadesi elde edilen azalma daha sonra çalıştı. Böyle bir yaklaşım daha "risin" duyarlılık mekanizmaları ve CYP1A17,8AHR bağımlı indüksiyon anlamak için kullanılmıştır.

Kimyasal terörizm Risk değerlendirmesi (CTRA) listesi ve toksik endüstriyel kimyasalları (TIC) listeleri seçme kimyasal toksisitesi ve potansiyel bir terörist, savaş veya endüstriyel kaza olay9sırasında yayımlanması için bağlı maddeler halinde. Bir siRNA yüksek işlem hacmi (HTS) toxicogenomic yaklaşım terör olayı kullanım yüksek riskli olarak tespit edilmiştir CTRA listesi toxicants incelenmesi için eleme uygulamaktayız. Geleneksel toksikoloji kimyasalları canlı organizmalar üzerinde var olumsuz etkileri anlamak istiyor; Ancak, tedavi ve tedavi yaklaşımları ve büyük olasılıkla, kalkınma bilgilendirmek amacıyla yaralanma mekanizmaları anlamak için daha fazla bir arzusu var terapötik geliştirme için hedeflenen molekülleri keşfedin. Bu çaba bazı yönlerden benzer şekilde yüksek işlem hacmi siRNA tarama ve temel hücre deneyleri ilaç bulma işlemi10kullanımı daha kabul edilebilir. Büyük bir fark bizim yaklaşım bu yaydıkları pozlama tedavisi için yüksek terapötik değeri ile tekil bir hedef olurdu biraz düşüktür, ancak bu ilaç keşif genellikle tekil bir hedef tedavi bulma istiyor olurdu. Biz herhangi bir etkili tedavi paradigma yaydıkları pozlama için yüksek terapötik değeri elde etmek için çok yönlü bir yaklaşım gerektirir ve toxicogenomic veri hayati bir etkili tedavi paradigma bilgilendirebilir tahmin.

Benchtop Otomasyon laboratuvarları dışında ilaç ya da biyoteknoloji sanayi yüksek işlem hacmi metodoloji getiriyor. Vitro çalışmalar bizim Enstitüsü'nde tarihsel iş hızı düşük11,12,13olan geleneksel deneyleri edilmiştir. Son birkaç yıl içinde bizim laboratuvar yüksek işlem hacmi siRNA tarama gerçekleştirmek için benchtop robot kullanımına geçiş. Burada, biz oküler hücre modelleri zerafet ve vitro gelişimi hidrojen florür (HF) ve polis (CP) yüksek işlem hacmi siRNA tarama için uygun pozlama yöntemleri mevcut. Amacımız bu toxicants karşılık olarak hücresel yaralanma düzenleyen molekülleri belirlemektir. Bizim seçtiğimiz siRNA Kütüphane hedefleri G protein birleştiğinde reseptörleri, protein kinaz, proteaz, fosfatazlar, iyon kanalları ve diğer potansiyel olarak druggable hedefleri içerir. HF ve CP için çalışma CTRA liste ajanlar endüstriyel kazaların ToxNet raporlarla çapraz gönderme yapmak en büyük risk buharı pozlama9,14ile oküler yaralanma mevcut bulmak için seçildi. CP (kimyasal formülü Cl3Kao2, CAS numarası 76-06-2) WWI15dakika sonra bir göz yaşartıcı gaz olarak kullanılan özgün. Şu anda tarım bir tütsü ve işlevler bir nematicide, fungisit ve böcek ilacı16kullanılır. Hidrojen florür (HF) petrol rafinerileri ve organik bileşikler17elektrokimyasal fluorination alkillenme dahil süreçlerinde kullanılır. HF (kimyasal formülü HF, CAS numarası 62778-11-4) bir gaz ama sulu haliyle hidroflorik asit (HFA, CAS sayı 7664-39-3). Bu yüzden, HFA içinde bizim hücresini kullanın seçildi pozlama modelleri. SV40 büyük T antijen SV40-HCEC çalışması için seçilen insan kornea epitel hücre satırı ölümsüzleştirdi. Hücresel yaralanma söz konusu hedef hücre ölümü ve inflamatuar yanıt yansıtılması gerekir çünkü hücre canlılığı ve inflamatuar marker Il-8 bitiş noktaları seçildi. Bir hedef olarak yaydıkları pozlama koruyucu bir rol oynamaya olsaydı, ne zaman hedef ifadesi siRNA tarafından inhibe özellikle, hücre ölümü ve/veya inflamatuar sitokin üretim artacaktır. Tam tersi olumsuz rol oynayan hedefler için doğru olurdu. Ayrıca, kronik inflamasyon pozlama ve hücre ölüm yolları müdahale klinik sonuç2,18artırabilir sonra kornea patolojisi bir rol oynamaya görünür.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. hücre kültür bakım

  1. 37 ° C, % 5 CO2ve DMEM F-%12 90 nem ile % 15 fetal Sığır serum (FBS), hücre kültürünü SV40-HCEC büyümek %1 L-glutamine, 10 µg/L epidermal büyüme faktörü (EGF) ve 5 mg/M insülin.
  2. Hücre (bağlı olarak sağlanan yoğunluk) her 3-4 gün confluency hiç kültür bakım sırasında % 80'i aşan sağlamak için geçiş.
  3. Bir dekolmanı çözüm (her 150 cm2 şişe için 14 mL solüsyon) ve kuluçka en fazla 8 dk. 37 ° C'de kullanarak şişeler hücrelerden bağlantısını kesin.
  4. Hücre kültür ortamının eşit bir birimdeki dekolmanı çözüm nötralize ve 160 x g de 7 dk aralıklarla tarafından 50 mL konik tüpler hücrelerde cips.
  5. Hücre Pelet Orta (her 150 cm2 şişe için 20 mL) yeniden askıya alma.
  6. Bir otomatik el hücre sayaç ve 3-4 gün için % 80 confluency aşmadan büyümek için onlara izin verir bir yoğunluk itibariyle yeni şişeler içinde tohum içeren hücreleri saymak.

