Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Doku çok az miktarda kullanarak Drosophila Permeabilized liflerinin mitokondrial oksijen harcama ölçme noktalar

11.7K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/57376

⸱

7 Nisan 2018

 ,  ,  ,  , 
1Département de chimie et biochimie, Université de Moncton, 2Département de biologie, Université de Moncton

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Bu yazıda, oksijen tüketimi yüksek çözünürlüklü basınçlırespirometri Drosophila permeabilized thoraxes içinde kullanarak ölçmek için bir yöntem açıklanır. Bu teknik doku klasik mitokondrial yalıtım tekniği için karşılaştırıldığında çok az bir miktar gerektirir ve elde edilen sonuçlar daha fizyolojik ilgilidir.

Özet

Meyve sineği Drosophila melanogaster, metabolizma incelenmesi için gelişmekte olan bir modeli temsil eder. Nitekim, drosophila yapıları için insan organlarını homolog var, son derece korunmuş metabolik yollar sahip ve farklı temel mekanizmaları çalışmanın kısa bir süre içinde sağlar nispeten kısa bir ömrü var. Ancak, bir hücre metabolizması, mitokondrial solunum için gerekli mekanizmaları iyice bu modelde araştırmış değil ki şaşırtıcı olduğunu. Çünkü Drosophila mitokondrial solunum ölçüsü genellikle bireylerin çok sayıda gerektirir ve elde edilen sonuçlar son derece tekrarlanabilir değildir muhtemeldir. Burada, hassas ölçüm Drosophila dokudan en az miktarda kullanarak mitokondrial oksijen tüketimi sağlayan bir yöntem açıklanmıştır. Bu yöntemde, thoraxes disseke ve hem keskin Forseps ile mekanik ve kimyasal olarak farklı bileşikleri hücre zarı geçmek ve mitokondrial solunum modüle izin saponin ile permeabilized. Permeabilization sonra bir uncoupler ve birkaç inhibitörleri onların yanıt yanı sıra farklı yüzeylerde, okside için farklı kompleksler elektron taşıma sistemi (ETS) kapasitesini değerlendirmek için bir iletişim kuralı gerçekleştirilir. Bu yöntem olarak daha fizyolojik ilgili çünkü mitokondri hala hücresel diğer bileşenlerle etkileşim vardır ve mitokondrial Morfoloji korunmuş mitokondrial izolasyonları, kullanma yöntemlerine göre birçok avantajı sunuyor. Ayrıca, örnek hazırlıklar daha hızlı, ve elde edilen sonuçlar son derece tekrarlanabilir. Metabolizma çalışma ile mitokondrial solunum değerlendirilmesi için bir model olarak Drosophila avantajları birleştirerek, önemli yeni bir bilgi-ebilmek var olmak örtüsünü açmak, özellikle ne zaman sinekler karşılaşan farklı çevresel veya patofizyolojik koşullar.

Giriş

Meyve sineği Drosophila melanogaster, bir model organizma genetik araştırma için bir yüzyıl1kullanılmıştır. Bu organizma çalışmanın yalnızca önemli temel bilgi sex-linked miras2, mutasyon oranı3, sinir sisteminin geliştirilmesi ve hücre kader tayini4hakkında yol açmıştır değil ama aynı zamanda son zamanlarda ortaya çıkmıştır bir 5,6Alzheimer ve Parkinson gibi çeşitli hastalıklara doğal mekanizmaları incelemek için değerli bir araç. Ayrıca, yaşlanma sürecini çalışma boşluğunda büyük numara kısa bir süre içinde yükseltilebilir ve kısa bir ömrü var gibi popüler modelidir. Onlar da bir kalp, oenocytes (hepatosit benzeri hücreleri), yağ (karaciğer ve beyaz yağ dokusu benzer şekilde işleyen) organları, insülin üreten hücreleri (β-pankreas hücreleri eşdeğeri), gibi insan organlarını homolog yapılara sahip yanı sıra metabolitler (omurgalılar kan için benzer)7taşıma hemolymph. Ayrıca, ara metabolizma (insülin/İnsülin benzeri büyüme faktörü benzeri sinyal yolu ve hedef Rapamycin-TOR yolları dahil olmak üzere) Merkezi yollar da son derece korunmuş7vardır. Bu nedenlerden dolayı Drosophila son zamanlarda istismar metabolizmasında, patolojik koşulları diyabet8gibi insan metabolik hastalıklar için doğal özellikle kontrol temel mekanizmaları açıklamak için. Metabolizma bir büyük mitokondri ATP üretimi, oksidatif fosforilasyon süreci (OXPHOS) ile birden çok yolları entegre ve hayatın en önemli biyolojik işlevlerden birini gerçekleştiren bileşendir. Organizmanın metabolizma onların merkezi rolü göz önüne alındığında, mitokondriyal işlev bozuklukları Parkinson9 ve Alzheimer hastalıkları10gibi birçok hastalığın yanı sıra amyotrofik lateral skleroz katılmaktadırlar şaşırtıcı değil. 11 , 12. onlar da yaşlanma sürecini temel belirleyicileri bulunmaktadır. Nitekim, hücresinde, hücre-oksidatif hasar11yüksek konsantrasyon, zararlı olabilen Reaktif oksijen türleri (ROS) ana ürete ülkelerdir. Yaşlanma da zarar görmüş veya mutasyona uğramış mitokondrial DNA13, mitophagy işlev bozuklukları14,15 yanı sıra mitokondrial Biyogenez16bozulma birikimi ilişkili olduğu düşünülmektedir. Onlar-ebilmek kullanmak belgili tanımlık bolluk ya da kıtlık macronutrients17,18göre çeşitli hücresel fonksiyonları ayarlamak için farklı yüzeylerde gibi mitokondri anahtar hücrenin homeostazı belirleyicileri de vardır.

