Method Article

Çoğaltılmış yapay hücresel MicroEnvironment dizi imalatı

DOI:

10.3791/57377

⸱

September 7th, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute for Integrated Cell-Material Sciences (WPI-iCeMS), Kyoto University, 2Department of Life Science and Technology, School of Life Science and Technology, Tokyo Institute of Technology, 3Biomaterials Center for Regenerative Medical Engineering, Foundation for Advancement of International Science, 4Faculty of Science and Natural Resources, Universiti Malaysia Sabah, 5Institute for Chemical Research, Kyoto University, 6Ecole Normale Supérieure

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu makalede, bir Multiplexed yapay hücresel MicroEnvironment (MACME) dizi taklit eden vivo içinde hücresel microenvironments fiziksel ve kimyasal yüksek üretilen iş manipülasyonu ipuçları ve için hazırlamak için ayrıntılı metodolojisi insan pluripotent kök hücreler (hPSCs) için en iyi hücresel ortam tek hücreli profil oluşturma ile tanımlayın.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücresel microenvironments büyüme faktörleri, hücre dışı matrisler ve hücreler arası etkileşimleri gibi yardımlar çeşitli oluşur. Bu cues de orkestra ve canlı bir sistem içinde hücre fonksiyonları düzenlenmesinde önemlidir. Her ne kadar bir dizi araştırmacılar çevresel faktörler ve istenen hücresel işlevler arasındaki ilişkiyi araştırmak için çalıştılar, pek bilinmeyen kalır. Bu büyük ölçüde bu tür çevre ipuçları vitrotaklit ve aynı anda farklı çevresel yardımlar hücreleri üzerinde test için uygun bir metodoloji eksikliği kaynaklanmaktadır. Burada, entegre bir platform mikrosıvısal kanalları ve yüksek-içerik tek hücre analizi, kök hücre fenotipleri farklı çevresel faktörler tarafından değiştirilmiş incelemek için ardından bir nanofiber dizi raporu. Bu platform uygulama göstermek için bu çalışma insan pluripotent kök hücreler (hPSCs) kendini sürekli yenileyen fenotipleri üzerinde duruluyor. Burada, bir Multiplexed yapay hücresel MicroEnvironment (MACME) dizi imalatı nanofiber dizi veya mikrosıvısal yapısı için hazırlık yordamlarını mevcut. Ayrıca, profil oluşturma, hücre birden çok floresan işaretleri, birden çok floresan görüntü ve istatistiksel analizler, boyama tek hücrenin genel adımlar açıklanmaktadır.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan pluripotent kök hücreler (hPSCs)1,2 unlimitedly kendi kendini yenilemek ve ilaç geliştirme, hücre tabanlı terapiler, doku mühendisliği ve rejeneratif tıp devrim olabilir çeşitli doku soy, ayırt etmek 3 , 4 , 5 , 6. genel kültür yemekleri ve microtiter levha, ancak, tasarlanmamıştır hücresel genişleme için kritik bir faktör olduğunu, kesin fiziksel ve kimyasal hücre manipülasyon ile sıra nano - için mikro-metre, hücresel düzeyde etkinleştirmek için kendini yenileme ve farklılaşm....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. MACME dizi imalatı

Not: Tüm malzeme ve ekipmanları malzemeleri tabloda listelenir.

  1. Nanofiber dizi ve bir kalıp bir mikrosıvısal yapısı için maskeler hazırlanması
    1. Üç boyutlu (3D) görüntüler nanofiber diziler ve 3D-Bilgisayar grafikleri yazılım paketleri (Tablo 1) kullanarak mikrosıvısal yapılar için kalıplar için kullanılan maskeler oluşturmak.
      Not: 3D görüntü okumak ve bir 3D basımevinde. Yazdırılan maskeleri ve kalıp 1.1.1 bir adımda grafik yazılımı kullanılarak tanımlanmış 3D görüntülerle aynı boyutlara sahip.
    2. Maskeleri ve bir 3D printerlere harcama m....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MACME diziler: tasarım ve üretim: Nanofiber teknolojisi ile birlikte, biz mikrosıvısal hücre kültürü ve önce hPSC öz-yenileme veya farklılaşma35,36 (Şekil 1) için en iyi koşulları tanımlamak için istihdam teknikleri eleme kullanılır. Bu hücre kültür odalar ve koşulları tam olarak kontrol edilebilir ve Genişletilebilir42,43

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu iletişim kuralı nitelikli hPSCs bakım için sağlam kültür sistem kurmak için ilk tarama yöntemi gösterir. İlk olarak, nasıl farklı yapay ECMs ve hücre yoğunluğu ile a nanofiber düzenlemek, MACME dizi entegre bir mikrosıvısal aygıtını kullanarak tohum bir platform hazırlamak için nitelendirdi. İkinci, nicel yansıma tabanlı tek hücreli fenotipleme bireysel hücresel sonuçları ve farklı biyokimyasal ve biyofiziksel özellikleri tarafından değiştirilmiş davranışları değerlendirmek için gerçekleştirilen50