2. plaka hücreleri deneme için

  1. SV40-HCECs şişe o confluency emin olmak için faz kontrast ışık mikroskobu ile % 80'den ve genel hücre sağlık değerlendirmek için kontrol edin.
  2. Ayırmak, cips, resuspend ve SV40-HCECs hücre kültür bakım 1.3-1.6 adımlarda açıklandığı gibi şişeler gelen saymak. SV40-HCEC orta 0,5 µg/mL hidrokortizon (HCORT orta) içeren hücreleri resuspend için kullanın.
  3. Tek kullanımlık orta şişede bir süspansiyon SV40-HCECs önceden ısıtılmış HCORT Orta 17,857 hücre/mL, hazır olun.
    1. Hücre süspansiyon yeterli hacmi plaka numaralı seribaşı sayıda için hazırlayın.
    2. 14 x 96-şey plakaları belirlenmesi her siRNA Kütüphane plaka için hücreler en az tohum.
  4. Eşit olarak hücreleri askıya alma, yeterli bir birim hücre süspansiyon, bir otomatik sıvı işleyicisi orbital çalkalayıcı yuva üzerinde bir rezervuar içine dökün ve 37 ° c plaka hücre kaplama sırasında ısınma hücre süspansiyon içeren şişe depolamak için şişe girdap işlem.
  5. Otomatik sıvı işleyicisi içinde orta iyi bir 96-şey plaka başına 70 µL tabak iyi (5000 hücre/cm2) başına 1000 hücre yoğunluğu, hücreleri eklemek için kullanın. Bir 50 µL/s kullanmak için tüm adımları pipetting hız.
    1. Orbital çalkalayıcı sürekli tohumlama işlemi sırasında 100 rpm'de çalıştırın.
    2. Hücre süspansiyon üç (140 µL karışımı cilt) mix otomatik sıvı işleyicisi kullanarak.
    3. Hücre süspansiyon 140 µL Aspire edin ve 70 µL iki hücre kültür tabak her kuyuya dağıtmak.
    4. Tüm plakaları hücrelerle seribaşı 2.5.3 ve 2.5.4 tamamlayana dek.
    5. Hücre süspansiyon rezervuar tohumlama işlemi sırasında gerektiği gibi doldurun.
  6. Tabakları seribaşı sonra otomatik sıvı işleyicisinden çıkarıp onları bir hücre kültür kuluçka aktarmadan önce oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya
  7. Her şey her plaka için hücre yoğunluğu aşağıdaki sabah bir hücre kültür kuluçka makinesine ev sahipliği yapmaktadır ve % 15 ve % 22 birleşmesi arasında değildir iç kuyu var çalışmada herhangi bir tabak dışlamak bir otomatik görüntüleme sistemini kullanarak değerlendirmek.

3. transfect hücreleri ile siRNA

  1. SiRNA Kütüphane plakaları 80 siRNA hedefinde de plaka başına için önceden yapılandırılmış satıcıdan elde (bkz. Şekil 4), sütun 1 ve 12 ile sol boş.
  2. 2 pmol/µL siRNA üreticinin yönergeleri19göre her şey için son bir konsantrasyon siRNA arabelleğe siRNA Kütüphane plakalı sulandırmak.
  3. Hücreleri 24 h siRNA 4 pmol/kuyu ve 0.3 µL/iyi transfection reaktif ile tohum sonra transfect. Transfection reaktif üreticisinin protokolüne göre tüm adımları uygulayın (bkz Şekil 4 plaka düzeni için)20.
    1. Tek bir otomatik sıvı işleyicisi kullanarak transfections gerçekleştirmek ve bir 25 kullanmak için tüm adımları µL/s pipetting hız. Sadece transfected kuyuları adresi için önceden yapılandırılmış uç kutularını kullanın.
    2. Kütüphane plaka altı Çoğalt plakaları bir dizi transfect yarısı anılacaktır "üst plaka grubu olarak" üst kullanın (altı çoğaltır siRNA, n = 6).
    3. Kütüphane plaka altı Çoğalt plakaları farklı bir kümesi transfect yarısı anılacaktır "alt plaka grubu olarak" alt kullanın (altı çoğaltır siRNA, n = 6).
    4. "Tam plaka ayarla" terimi ile Kütüphane siRNA transfected 12 hücre plakaları açıklamak için kullanın.
    5. Tüm üst ve alt plaka setleri Kütüphane siRNA ile transfected sonra kuyu B2-B6 plaka tam kümesi ile negatif havuzu siRNA içindeki tüm plakaları yapımı transfect.
    6. Ayrıca kuyu B2-B6 Kütüphane siRNA almazsınız ve yıkamaya denetimleriyle (bir üst plaka kümesi için) ve bir alt plaka seti için negatif havuzu siRNA işlevi görecek başka bir iki tabak transfect.
  4. Tüm hücre plakaları bir hücre kültür kuluçka 4 saat sonra bütün transfection karışımları eklendi ve karıştırmak için her saat dokunarak hafif tarafından kuluçkaya.
  5. Kullanım önceden ısıtılmış HCORT orta ile iki kez plakaların bütün wells yıkamak için otomatik sıvı işleyicisi 1:5 PBS içinde seyreltilmiş. Bir 50 µL/s kullanmak için tüm adımları pipetting hız.
    1. Her kuyudan 100 µL Aspire edin ve atık bir rezervuar atın.
    2. Her şey 100 µL/iyi için eklemek önceden ısıtılmış HCORT orta plakaları sayısı için yeterli hacmi itibariyle farklı bir rezervuar bulunan 1:5 içinde PBS seyreltilmiş.
    3. Adım 3.5.1 ve 3.5.2 her plaka için yineleyin.
      1. Atık haznesi gerektiği gibi boş.
      2. Yedek su deposu HCORT orta ile 1:5 gerektiği gibi PBS içinde seyreltilmiş.
    4. Her kuyudan 100 µL Aspire edin ve bu atık göle atın.
  6. Bütün wells ile farklı bir rezervuar orta plakaları sayısı için yeterli bir ses seviyesinde bulunan 100 µL/iyi önceden ısıtılmış HCORT orta, plakaların refeed.
    1. Havzanın orta ile gerektiği gibi doldurun.
  7. Kuyu C2-C6 tüm plakaları yapımı sigara transfected denetimleri kullanın.
  8. Wells B7-B11 ve C7-C11 tüm levhaların sigara-ilaç ve araç denetimleri yaydıkları pozlama için kullanılmak üzere transfected devam et.