Gerçekten de, diyet (karbonhidratlar, yağlar ve proteinler) farklı besinleri sindirmek, emilir ve hücrelere taşınan. O zaman içinde sitozol dönüştürülür ve türetilmiş yüzeylerde NADH ve FADH219gibi azalan bakiyeli eşdeğerleri nerede ürettikleri mitokondrial matris içine taşınır. Bu azalan bakiyeli eşdeğerleri sonra elektron taşıma sistemi (ETS) farklı enzimatik kompleksleri tarafından okside. Bu komplekslerin mitokondriyal iç zar gibi karmaşık katıştırılır ben ve karmaşık II. Ayrıca, mitokondrial gliserol-3-fosfat dehidrogenaz ve prolin dehidrojenaz gibi enzimatik diğer kompleksler elektron girileceği alternatif rotalar ETS20,21temsil eder. 'Alternatif' Bu komplekslerin böcekler, özellikle önemlidir olarak tür göre onlar aktif olarak solunum20,22,23,21artırmak için katılabilir. Besleme sistemleri bu ETS elektron ubiquinone ve daha sonra karmaşık III ve sonra için karmaşık IV, son alıcısı, moleküler oksijen kadar aktarılır. Bu elektron transferi karmaşık V (şekil 1), ATP ADP fosforilasyon giderken iç mitokondri zar arasında bir proton-güdü güç oluşturur. Mitokondri içinde hücrenin Homeostazı, mitokondriyal metabolizma ilgili modeli D. melanogaster temsil kullanarak eğitim merkezi rolü çeşitli temel mekanizmaları betimlemek için güçlü bir araç patofizyolojik dikkate alınarak koşullar veya hücresel ve çevresel stres altında. Şaşırtıcı ancak, çalışmalar sadece bir avuç aslında Drosophila24,25,26mitokondrial solunum ölçülür. Nitekim, mitokondrial oksijen tüketimi değerlendirmek amaçlayan deneyler mitokondri yalıtımı. Farklı mitokondrial işlevleri (örneğin, ROS üretim veya P/O oranına işaret mitokondrial verimliliği27,28) ölçümü için avantajlı olmasına rağmen bu izolasyonların genel olarak oldukça büyük miktarda gerektirir dokusunun birkaç bireyler24,29. Önemli bir sınırlayıcı faktör, özellikle tüm kişiler aynı yaşta olmalıdır dikkate alınarak ve tercihen deneyler için aynı Cinsiyeti, solunum farklı zamanda ölçüsü yapım yüksek miktarda doku ve bireyler için bu gereklidir En iyi ihtimalle zahmetli işaret eder. Mitokondrial izolasyonların mitokondriyal metabolizma yöneten temel mekanizmaları önemli içgörü sağlayabilir, Ayrıca, mitokondri ayırmak için kullanılan yöntemleri yinelenebilir sonuçları elde etmek için zorluk gibi çeşitli dezavantajları vardır , bozulma mitokondrial ağın ve değişiklik mitokondri yapısı ve fonksiyonu29,30,31.