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz Prof. N. Nakatsuji iCeMS, Kyoto Üniversitesi, insan ES hücreleri verdiğiniz için teşekkür ederiz. Ayrıca Tokyo Teknoloji Enstitüsü'nde atomik kuvvet mikroskobu kullanımında verdiği destek için Prof. A. Maruyama teşekkür. Finansman cömertçe sağlanan Japonya Derneği tarafından bilim promosyon için (JSP'ler; 22350104, 23681028, 25886006 ve 24656502); fon ayrıca yeni enerji ve Endüstriyel teknoloji geliştirme organizasyonu (Ned-o) ve Terumo Life Science Foundation tarafından sağlandı. TEFE-iCeMS dünyanın önde gelen uluslararası araştırma merkezi girişimi (TEFE), Milli Eğitim Bakanlığı, kültür, spor, bilim ve teknoloji (MEXT), Japonya tarafından desteklenir. Bu çalışma....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Polistiren (PS)Sigma#182435Ortalama Mw: 290.000, ortalama Mn: 130.000
Polimetilglutarimid (PMGI)MicroChemG113113
Jelatin (GT)SigmaG2625Domuz derisinden, A tipi
Sylgard 184 silikon elastomer kitiDoe Corning Toray#1064291PDMS kürleme maddesi ve silikon elastomer taban bu kitin bileşenleridir.
OpenSCADBu, mikroakışkan cihazın kalıbını tasarlamak için kullanılan ücretsiz bir 3B bilgisayar grafik yazılımıdır (http://www.openscad.org/).
AutoCAD 2014AutodeskBu, nanofiber dizi hazırlamada kullanılan maskenin tasarımı için kullanılan bir 3B bilgisayar grafik yazılımıdır (https://www.autodesk.com/products/autocad/overview).
3D yazıcı, AGILISTA-3000Keyence
UV ile kürlenebilen reçine, AR-M2KeyenceBu, Agilista tarafından 3D baskı için kullanılır.
Asetik asitSigma# 338826≥ % 99,99
Etil asetatSigma# 270989Susuz,% 99,8
Tetrahidrofuran (THF)Sigma# 401757
MSP-30TVakum CihazıMagnetron püskürtme makinesi
Nunc OmniTrayThermo Fisher Scientific# 242811Bu, nanofiber dizisinin oluşturulduğu bir polistiren taban plakasıdır. Bu plaka boyutu tipik olarak 127,7 x 85,5 mm'dir.
Tabanca tipi korona deşarj makinesiShinko Electric & EnstrümantasyonCFG-500Bu kullanışlı cihaz, protokoldeki 1.5 "MACME dizilerinin montajı" adımında PDMS katmanının alt yüzeyinin aktivasyonu için korona oluşturmak için kullanılır.
5 mL şırıngaTerumoSS-05SZ
Paslanmaz çelik künt iğne (23 gauge)Nipro# 2166Dış çap ve uzunluk sırasıyla 0,6 ve 32 mm'dir.
Yüksek voltajlı güç kaynağıTechDempaz
1-Etil-3- (3-dimetilaminopropil) karbodiimid, hidroklorürDojindoW001
N-HidroksisüksinimidSigma# 56480
Matrigel hESC Nitelikli MatrisCorning# 354277Bu protein protokolde bazal membran jel matrisi olarak adlandırılır.
CellStick Vitronektin, İnsan, ÇözümKÖK HÜCRE Teknolojileri# 07004
TeSR-E8KÖK HÜCRE Teknolojileri# 05940İnsan ES ve iPS hücrelerinin bakımı için besleyici içermeyen, kseno içermeyen kültür ortamı
Y-27632Wako Saf Kimya Endüstrileri# 253-00513
TrypLE Express Enzim (1X), fenol kırmızısıThermo Fisher Scientific# 12605028Bu, yapışık memeli hücrelerinin ayrışması için rekombinant tripsin benzeri bir proteazdır.
Alexa Fluor 647 ile Click-iT EdU Görüntüleme Kiti AzidesThermo Fisher ScientificC10086Plaka üzerinde floresan boyamada çoğalan hücrelerin floresan etiketlemesi, bu kitin ürün kılavuzu boyunca gerçekleştirilmiştir.
Annexin V, Alexa Fluor 594 eşlenikThermo Fisher ScientificA13203
4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)Thermo Fisher ScientificD1306
Oct-3/4 Antikor (C-10)Santa Cruz Biyoteknolojisc-5279
Eşek Anti-Fare IgG H & L (DyLight 488)abcamab96875Bu, plaka üstü floresan hücre boyamada kullanılan ikincil bir antikordur.
ECLIPSE Ti-ENikonBu, CFI Plan Fluor 4×/0.13 NA objektif lens (Nikon), CCD kamera (ORCA-R2, Hamamatsu), cıva lambası (Intensilight, Nikon), XYZ otomatik tabla (enkoderli Ti-S-ER motorlu tabla, Nikon) ve dört floresan kanalı (DAPI, GFP HYQ, TRITC, Cy5; Nikon)
NIS-Elements Advanced ResearchNikonBu, otomatik görüntü elde etmek için kullanılan bir mikroskop görüntüleme yazılımıdır.
CellProfiler, Sürüm 2.1.0Bu, hücre görüntü analizi (http://cellprofiler.org/) için ücretsiz bir açık yazılımdır.
RSOM analizi bu yazılımın kohonen paketi ile gerçekleştirilir. Bu ücretsiz olarak kullanılabilir (https://www.r-project.org/).
Küme 3.0Bu, açık kaynaklı kümeleme yazılımıdır (http://bonsai.hgc.jp/~mdehoon/software/cluster/software.htm). Bu yazılım ile denetimsiz hiyerarşik kümeleme gerçekleştirilir.
Java TreeViewBu açık kaynaklı yazılım (http://jtreeview.sourceforge.net/), kümeleme verilerini bir ısı haritası ve bir dendrogram olarak görselleştirmek için kullanılır.
H9 insan embriyonik kök hücreWiCell Kök Hücre BankasıWA09

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  2. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  3. Ameen, C., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment ArrayNanofiber Array FabricationMicrofluidic Structure AssemblyElectrospinning ProcessStem Cell PhenotypingSingle Cell ProfilingFluorescence ImagingSOM AnalysishPSC Self RenewalPDMS Molding

Related Articles