4. refeed hücreleri aşağıdaki gün

  1. Bir otomatik sıvı işleyicisi plakaların bütün wells refeed için kullanın. Bir 50 µL/s kullanmak için tüm adımları pipetting hız.
    1. Her kuyudan 100 µL Aspire edin ve atık bir rezervuar atın.
    2. Her farklı bir rezervuar olarak bulunur ve orta refed için tabak sayısı için yeterli bir hacmi vardır de 100 µL/iyi önceden ısıtılmış HCORT orta ile refeed.
    3. 4.1.1 ve tüm hücre plakaları refeed için gerektiği kadar 4.1.2 adımları yineleyin.
      1. Atık haznesi gerektiği gibi boş.
      2. Havzanın orta ile gerektiği gibi doldurun.

5. olumlu denetim ekleme

  1. İki gün sonra transfection ve pozlama önce iki saat HFA pozlama için kullanılan ve bir 8-satır seyreltme rezervuar B satır eklemek için HCORT ortamda pozitif kontrol cardamonin 62.5 µM çözeltisi hazırlamak.
    1. CP maruz kalma, hazırlamak ve SKF 86002 bir 25 µM çözümü kullanın.
    2. Pozitif kontrol test plakaları sayısı için yeterli hacmi hazırlayın.
  2. %0.625 çözeltilerine DMSO HCORT Orta (araç kontrol) hazırlamak ve aynı rezervuar C satırına ekleyin.
    1. CP maruz kalma, hazırlamak ve DMSO, % 0.5 çözüm kullanın.
    2. Araç kontrol test plakaları sayısı için yeterli hacmi hazırlayın.
  3. Wells B7-B11 ve C7-C11 her hücre plaka pozitif ve araç denetimleri eklemek ve bir 50 µL/s pipetting kullanmak için otomatik sıvı işleyicisi hız için tüm adımları kullanın. Yalnızca pozitif ve araç denetimleri alacaksınız kuyuları adresi için önceden yapılandırılmış uç kutularını kullanın.
    1. Orta 10 µL kuyulardan B7-B11 ve C7-C11 her hücre plaka kaldırmak ve G ve H 8 satırlık seyreltme baraj gölünün satır atın.
    2. Bu wells için olumlu ve araç kontrolleri 10 µL aktarım ve 3 kez karıştırın.
  4. Bu hücre tabakları da kuluçka için dönmek.
  5. Adımları tüm hücre plakaları olumlu almış kadar 5.4 5.3 ve araç kontrolleri tekrarlayın.

6. HF pozlama kültürlü hücre

Dikkat: HFA aşındırıcı ve akut toksik.

  1. Çift Kişilik nitril eldiven, bir laboratuvar ceket, tek kullanımlık polietilen kol koruyucular ve koruyucu gözlük takan bir kimyasal duman mahallede tüm kimyasal maruziyet işlemleri.
    1. HFA % 48 çözüm olarak elde.
    2. HFA Ultrasaf Su ile % 1 oranında seyreltin ve 5 mL aliquots güvenliğini artırmak için 10 mL kalın duvar Polietilen şişeler içinde saklayın.
    3. Pipet ipuçları ve HFA ve artık herhangi bir sıvı HFA % 2.5 Kalsiyum glukonat tehlikeli atık akışı konusunda önce ile temas rezervuarlar dezenfekte etmek.
  2. 288 µL % 1 ekleyerek bir %0.0036 HFA orta çözüm soruşturma altında her siRNA Kütüphane plaka için hazırlamak HFA 80 ml 150 mL şişe önceden ısıtılmış HCORT orta.
    1. Şişe girdap ve 10 min için kimyasal duman başlıklı bir 37 ° C kuluçka seyreltik HFA kuluçkaya.
  3. HFA orta çözüm yine şişe dönen tarafından mix ve daha sıcak bir tabakta bir reaktif rezervuar HFA orta çözüm ekleyin.
  4. İki teknisyen tandem çalışma ile pozlama gerçekleştirin.
    1. Her bir hücre tabak 12 Kanal pipettor kullanarak iç Wells doğru aspiratı 100 µL teknisyen var ve sonra plaka teknisyen için sol tarafta.
    2. HFA orta çözüm kuyu başına 100 µL eklemek teknisyen soldaki var.
    3. Toxicant için maruz olan tüm hücre plakaları için 6.4.1 ve 6.4.2 adımları yineleyin.
    4. Ayrıca adım 6.4.1 ve 6.4.2 yıkamaya kontrol levha, taze HCORT orta HFA orta çözüm yerine kullanmak için yineleyin.
  5. Kimyasal duman hood kuluçka 20 dk için tabak yerleştirin ve sonra da hücre kültür kuluçka getirin.
  6. Tüm plakaları maruz ve hücre kültür kuluçka için döndürülen bir kez daha önce gösterildiği olumlu denetim ek (adım 5.1-5,5) arasındaki adımları yineleyin.

7. CP pozlama kültürlü hücre

Dikkat: CP akut toksik ve tahriş edici olduğunu.