Bu çalışmada dokudan çok kaç kişi en az bir miktarda kullanarak Drosophila mitokondrial oksijen tüketimini ölçmek için sağlam bir protokolü sunmaktır. Bu iletişim kuralı mitokondrial oksijen tüketimi in situ permeabilized kas lifleri29 Drosophila thoraxes üzerinden yüksek çözünürlüklü basınçlırespirometri32,33, ile birlikte kullanarak ölçme oluşur 34 , 35. bu yöntem aynı zamanda diğer bileşenlerle etkileşimleri hücrenin de mitokondri yapısı ve fonksiyonu daha içinde korunur gibi permeabilized bu yana klasik mitokondrial izolasyon yöntemine göre ek avantajları vardır Bu yaklaşım daha fizyolojik ilgili yapan lifleri29,31,36. Bu iletişim kuralıyla, mitokondriyal işlev doğru yüksek çözünürlüklü basınçlırespirometri Drosophila, sadece üç thoraxes içinde oksijen tüketimi belirlenmesi ETS birkaç farklı adımları izin yüzeyler ile değerendirilmek. Bu nedenle, bu iletişim kuralını Drosophila modeli yararlanarak metabolizma birçok çevresel veya patofizyolojik durum bağlamında kontrol temel mekanizmaları hakkında önemli sorulara cevap yardımcı olabilir.

ETS birkaç farklı adımlar oksijen tüketimini ölçmek ve ne kadar farklı yüzeylerde değerlendirmek için katkıda solunum, farklı yüzeylerde (şekil 1), uncoupler ve inhibitörleri vardır kullanılan30 sonra permeabilization doku. Özellikle, farklı yüzeylerde sıralı eklemeler elektronları ETS farklı kompleksleri ile giriş uyarmak için yapılır. Bir uncoupler karbonil siyanür 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP), sonra sigara birleştiğinde solunum ölçmek için en uygun konsantrasyonu ekledi, Yani, sigara phosphorylating solunum maksimal oksijen tüketimi teşvik. Sıralı engellemeler konut projeleri ı, II ve III sonra sigara-ETS oksidasyon tepkiler nedeniyle kalan oksijen tüketimini izlemek için gerçekleştirilir. Son olarak, karmaşık IV maksimal solunum kapasitesi N, N, N iğne ile değerlendirilebilir ', N, - Tetramethyl - p-boya (TMPD), bir yapay elektron sağlayıcı ve askorbat. Ondan beri onun'hangi sinekler yetiştirilir sıcaklık deneyleri 24 °C yürütülen unutmamak gerekir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. reaktifler hazırlık

  1. Aşağıdaki çözümleri diseksiyon ve permeabilization doku için hazırlayın.
    1. Koruma çözüm hazırlamak: 2.77 mM CaK2EGTA, 7.23 mM K2EGTA, 5,77 mM Na2ATP, 6.56 mM MgCl2, 20 mM taurin, 15 mM Na2phosphocreatine, 20 mM imidazole, 0,5 mM dithiothreitol ve 50 mM K-MES, pH 7.1 (saklanabilir -20 ° C'de).
    2. Saponin çözüm hazırlamak: saponin koruma çözümü 1 ml 5 mg (taze günlük hazırlamak).
  2. Aşağıdaki çözümleri Solunum ölçüm için hazırlayın.
    1. Solunum orta hazırlamak: 120 mM KCl, 5 mM KH2PO4, 3 mM HEPES, 1 mM EGTA, 1 mM MgCl2ve % 0,2 BSA (w/v), pH 7.2.
    2. Hazırlamak yüzeylerde, uncoupler, inhibitörleri. H2O tüm yüzeylerde dağıtılması ve uncoupler FCCP yanı sıra inhibitörleri (malonat H2O seyreltilmiş) dışında mutlak etanol içinde çözülür. En yüzeylerde hem de malonat ( Tablo malzemelerigörmek) etkisiz hale getirin. Tüm konsantrasyonları iletişim kuralında verilen 2 mL Odaları içinde son konsantrasyonları vardır.

2. hazırlık ve yüksek çözünürlüklü Respirometer kalibrasyonu.

  1. Chambers, kapaklar ve stoper respirometer % 70 etanol ile üç kez ve üç kez distile su ile yıkayın.
  2. Sıfır oksijen konsantrasyonu kalibre: solunum orta odalarında 2.3 mL damlalıklı ve 10 mg sodyum dithionite ekleyin. Odası maksimum hacmi 2 mL olsa da, 2.3 mL hiçbir hava kabarcığı odaları kapatırken tıpa altında kalmasını sağlamak için eklenir. Chambers stoper ile kapatın ve oksijen konsantrasyonu 10-20 dk. Ayarla'ya elektrotlar, sıfır oksijen konsantrasyonu ile elde edilen oksijen tüketim oranını ölçmek.
  3. Odaları distillated su ile yıkama, 10 min için mutlak etanol içinde kuluçkaya ve sonra distile su ile durulayın.
  4. Hava doygunluk ayarlama: solunum orta odalarında, 2.3 mL damlalıklı stoper yerleştirin, stoper üstüne fazla orta Aspire edin ve daha sonra stoper rondela ile kaldırın. Aşırı solunum orta odasında (2 mL toplam hacmi) odaları kapattıktan sonra hava kabarcıkları varlığı önlemek için pipetted.
  5. 45 dk kadar oksijen konsantrasyonu (Mavi izle) 250 istikrarlı bir saat için oksijen tüketimini izlemek 24 ° C'de nM