  1. Çift Kişilik nitril eldiven, bir laboratuvar ceket, tek kullanımlık polietilen kol koruyucular ve koruyucu gözlük takan bir kimyasal duman mahallede tüm kimyasal maruziyet işlemleri.
    1. CP elde etmek.
    2. CP DMSO % 5 oranında seyreltin ve 10 mL aliquots güvenliğini artırmak için 10 mL mercek şişeleri içinde saklayın.
    3. Pipet ipuçları ve CP ve artık herhangi bir sıvı CP % 2.5 Sodyum bisülfit tehlikeli atık akışı konusunda önce ile temas rezervuarlar dezenfekte etmek.
  2. 1 x kalem/Strep ve önceden ısıtılmış PBS için tabak sayısını maruz içeren önceden ısıtılmış HCORT orta yeterli hacim hazırlayın.
  3. Her takım üst plaka veya alt plaka kümesi için % 5'lik 8,04 µL eklemek CP DMSO 50 mL aliquot önceden ısıtılmış HCORT orta ve %0.0008 son CP konsantrasyon için de karışımı için. Tüp sıkıca kap ve çözüm için 1 h kimyasal duman başlıklı bir 37 ° C kuluçka kuluçkaya.
    1. CP ek olarak orta 50 mL aliquots böylece her takım üst plaka maruz ve CP orta 50 mL aliquot eklendikten sonra alt plaka ayarla toxicant tam olarak 1 h alır zaman.
  4. Bir takım üst plaka ve 1 yıkamaya kontrol plaka hücre kültür kuluçka kaldır ve kimyasal duman başlıklı kuluçka dönemi sonuna yakın koyun.
  5. Tüp ters çevirme tarafından CP çözüm mix ve bir reaktif rezervuar 1s kuluçka dönemi sonunda o zaman dikkatle boşaltmak.
  6. İki teknisyen tandem çalışma ile pozlama gerçekleştirin.
    1. Her bir hücre tabak 12 Kanal pipettor kullanarak iç Wells doğru aspiratı 100 µL teknisyen var ve sonra plaka teknisyen için sol tarafta.
    2. CP orta çözüm kuyu başına 100 µL eklemek teknisyen soldaki var.
    3. 7.6.1 7.6.2 için toxicant maruz takım üst plaka tüm hücre plakaları için aygıtlarından.
    4. Ayrıca adım 7.6.1 ve 7.6.2 yıkamaya kontrol levha, taze HCORT orta CP orta çözüm yerine kullanmak için yineleyin.
  7. Tabakları bir 37 ° C Kombine Kuluçka makinesi kimyasal duman başlıklı 10 dakika yerleştirin.
  8. 1 içeren PBS ve HCORT orta yeterli bir birim eklemek kalem/Strep 10 dk kuluçka dönemi sonuna yakın reaktif rezervuarlar için x.
  9. CP çözüm hücre plakalar 12 Kanal pipettor kullanarak kaldırın ve 10 dk kuluçka dönemi sonunda PBS kuyu başına 100 µL ile değiştirin.
  10. Hemen PBS hücre plakalar kaldır ve 1 içeren HCORT orta kuyu başına 100 µL onun yerine kalem/Strep x.
  11. Ayrıca adımları 7.9 ve 7.10 yıkamaya denetim plakalar için yineleyin.
  12. Hücre plakaları standart hücre kültür kuluçka dönün.
  13. 7.3-7.12 alt plaka ayarlamak için yineleyin.
  14. Tüm plakaları maruz ve hücre kültür kuluçka için döndürülen bir kez daha önce açıklandığı gibi olumlu denetim ek (adım 5.1-5,5) arasındaki adımları yineleyin.

8. örnek toplama ve hücre canlılığı tahlil

  1. Yirmi dört saat sonra pozlama, glikoz içeren 10 g/M PBS 0,5 mg/mL MTT substrat çözeltisi hazırlamak ve 37 ° C21' e sıcak. 10 mL substrat denetlesinler her plaka için hazırlayın.
  2. Denetlesinler plakaların numarası için bir rezervuar bir otomatik sıvı işleyicisi üzerinde yeterli hacmi MTT substrat çözeltisi ekleyin.
  3. Örnek toplamak ve MTT substrat 50 µL/s pipetting kullanarak eklemek için otomatik sıvı işleyicisi hızlandırmak için tüm adımları kullanın. Denetlesinler için sadece bu kuyu adrese ucu kutuları önceden yapılandırın.
    1. Hücre plaka ve mevduat 42.5 µL her iki 384-iyi depolama tabak içine iç 60 kuyulardan aspiratı 95 µL of orta.
    2. Hemen 100 µL MTT substrat çözeltisi kuyu başına hücre tabak eklemek ve onları bir hücre kültür kuluçka 1,5 saat için 37 ° C'de kuluçkaya.
    3. Havzanın gerektiği gibi MTT substrat çözeltisi ile tekrar doldur.
  4. Hücre plakaları bir hücre kültür kuluçka için 1 h 37 ° C'de kuluçkaya.
  5. 384-iyi depolama plakalarının ve daha sonraki analiz için-80 ° C'de depolayabilirsiniz.
  6. 8.3-8,5 tüm üst ve alt plaka kümeleri ve ilişkili yıkamaya denetimler için yineleyin.
    1. İpuçları çoğaltır arasında istenen, ancak onları yıkamak MTT substrat çözeltisi ve ne zaman plaka arasında geçiş ayarlar eklerken yeniden.
  7. 1 h kuluçka sonra DMSO yeterli hacmi bir rezervuar üzerinde bir otomatik sıvı işleyicisi ekleyin.
  8. DMSO eklemek ve bir 50 µL/s pipetting kullanmak için otomatik sıvı işleyicisi hızlandırmak için tüm adımları kullanın.
    1. Her hücre plakaların iç Wells 100 µL Aspire edin ve MTT substrat çözeltisi atık bir rezervuar atın.
      1. Atık haznesi gerektiği gibi boş.
    2. Her şey 100 µL DMSO ile yerleşimi.
      1. DMSO rezervuar gerektiği gibi doldurun.
  9. Plakaları 3 min için bir plaka shaker sallamayın.
  10. Bir plaka spektrofotometre kullanarak 570 ve 690 nm absorbans ölçmek.
  11. Arka plan çıkarmak ve yıkamaya denetimler tarafından maruz absorbans değerleri bölerek % hücre canlılığı hesaplayın. Ortalama yıkamaya negatif havuzu siRNA kontrol % hücre canlılığı tüm hedefler için hesaplamak için kullanın.

9. ölçü Il-8 konsantrasyon hücre kültür Supernatants

  1. Ölçü Il-8 konsantrasyon Hayır kullanarak hücre kültür supernatants boncuk tabanlı tahlil üreticinin yönergeleri22göre yıkayın. Örnekleri ve standart eğri karşılamak için bir tahlil plaka düzeni oluşturun.
  2. 384-iyi depolama plakaları-80 ° C dondurucudan kaldırmak, oda sıcaklığında erimek ve kuyu dibinde örnek toplamak için tabak kısaca santrifüj kapasitesi.
  3. Çalışmasına tahlil plaka numarası için yeterli hacmi anti-IL-8 alıcısı boncuk ve biotinylated anti-IL-8 antikor tahlil arabelleği kit ile birlikte olun. Anti-IL8 alıcısı boncuk 50 µL ve biotinylated anti-IL8 antikor tahlil arabelleği 9.9 ml 50 µL oranı kullanın.
    1. Çok kanallı bir pipettor kullanarak, bir siyah 384-iyi depolama plakasına boncuk/antikor karışımı ekleyin.
      1. Kullanım örnekleri ve tahlil plaka düzen göre standart eğri için belirlenmiş wells alıcısı boncuk/antikor ekleyin.
      2. İyi çalışmasına tahlil tabak sayısı için yeterli bir ses ekleyin.
  4. Il-8 Standart 1000 pg/ml hücre kültür 354 µM içeren orta kullanarak sulandırmak NaCl. Çalıştırılacak tahlil tabak sayısı için yeterli hacim yapmak.
  5. Sekiz iki kat seri dilutions standart eğrinin olun.
  6. Standart eğri bir siyah 384-iyi depolama tabak tahlil plaka düzen göre uygun kuyu nüsha ekleyin. İyi çalışmasına tahlil tabak sayısı için yeterli bir ses ekleyin.
    1. Benzer şekilde, hücre kültürü 354 µM içeren orta eklemek NaCl ile arka plan ölçüm için hiçbir Il-8.
  7. Bir otomatik sıvı işleyicisi tahlil gerçekleştirmek için kullanın. Sadece tahlil plaka düzeni tarafından belirlenmiş wells adresi için önceden yapılandırılmış uç kutularını kullanın. Bir 50 µL/s kullanmak için tüm adımları pipetting hız.
    1. 8 µL alıcısı boncuk-antikor karışımı beyaz 384-şey sığ iyi tahlil plakaları wells için transfer.
      1. Sadece örnekleri ve tahlil plaka düzen göre standart eğri için belirlenmiş wells ekleyin.
    2. Standart eğrinin 2 µL tahlil plaka düzen göre sığ iyi tahlil plakaların uygun kuyu aktarın.
    3. 3.54 M NaCl çözüm hazırlamak ve plakaları için otomatik sıvı işleyicisi üzerine sığ bir rezervuar denetlesinler sayısı için yeterli birim ekleme.
    4. Standart eğri NaCl çözüm 4,5 µL siyah 384-iyi depolama plakaları örneklerinde aktararak eşleşmesi için örnekleri tuz konsantrasyonu ayarlayın.
    5. Üç kez 30 µL karıştırma hacmi kullanarak örnekleri mix ve transfer 2 µL sığ beyaza örneklerin de tahlil plakaları tahlil plaka düzen göre.
      1. İpuçları örnek plakalar arasında değiştirin.
    6. İçinde belgili tanımlık karanlık oda sıcaklığında 1 h için kuluçkaya.
    7. Çalışmasına tahlil plaka numarası için yeterli hacim alıcısı boncuk tahlil arabellekte olun. İkincil alıcısı boncuk tahlil arabelleği 12.3 ml 200 µL oranını kullanın.
    8. Çok kanallı bir pipettor kullanarak, ikincil boncuk siyah 384-iyi depolama plakasına ekleyin.
      1. Kullanım örnekleri ve tahlil plaka düzen göre standart eğri için belirlenmiş wells için ikincil boncuk ekleyin.
      2. İyi çalışmasına tahlil tabak sayısı için yeterli bir ses ekleyin.
    9. Otomatik sıvı işleyicisi kullanarak, ikincil boncuk 10 µL beyaz 384-şey sığ iyi tahlil plakaları wells için transfer.
      1. Sadece örnekleri ve tahlil plaka düzen göre standart eğri alınan kuyu ekleyin ve her plaka arasında ipuçları yıkayın.
    10. Bir saat içinde belgili tanımlık karanlık oda sıcaklığında için kuluçkaya.
  8. Tabak tabak mühürler temizleyin ve tahlil ile uyumlu bir plaka okuyucu kullanarak tarama tahlil kapatın. 0.2 mm mesafe plaka ve dedektör, 180 ms uyarma süresi ve 550 ms ölçüm süresi arasında tarama için kullanın.
  9. Ham verileri bir elektronik tabloya Il-8 deneyleri alın.
  10. Il-8 deneyleri standart eğri için uygun otomatik eğri'yi kullanın ve ardından pg/ml her örnek için ham veri dönüştürebilirsiniz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pozlama Yöntem geliştirme