3. diseksiyon sinekler ve doku Permeabilization

  1. Buz üzerinde gerçekleştirilen tüm adımlar emin olun.
  2. Altı erkek sinek aynı baskı uyuşturan, aynı yaş ve aynı diyet (vahşi tipi w1118, 15 günlükken, Mısır unu ortamda beslenen) Sineklerin Tanrısı disseksiyon kolaylaştırmak için buz üzerinde büyüdü.
  3. Bir neşter ve ince uçlu forseps kullanarak, (başkanları ve abdomens kaldırmak) sinekler sadece uçuş kasları içeren thoraxes tutmak için incelemek. Bu adım-ebilmek kılınmak çıplak gözle. Elde edilen thoraxes ince uçlu Forseps ile başa.
  4. Üç disseke thoraxes 25 mm 2 mL forseps kullanarak buz gibi koruma çözeltisi içeren Petri kabına aktarın.
  5. İnce uçlu Forseps ile mekanik forseps ucu thoraxes ekleyerek thoraxes permeabilize ve art arda gevşek bağlı ağı elde etmek için doku altını üstüne getirin.
  6. 24-şey tabak içinde iki kuyu 12.5 µL saponin çözüm ve 1 mL saponin 62.5 µg/mL nihai bir konsantrasyon elde etmek için koruma çözeltisi ile doldurun. İki bitişik wells solunum orta 1 mL ile doldurulması.
  7. İnce uçlu Forseps ile seyreltilmiş saponin çözüm içine üç permeabilized thoraxes transfer ve üzerinde bir orbital Çalkalayıcı, buz üzerinde 20 dk hafif ajitasyon ile kuluçkaya.
  8. Sonra ikinci kuluçka, lifler buzda saponin durulama 5 min için hafif ajitasyon ile solunum orta dolu bitişik kuyu içine aktarın.

4. kuru ağırlığı tayini

  1. Emici bir yüzeyi permeabilized thoraxes kuru ve 3 - 4 kez tüm nem kaldırılır emin olmak için ince uçlu forseps kullanarak ters çevirin.
  2. Üç thoraxes birlikte bir microbalance üzerinde tartın. Mitokondrial oksijen tüketim oranları normalleştirmek için kullanılacak elde edilen ağırlık not edin.
  3. Solunum orta bir damla ve dokularda hemen buza aktarın.

5. oksijen tüketim oranları belirlenmesi

  1. Respirometer odaları açın (stoper kaldırmak) ve 10 mM pyruvate ve malat 2 mM her odanın içine ekleyin.
  2. Permeabilized dokuları doğrudan solunum orta ile dolu odaları içine ekleyin.
  3. Stoper spacer kullanarak değiştirin.
  4. 60 mL şırınga ile oksijen doğrudan bir oksijen tankından toplamak ve 2-5 mL oksijen tıpa kılcal Oksijen difüzyon yoluyla doku oksijen tüketimini sınırlamak değil emin olmak için her odası yoluyla enjekte.
  5. Bir Hamilton şırınga thoraxes odasında kalır emin olmak için her tıpa kılcal takın.
  6. Oksijen konsantrasyonu yaklaşık 400 olduğunda odaları tamamen kapatmak nM, hava doygunluk oksijen seviyeleri elde (yaklaşık %160 hava doygunluk) Odalar içinde.
  7. Durdurun ve hava kabarcıkları odalarında denetlemek için karıştırıcı başlatın.
  8. Daha önce kitle özgü oksijen tüketimi (pmol O2 consumed.s-1.mg-1 doku) görüntüleme solunum oranları doku (mg), kitle tarafından normalize etmek tartılır doku kütlesi girin.
  9. Oksijen tüketimi (kırmızı izle) stabil bir kez, 5 mM ADP Hamilton şırınga ile ekleyin.
  10. Şırınga ile distile su, % 70 etanol, her enjeksiyon sonra durulama ve tekrar distile su.
  11. Oksijen tüketimi daha istikrarlı bir kez, 4 mm sitokrom c 5 µL enjekte et.
  12. ETS mitokondrial oksijen tüketimi farklı adımları değerlendirmek için aşağıdaki yüzeylerde sıralı enjeksiyon için devam edin:
    1. 2 M prolin 5 µL ekleyin.
    2. 1 M süksinat 10 µL ekleyin.
    3. Bir 1 M gliserol-3-fosfat 30 µL ekleyin.
  13. Titrasyon şekilde uncoupler FCCP 0.5-1 adımlarla enjekte µM (1 mM çözüm 2 µL) en iyi toplama kadar olduğunu ulaştı, Yani, en yüksek oksijen tüketimi inhibisyon mümkün ulaşmak için konsantrasyon (dikkat: tablo bkz: malzemelerin).
  14. Ardışık olarak tamamen kalan oksijen tüketimi (ROX) ölçmek için ETS elektron akı etkisizleştirmek için aşağıdaki inhibitörü enjekte Siklooksijenaz reaksiyonlar diğerleri arasında gibi yani sigara-solunum reaksiyonları:
    1. 1 mM rotenon 1 µL ekleyin (dikkat: Tablo malzemelerigörmek).
    2. 2 M malonat 5 µL ekleyin (dikkat: Tablo malzemelerigörmek).
    3. 5 mM antimycin A 1 µL ekleyin (dikkat: Tablo malzemelerigörmek).
  15. 0.2 mM askorbat ve 0,5 karmaşık IV oksijen tüketimi ölçmek için askorbat ile başlayan mM TMPD Odaları, sırayla içine ekleyin.
  16. Karmaşık IV etkisizleştirmek için sodyum azid 20 mM ekleyin (dikkat: Tablo malzemelerigörmek).
  17. Sinyal sabit olduğunda, odaları rondela ile açık odaları 2 mL saf oksijen enjekte edilerek yeniden oksijen ve konsantrasyonu etrafta olduğunda odaları yakın 250-300 nmol.mL-1.
  18. 10-15 dk işaretimi ölçmek ve kimyasal arka planda, Yani, TMPD autoxidation nedeniyle oksijen tüketimini hesaplamak.