Biz rafine ve HTS çalışmalarda kullanılmak insan kornea epitel hücre satırı SV40-HCEC uygunluğu değerlendirilir. SV40-HCEC SV-40 büyük T antijen kullanarak ölümsüzleştirdi ve Dhanajay Pal23hediyeydi. Çok fazla değişken kısaca burada sunmak için pozlama metodoloji geliştirme keşfedilmeyi vardı ve bu yüzden, biz inanıyoruz bulgular bazı örnekleri daha geniş olabili...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada biz bizim yöntemleri ve sonuçları bir yüksek işlem hacmi kornea epitel hücre modeli HF ve CP yaralanmaları incelenmesi için eleme gelişimi tanımlamak. HF yaralanma için birincil siRNA ekran sonuçlarından da mevcut. HTS modelleri TIC yaralanmaları incelenmesi için geliştirilmesi için pek çok sorun vardı. HF, HFA veya CP çalışmada hücre kültür modelleri ile ilgili literatürde bulabileceğimizi yöntemleri küçük yardımcı oldun. Florür Ion çoğu vitro çalışmalar sözlü hücreleri içerir ve sodyum florür değil, HF ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa gerek yok.

Yasal uyarı: Bu makalede görüşler yazar(lar) aittir ve ordu bölümü, Savunma Bakanlığı veya ABD hükümeti resmi politikasının yansıtmamaktadır. Bu araştırma NIH/NIAID ve USAMRICD arasında bir kurumlararası anlaşma tarafından desteklenen ve kısmen meşe tarafından randevu lisansüstü araştırma katılım programı, ABD Ordusu Tıbbi Araştırma Enstitüsü kimyasal savunma için tarafından yönetilen Ridge Enstitüsü bilim ve eğitim ABD Enerji Bakanlığı ve USAMRMC arasında bir kurumlararası anlaşma yoluyla.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu araştırma ulusal kurumları, sağlık karşı koymak Program kurumlararası anlaşma # AOD13015-001 tarafından desteklenmiştir. Stephanie Froberg ve Peter Hurst çabaları ve video üretimi uzmanlık için teşekkür etmek istiyorum.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Bravo sıvı taşıma platformuAgilent veya eşdeğeriG5409A
Bravo plaka çalkalayıcıAgilent veya eşdeğeriSeçenek 159
Bravo 96LT tek kullanımlık uç başlığıAgilent veya eşdeğeriSeçenek 17896 kanallı büyük uçlu pipetleme başlığı ünitesi
Bravo 96ST tek kullanımlık uç başlığıAgilent veya eşdeğeriSeçenek 17796 kanallı küçük uçlu pipetleme kafa ünitesi
Bravo 384ST tek kullanımlık uç başlığıAgilent veya eşdeğeriSeçenek 179384 kanallı küçük uçlu pipetleme kafası ünitesi
Bravo 96 250 μ L steril bariyer uçlarıAgilent veya eşdeğeri19477-022
Bravo 384 30 μ L steril bariyer uçlarıAgilent veya eşdeğeri19133-212
Bravo 384 70 & mu; L steril bariyer uçlarıAgilent veya eşdeğeri19133-212
EnSpire çok modlu plaka okuyucuPerkin Elmer veya eşdeğeri2300-0000AlphaLISA tahlil dedektörü, yüksek güçlü lazer uyarımlı
IL-8 (insan) AlphaLISA Algılama Kiti (insan);Perkin Elmer veya eşdeğeriAL224Fyıkamasız boncuk bazlı test
ProxiPlate-384 Plus beyaz 384 sığ kuyu mikroplakalarıPerkin Elmer veya eşdeğeri6008359
Lipofektamin RNAiMAXInvitrogen veya eşdeğeri13778500Transfeksiyon reaktifi
Opti-MEM 1 Azaltılmış Serum Ortamıİnvitrojen veya eşdeğeri31985070
TrypLE ExpressGibco veya eşdeğeri12605010Hücre ayırma çözümü
IncuCyte ZoomEssen Instruments veya eşdeğeriESSEN BIOSCI 4473İnkübatörde barındırılan otomatik mikroskop
ChloropicrinTrinity Manufacturing veya eşdeğeriN/AAkut toksisite ve tahriş edici
DMEM-F12 hücre kültürü ortamıInvitrogen veya eşdeğeri11330-057HEPES içerir
Fetal sığır serumuİnvitrojen veya eşdeğeri1891471
İnsan epidermal büyüme faktörü (hücre kültürü derecesi)İnvitrojen veya eşdeğeriE9644-.2MG
Rekombinant insan insülini (hücre kültürü derecesi)İnvitrojen veya eşdeğeri12585-014
Penisilin-Streptomisin çözeltisi (hücre kültürü derecesi)İnvitrojen veya eşdeğeri15140122
Hidrokortizon (hücre kültürü sınıfı)Sigma veya eşdeğeriH0888-10G
Glikoz ve nbsp; (hücre kültürü derecesi)Sigma veya eşdeğeriG7021
PBS  (hücre kültürü derecesi)Sigma veya eşdeğeriP5493
siRNA, Dharmacon veya eşdeğeriçeşitli
Tiazolil mavisi tetrazolyum bromürSigma veya eşdeğeriM5655MTT tahlili substrat
siRNA tamponuTermo veya eşdeğeriB002000
96 oyuklu hücre kültürü plakalarıCorning veya eşdeğeriCLS3595
T150 hücre kültürü şişelerCorning veya eşdeğeriCLS430825
BSL-2 hücre kültürü başlığıNuaire veya eşdeğeriNU-540
300 mL robotik rezervuarlarTermo veya eşdeğeri12-565-572 
96 şaşkın otomasyon rezervuarıThermo veya eşdeğeri1064-15-8
500 mL steril tek kullanımlık saklama şişeleriCorning veya eşdeğeriCLS430282
Mikroplaka ısı yalıtım malzemesiTermo veya eşdeğeriAB-1443A Mikroplaka
ısı yalıtım folyosuTermo veya eşdeğeriAB-0475
KakuleninTocris veya eşdeğer2509Anti-enflamatuar, pozitif kontrol olarak kullanılır
SKF 86002 Tocris veya eşdeğeri2008Anti-enflamatuar, pozitif kontrol olarak kullanılır
DMSOSigma veya eşdeğeriD8418
%48 hidroflorik asitSigma veya eşdeğeri339261Aşındırıcı ve akut toksisite
1000 μ L Tek kanallı pipetleyicilerRainin veya eşdeğeri17014382
200 μ L Tek kanallı pipetleyicilerRainin veya eşdeğeri17014391
20 μ L Tek kanallı pipetleyicilerRainin veya eşdeğeri17014392
1000 μ L 12 kanallı pipetleyicilerRainin veya eşdeğeri17014497
200 μ L 12 kanallı pipetleyicilerRainin veya eşdeğeri17013810
20 μ L 12 kanallı pipetleyicilerRainin veya eşdeğeri17013808
Pipet uçları 1000 μ LRainin veya eşdeğeri17002920
Pipet uçları 200 μ LRainin veya eşdeğeri17014294
Pipetleyici uçları 20 μ LRainin veya eşdeğeri17002928
Kimyasal davlumbazJamestown Metal ÜrünleriMHCO_229
384 kuyulu numune saklama plakalarıTermo veya eşdeğeri262261
Sodyum klorürSigma veya eşdeğeriS6191
50 mL konik tüplerTermo veya eşdeğeri14-959-49A
Serolojik pipetler 50 mLCorning veya eşdeğeri07-200-576
Serolojik pipetler 25 mLCorning veya eşdeğeri07-200-575
Serolojik pipetler 10 mLCorning veya eşdeğeri07-200-574
Serolojik pipetler 5 mLCorning veya eşdeğeri07-200-573
SV40-HCEC ölümsüzleştirilmiş insan kornea epitel hücreleriN/AN/ABu hücreler ticari olarak mevcut değildir, ancak
Sceptor Handheld Automated Cell CounterMillipore veya eşdeğeriPHCC20060
GeneTitan Çok Kanallı (MC) EnstrümanAffymetrix veya eşdeğeri00-0372
Affymetrix 24 ve 96 dizi plakalarıAffymetrix veya eşdeğeri901257; 901434
Draegger makalesinde belirtilen araştırmacılardan elde edilebilir. tüp HFDraeger veya eşdeğeri8103251
Draegger tüp CPDraeger veya eşdeğeri8103421
Draegger pompasıDraeger veya eşdeğeri6400000
Şeffaf Plaka contalarıResesarch Products International veya eşdeğeri202502
Reaktif rezervuarlarıVistaLab Technologies veya eşdeğeri3054-1000
Otomatik eğri uydurma için kullanılanXlfit IDBS veya eşdeğeriN/A
Excel eklentisi