6. Respirometer temizlik

  1. Ölçümler sonra bir kez chambers distile su ile durulayın ve odalarında üç kez % 70 etanol durulayın.
  2. İnhibitörleri devre dışı bırakabilirsiniz için 10 dakika için mutlak etanol içinde kuluçkaya.
  3. Üç kez distile su ile durulayın, odaları ile % 70 etanol doldurmak ve Tıpalar ve kapaklar sonraki kullanımı kadar değiştirebilirsiniz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Yukarıda açıklanan protokolünü kullanarak mitokondrial oksijen tüketimi temsilcisi bir iz Şekil 2' de verilmiştir. Pyruvate ve odalarında permeabilized kas lifleri ile birlikte enjekte malat denir ne zaman karmaşık ben ETS tarafından uyarılır NADH pyruvate ve malat yolu ile oksidasyon yoluyla üretilen CI-sızıntı solunum için Yani, tricarboxylic asit döngüsü (CI). Bu solunum hızı sırasında mitokondrial oksijen çoğunlukla proton sızıntı için Yani

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu çalışmada, Drosophila mitokondrial oksijen tüketimi ölçümleri önce numune hazırlama için bir yöntemi açıklanmıştır. Bu yöntem özellikle süresi ve gerekli bireylerin sayısı açısından mitokondriyal izolasyonların kullanarak iletişim kuralları ile ilgili farklı sorunların üstesinden gelmek için geliştirilmiştir. Mitokondrial izolasyonların genellikle çeşitli bireyler elde edilen dokular, büyük miktarda gerektiren çalışma yerine, bu deney kaç Drosophila thoraxes permeabilized kas lifleri gerçekleştirilir. Bu protokol için...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Bu çalışmada NP Ulusal Bilimler ve mühendislik Araştırma Konseyi (NSERC, keşif grant) ve Université de Moncton hibe tarafından finanse edildi. LHB Kanada Enstitüsü Sağlık Araştırma (CIHR), New Brunswick yenilik Vakfı (NBIF) ve Université de Moncton finansman desteğinden kabul etmek istiyorum. EHC çalışmalarını Université de Moncton ve Alzheimer Derneği Kanada, beyin Kanada, NSERC, Kanadalı göğüs kanseri Vakfı, New Brunswick yenilik Vakfı, New Brunswick sağlık Araştırmaları Vakfı tarafından desteklenmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Yüksek çözünürlüklü respirometre Oxygraph O2KOroboros Instruments, Innsbruck, Avusturya10022-02Startup O2K respirometre kiti
 
O2K-Titrasyon Seti Oroboros Instruments, Innsbruck, Avusturya20820-03Farklı hacimlerde Hamilton şırıngalar
 
Datlab yazılımıOroboros Instruments, Innsbruck, Avusturya20700Veri toplama ve analiz yazılımı
 
İnce uçlu antimanyetik forsepsVWR82027-400<br/>  
Secura225D-1S-DQESartorius AG, Göttingen, AlmanyaYarı mikro terazi (birkaç şirket tarafından dağıtılmaktadır) 
 
Drosophila melanogaster vahşi tip w1118Bloomington Drosophila stok Merkezi, IN, ABDbr/> Depolama Durumu: 24 &derece; C
Etilen glikol-bis (2-aminoetileter) - N< / em>, N< / em >, N< / em> & prime;, N< / em> ve asal;-tetraasetik asitSigma-AldrichE4378EGTA < br / > Depolama Durumu: RT
KOHSigma-AldrichP1767DİKKAT: metaller için aşındırıcı, akut toksisite, cilt aşınması, ciddi göz hasarı, akut su toksisitesi.
Depolama Durumu: RT
CaCO3Sigma-AldrichC4830
Depolama Durumu: RT
Na2ATPSigma-AldrichA2383
Depolama Durumu: -20 &derece; C
MgCl2< / sub>.6H2< / sub>OSigma-AldrichM9272
Depolama Durumu: RT
TaurinSigma-AldrichT0625
Depolama Durumu: RT
Na2< / sub>FosfokreatinSigma-AldrichP7936
Depolama Durumu: -20 derece; C
İmidazolSigma-AldrichI5513
Depolama Durumu: RT
DithiothreitolSigma-AldrichD0632
Depolama Koşulu: 2-8 derece; C
MES hidratSigma-AldrichM8250
Depolama Durumu:
Quillaja kabuğundan RT SaponinSigma-AldrichS7900Saponin
Depolama Durumu: RT
Çözelti Hazırlama: 1 mL koruma çözeltisinde 5 mg. Her gün taze olarak hazırlayın.
KClSigma-AldrichP9541
Depolama Durumu: RT
KH2PO4Sigma-AldrichP9791
Depolama Durumu: RT
HEPESSigma-AldrichH3375
Depolama Durumu: RT
BSASigma-Aldrich05470
Depolama Durumu: 2-8 derece; C
Na2S2O4Sigma-Aldrich157953Sodyum ditiyonit. DİKKAT: kendiliğinden ısınan maddeler ve karışımlar, akut toksisite, akut sucul tokssi kronik sucul toksisite.
Depolama Koşulu: RT
Sodyum piruvatSigma-AldrichP2256Pirüvat
Depolama Koşulu: 2-8 derece C
Çözelti Hazırlama: MilliQ suda. Her gün taze olarak hazırlayın.
L- (-) - Malik asitSigma-AldrichM1000Malat
Depolama Koşulu: RT < br / > Çözelti Hazırlama: MilliQ suda. KOH ile nötralize edin ve -20 ° C'de saklayın.
Adenozin 5'-difosfat monopotasyum tuzu hidratSigma-AldrichA5285ADP
Depolama Durumu: -20 &°; C
Çözelti Hazırlama: MilliQ suda. KOH ile nötralize edin ve -80 ° C'de saklayın.
At kalbinden sitokrom cSigma-AldrichC7752Sitokrom c
Depolama Durumu: -20 ° C; C
Çözelti Hazırlama: MilliQ suda. -20 ° C'de saklayın.
L-ProlineSigma-AldrichP0380Proline
Depolama Koşulu: RT
Çözelti Hazırlama: MilliQ suda. -20 ° C'de saklayın.
Sodyum süksinat dibazik hekzahidratSigma-AldrichS2378Süksinat
Depolama Durumu: RT
Çözelti Hazırlama: MilliQ suda. HCl ile nötralize edin ve -20 ° C'de saklayın.
sn-Gliserol 3-fosfat bis (sikloheksilamanyum) tuzuSigma-AldrichG7886Gliserol-3-fosfat
Depolama Durumu: -20 derece; C
Çözelti Hazırlama: MilliQ suda. HCl ile nötralize edin ve -80 ° C'de saklayın.
Karbonil siyanür 4- (triflorometoksi) fenilhidrazonSigma-AldrichC2920FCCP. DİKKAT: akut toksisite, cilt hassasiyeti, kronik sucul toksisite.
Depolama Koşulu: RT
Çözelti Hazırlama: Mutlak etanol içinde. -20 ° C'de cam şişelerde saklayın.
RotenoneSigma-AldrichR8875DİKKAT: akut toksisite, cilt tahrişi, göz tahrişi, spesifik hedef organ toksisitesi (solunum sistemi), akut su toksisitesi, kronik su toksisitesi.
Çözelti Hazırlanışı: Mutlak etanol içinde. -20 ° C'de koyu renkli şişelerde saklayın.
Malonik asitSigma-AldrichM1296Malonat. DİKKAT: akut toksisite, ciddi göz hasarı.
Depolama Durumu: RT
Çözelti Hazırlama: MilliQ suda. KOH ile nötralize edin. Her gün taze olarak hazırlayın.
Streptomyces sp'den antimisin A.Sigma-AldrichA8674Antimisin A. DİKKAT: akut toksisite, akut sucul toksisite, kronik sucul toksisite.
Depolama Koşulu: -20 &°; C
Çözelti Hazırlama: Mutlak etanol içinde. -20 ° C'de saklayın.
N,N,N′,N′-Tetrametil-p-fenilendiaminSigma-AldrichT7394TMPD
Depolama Durumu: RT
Çözelti Hazırlama: MilliQ suda. Koyu renkli şişelerde saklayın  -20 derece >C.
(+)- Sodyum L-askorbatSigma-AldrichA4034Askorbat
Depolama Durumu: RT
Çözelti Hazırlama: MilliQ suda. Koyu renkli şişelerde saklayın  -20 derece >C.
NaN < sub > 3 < / sub>Sigma-AldrichS2002Sodyum azid. DİKKAT: akut toksisite (oral ve dermal), spesifik hedef organ toksisitesi (beyin), sucul toksisite, kronik sucul toksisite.
Çözelti Hazırlama: MilliQ suda. -20 ° C'de saklayın.
<