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Randleman, B. Drugs, Diseases and Procedures. Hampton, R. , Medscape. (2011).
  2. Fish, R., Davidson, R. S. Management of ocular thermal and chemical injuries, including amniotic membrane therapy. Current Opinion in Ophthalmology. 21 (4), 317-321 (2010).
  3. Wang, X. A review of treatment strategies for hydrofluoric acid burns: current status and future prospects. Burns. 40 (8), 1447-1457 (2014).
  4. Gaytan, B. D., Vulpe, C. D. Functional toxicology: tools to advance the future of toxicity testing. Frontiers in Genetics. 5, 110(2014).
  5. North, M., Vulpe, C. D. Functional toxicogenomics: mechanism-centered toxicology. International Journal of Molecular Sciences. 11 (12), 4796-4813 (2010).
  6. McManus, M. T., Sharp, P. A. Gene silencing in mammals by small interfering RNAs. Nature Reviews Genetics. 3 (10), 737-747 (2002).
  7. Bassik, M. C. A systematic mammalian genetic interaction map reveals pathways underlying ricin susceptibility. Cell. 152 (4), 909-922 (2013).
  8. Solaimani, P., Damoiseaux, R., Hankinson, O. Genome-wide RNAi high-throughput screen identifies proteins necessary for the AHR-dependent induction of CYP1A1 by 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin. Toxicological Sciences. 136 (1), 107-119 (2013).
  9. Cox, J. A., Gooding, R., Kolakowski, J. E., Whitmire, M. T. Chemical Terrorism Risk Assessment; CSAC 12-006. , U.S. Department of Homeland Security, Science and Technology Directorate, Chemical Security Analysis Center. Aberdeen Proving Ground, MD. (2012).
  10. Zang, R., Li, D., Tang, I., Wang, J., Yang, S. Cell-Based Assays in High-Throughput Screening for Drug Discovery. International Journal of Biotechnology for Wellness Industries. 1, 31-51 (2012).
  11. Ray, R., Hauck, S., Kramer, R., Benton, B. A convenient fluorometric method to study sulfur mustard-induced apoptosis in human epidermal keratinocytes monolayer microplate culture. Drug and Chemical Toxicology. 28 (1), 105-116 (2005).
  12. Ruff, A. L., Dillman, J. F. 3rd Sulfur mustard induced cytokine production and cell death: investigating the potential roles of the p38, p53, and NF-kappaB signaling pathways with RNA interference. Journal of Biochemical and Molecular Toxicology. 24 (3), 155-164 (2010).
  13. Smith, W. J., Gross, C. L., Chan, P., Meier, H. L. The use of human epidermal keratinocytes in culture as a model for studying the biochemical mechanisms of sulfur mustard toxicity. Cell Biology and Toxicology. 6 (3), 285-291 (1990).
  14. Toxnet. , https://toxnet.nlm.nih.gov/ (2016).
  15. Bancroft, W. D. The Medical Department of the United States Army in the World War. 14, Otis Historical Archives, National Museum of Health and Medicine. (1926).
  16. Chloropicrin Risk Characterization Document. , California Environmental Protection Agency. (2012).
  17. Aigueperse, J., et al. Fluorine Compounds, Inorganic. Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry. , Wiley-VCH. (2000).
  18. Sotozono, C. Second Injury in the Cornea: The Role of Inflammatory Cytokines in Corneal Damage and Repair. Cornea. 19 (6), S155-S159 (2000).
  19. Guidelines and Recommendations for Dharmacon siRNA Libraries. , http://dharmacon.gelifesciences.com/uploadedFiles/Resources/sirna-libraries-guidelines.pdf (2015).
  20. Lipofectamine RNAiMAX Reagent. , https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/migration/files/cell-culture/pdfs.par.72509.file.dat/Lipofectamine%20rnaimax%20protocol%20v2.0.pdf (2017).
  21. Denizot, F., Lang, R. Rapid colorimetric assay for cell growth and survival. Modifications to the tetrazolium dye procedure giving improved sensitivity and reliability. Journal of Immunological Methods. 89 (2), 271-277 (1986).
  22. IL-8 (human) AlphaLISA Detection Kit, 5,000 Assay Points. , http://www.perkinelmer.com/searchresult?searchName=AL224F&_csrf=dd35c533-8dc4-4005-a87f-c5ab3a519bf3 (2016).
  23. Araki-Sasaki, K. An SV40-immortalized human corneal epithelial cell line and its characterization. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 36 (3), 614-621 (1995).
  24. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
  25. Ruff, A. L. Development of a mouse model for sulfur mustard-induced ocular injury and long-term clinical analysis of injury progression. Cutaneous and Ocular Toxicology. 32 (2), 140-149 (2013).
  26. GeneTitan MC Instrument North America/Japan (110V). , https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/00-0372?SID=srch-srp-00-0372 (2018).
  27. Zhang, X. D. A pair of new statistical parameters for quality control in RNA interference high-throughput screening assays. Genomics. 89 (4), 552-561 (2007).
  28. He, H. Effect of Sodium Fluoride on the Proliferation and Gene Differential Expression in Human RPMI8226 Cells. Biological Trace Element Research. 167 (1), 11-17 (2015).
  29. Tabuchi, Y., Yunoki, T., Hoshi, N., Suzuki, N., Kondo, T. Genes and gene networks involved in sodium fluoride-elicited cell death accompanying endoplasmic reticulum stress in oral epithelial cells. International Journal of Molecular Sciences. 15 (5), 8959-8978 (2014).
  30. Pesonen, M. Chloropicrin-induced toxic responses in human lung epithelial cells. Toxicology Letters. 226 (2), 236-244 (2014).
  31. Wilhelm, S. N., Shepler, K., Lawrence, L. J., Lee, H. Fumigants: Environmental Fate, Exposure, and Analysis. Seiber, J. N., et al. 652, American Chemical Society. Ch. 8 (1997).
  32. Adamek, E., Pawlowska-Goral, K., Bober, K. In vitro and in vivo effects of fluoride ions on enzyme activity. Annales Academiae Medicae Stetinensis. 51 (2), 69-85 (2005).
  33. Heard, K., Hill, R. E., Cairns, C. B., Dart, R. C. Calcium neutralizes fluoride bioavailability in a lethal model of fluoride poisoning. Journal of Toxicology: Clinical Toxicology. 39 (4), 349-353 (2001).
  34. Sparks, S. E., Quistad, G. B., Casida, J. E. Chloropicrin: reactions with biological thiols and metabolism in mice. Chemical Research in Toxicology. 10 (9), 1001-1007 (1997).
  35. Sparks, S. E., Quistad, G. B., Li, W., Casida, J. E. Chloropicrin dechlorination in relation to toxic action. Journal of Biochemical and Molecular Toxicology. 14 (1), 26-32 (2000).
  36. Byron, K. A., Varigos, G., Wootton, A. Hydrocortisone inhibition of human interleukin-4. Immunology. 77 (4), 624-626 (1992).
  37. van der Poll, T., Lowry, S. F. Lipopolysaccharide-induced interleukin 8 production by human whole blood is enhanced by epinephrine and inhibited by hydrocortisone. Infection and Immunity. 65 (6), 2378-2381 (1997).
  38. Solomon, A. Doxycycline inhibition of interleukin-1 in the corneal epithelium. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (9), 2544-2557 (2000).
  39. Mishra, P. K. Mitochondrial oxidative stress-induced epigenetic modifications in pancreatic epithelial cells. International Journal of Toxicology. 33 (2), 116-129 (2014).
  40. Stockholm, D. The origin of phenotypic heterogeneity in a clonal cell population in vitro. PLoS One. 2 (4), e394(2007).
  41. ATCC Animal Cell Culture Guide. , American Type Culture Collection. Manassas, VA. (2014).
  42. Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. Journal of Biomolecular Screening. 8 (5), 566-570 (2003).
  43. Mpindi, J. P. Impact of normalization methods on high-throughput screening data with high hit rates and drug testing with dose-response data. Bioinformatics. 31 (23), 3815-3821 (2015).
  44. Zhang, X. D. Illustration of SSMD, z score, SSMD*, z* score, and t statistic for hit selection in RNAi high-throughput screens. Journal of Biomolecular Screening. 16 (7), 775-785 (2011).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Kornea Epitel H creleriHidroflorik Asit MaruziyetiKloropikrin ToksisitesiH cre Canl l AnaliziIL 8 retimiOtomatik S v leyici96 Kuyucuklu Plaka EkimlemeMTT Analizi ProtokolBoncuk Tabanl IL 8 Tespiti

İlgili makaleler