Kaynaklar

  1. Stephenson, R., Metcalfe, N. H. Drosophila melanogaster: a fly through its history and current use. The journal of the Royal College of Physicians of Edinburgh. 43 (1), 70-75 (2013).
  2. Morgan, T. H. An attempt to analyze the constitution of the chromosomes on the basis of sex-limited inheritance in Drosophila. Journal of Experimental Zoology. 11 (4), 365-413 (1911).
  3. Dobzhansky, T., Wright, S. Genetics of Natural Populations. V. Relations between Mutation Rate and Accumulation of Lethals in Populations of Drosophila Pseudoobscura. Genetics. 26 (1), 23-51 (1941).
  4. Zipursky, S. L., Rubin, G. M. Determination of Neuronal Cell Fate: Lessons from the R7 Neuron of Drosophila. Annual Review of Neuroscience. 17 (1), 373-397 (1994).
  5. Costa, R., Speretta, E., Crowther, D. C., Cardoso, I. Testing the therapeutic potential of doxycycline in a Drosophila melanogaster model of Alzheimer disease. The Journal of biological chemistry. 286 (48), 41647-41655 (2011).
  6. Blandini, F., Armentero, M. T. Animal models of Parkinson's disease. FEBS Journal. 279 (7), 1156-1166 (2012).
  7. Baker, K. D., Thummel, C. S. Diabetic Larvae and Obese Flies-Emerging Studies of Metabolism in Drosophila. Cell Metabolism. 6 (4), 257-266 (2007).
  8. Morris, S. N. S., et al. Development of diet-induced insulin resistance in adult Drosophila melanogaster. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1822 (8), 1230-1237 (2012).
  9. Abou-Sleiman, P. M., Muqit, M. M. K., Wood, N. W. Expanding insights of mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease. Nature Reviews Neuroscience. 7 (3), 207-219 (2006).
  10. McGurk, L., Berson, A., Bonini, N. M. Drosophila as an in vivo model for human neurodegenerative disease. Genetics. 201 (2), 377-402 (2015).
  11. Lin, M. T., Beal, M. F. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in neurodegenerative diseases. Nature. 443 (7113), 787-795 (2006).
  12. Carri, M. T., Valle, C., Bozzo, F., Cozzolino, M. Oxidative stress and mitochondrial damage: importance in non-SOD1 ALS. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 1-6 (2015).
  13. Balaban, R. S., Nemoto, S., Finkel, T. Mitochondria, oxidants, and aging. Cell. 120 (4), 483-495 (2005).
  14. Szibor, M., Holtz, J. Mitochondrial ageing. Basic Research in Cardiology. 98 (4), 210-218 (2003).
  15. Palikaras, K., Lionaki, E., Tavernarakis, N. Coordination of mitophagy and mitochondrial biogenesis during ageing in C. elegans. Nature. 521 (7553), 525-528 (2015).
  16. López-Lluch, G., Irusta, P. M., Navas, P., de Cabo, R. Mitochondrial biogenesis and healthy aging. Experimental Gerontology. 43 (9), 813-819 (2008).
  17. Muoio, D. M. Metabolic inflexibility: When mitochondrial indecision leads to metabolic gridlock. Cell. 159 (6), 1253-1262 (2014).
  18. Efeyan, A., Comb, W. C., Sabatini, D. M. Nutrient-sensing mechanisms and pathways. Nature. 517 (7534), 302-310 (2015).
  19. Brown, G. C. Control of respiration and ATP synthesis in mammalian mitochondria and cells. The Biochemical journal. 284 (1), 1-13 (1992).
  20. McDonald, A. E., Pichaud, N., Darveau, C. A. "Alternative" fuels contributing to mitochondrial electron transport: Importance of non-classical pathways in the diversity of animal metabolism. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology. , (2017).
  21. Soares, J. B. R. C., Gaviraghi, A., Oliveira, M. F., Veuthey, J., Zamboni, N., Westermann, B. Mitochondrial Physiology in the Major Arbovirus Vector Aedes aegypti: Substrate Preferences and Sexual Differences Define Respiratory Capacity and Superoxide Production. PLOS ONE. 10 (3), e0120600(2015).
  22. Newell, C., Kane, C. L., Kane, D. A. Mitochondrial substrate specificity in beetle flight muscle: assessing respiratory oxygen flux in small samples from Dermestes maculatus and Tenebrio molitor. Physiological Entomology. 41 (2), 96-102 (2016).
  23. Teulier, L., Weber, J. M., Crevier, J., Darveau, C. A. Proline as a fuel for insect flight: enhancing carbohydrate oxidation in hymenopterans. Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 283 (1834), 20160333(2016).
  24. Ferguson, M., Mockett, R. J., Shen, Y., Orr, W. C., Sohal, R. S. Age-associated decline in mitochondrial respiration and electron transport in Drosophila melanogaster. The Biochemical journal. 390 (2), 501-511 (2005).
  25. Miwa, S., Brand, M. D. The topology of superoxide production by complex III and glycerol 3-phosphate dehydrogenase in Drosophila mitochondria. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1709 (3), 214-219 (2005).
  26. Katewa, S. D., Ballard, J. W. O. Sympatric Drosophila simulans flies with distinct mtDNA show difference in mitochondrial respiration and electron transport. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 37 (3), 213-222 (2007).
  27. Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).
  28. St-Pierre, J., Buckingham, J. A., Roebuck, S. J., Brand, M. D. Topology of superoxide production from different sites in the mitochondrial electron transport chain. Journal of Biological Chemistry. 277 (47), 44784-44790 (2002).
  29. Kuznetsov, A. V., Veksler, V., Gellerich, F. N., Saks, V., Margreiter, R., Kunz, W. S. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nature Protocols. 3 (6), 965-976 (2008).
  30. Gnaiger, E. Capacity of oxidative phosphorylation in human skeletal muscle. New perspectives of mitochondrial physiology. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 41 (10), 1837-1845 (2009).
  31. Picard, M., Taivassalo, T., Gouspillou, G., Hepple, R. T. Mitochondria: isolation, structure and function. The Journal of Physiology. 589 (18), 4413-4421 (2011).
  32. Pichaud, N., Ballard, J. W. O., Tanguay, R. M., Blier, P. U. Thermal sensitivity of mitochondrial functions in permeabilized muscle fibers from two populations of Drosophila simulans with divergent mitotypes. American Journal of Physiology - Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 301 (1), R48-R59 (2011).
  33. Pichaud, N., Ballard, J. W. O., Tanguay, R. M., Blier, P. U. Naturally occurring mitochondrial dna haplotypes exhibit metabolic differences: insight into functional properties of mitochondria. Evolution. 66 (10), 3189-3197 (2012).
  34. Pichaud, N., Messmer, M., Correa, C. C., Ballard, J. W. O. Diet influences the intake target and mitochondrial functions of Drosophila melanogaster males. Mitochondrion. 13 (6), 817-822 (2013).
  35. Wolff, J. N., Pichaud, N., Camus, M. F., Côté, G., Blier, P. U., Dowling, D. K. Evolutionary implications of mitochondrial genetic variation: mitochondrial genetic effects on OXPHOS respiration and mitochondrial quantity change with age and sex in fruit flies. Journal of Evolutionary Biology. 29 (4), 736-747 (2016).
  36. Gnaiger, E. Capacity of oxidative phosphorylation in human skeletal muscle. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 41 (10), 1837-1845 (2009).
  37. Phang, J. M., Donald, S. P., Pandhare, J., Liu, Y. The metabolism of proline, a stress substrate, modulates carcinogenic pathways. Amino Acids. 35 (4), 681-690 (2008).
  38. Bender, T., Martinou, J. C. The mitochondrial pyruvate carrier in health and disease: To carry or not to carry? Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1863 (10), 2436-2442 (2016).
  39. Divakaruni, A. S., et al. Thiazolidinediones are acute, specific inhibitors of the mitochondrial pyruvate carrier. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 5422-5427 (2013).
  40. McCommis, K., et al. An ancestral role for the mitochondrial pyruvate carrier in glucose-stimulated insulin secretion. Molecular Metabolism. 5 (8), 602-614 (2016).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Drosophila MelanogasterToraks DiseksiyonuSaponin PermeabilizasyonuY ksek z n rl kl RespirometriElektron Ta ma SistemiSubstrat OksidasyonuAyr t r c Yan tnhibit r AnaliziMitokondriyal Solunum
Doku çok az miktarda kullanarak Drosophila Permeabilized liflerinin mitokondrial oksijen harcama ölçme noktalar
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.