Method Article

Çoğaltılmış yapay hücresel MicroEnvironment dizi imalatı

DOI:

10.3791/57377

⸱

September 7th, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute for Integrated Cell-Material Sciences (WPI-iCeMS), Kyoto University, 2Department of Life Science and Technology, School of Life Science and Technology, Tokyo Institute of Technology, 3Biomaterials Center for Regenerative Medical Engineering, Foundation for Advancement of International Science, 4Faculty of Science and Natural Resources, Universiti Malaysia Sabah, 5Institute for Chemical Research, Kyoto University, 6Ecole Normale Supérieure

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu makalede, bir Multiplexed yapay hücresel MicroEnvironment (MACME) dizi taklit eden vivo içinde hücresel microenvironments fiziksel ve kimyasal yüksek üretilen iş manipülasyonu ipuçları ve için hazırlamak için ayrıntılı metodolojisi insan pluripotent kök hücreler (hPSCs) için en iyi hücresel ortam tek hücreli profil oluşturma ile tanımlayın.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücresel microenvironments büyüme faktörleri, hücre dışı matrisler ve hücreler arası etkileşimleri gibi yardımlar çeşitli oluşur. Bu cues de orkestra ve canlı bir sistem içinde hücre fonksiyonları düzenlenmesinde önemlidir. Her ne kadar bir dizi araştırmacılar çevresel faktörler ve istenen hücresel işlevler arasındaki ilişkiyi araştırmak için çalıştılar, pek bilinmeyen kalır. Bu büyük ölçüde bu tür çevre ipuçları vitrotaklit ve aynı anda farklı çevresel yardımlar hücreleri üzerinde test için uygun bir metodoloji eksikliği kaynaklanmaktadır. Burada, entegre bir platform mikrosıvısal kanalları ve yüksek-içerik tek hücre analizi, kök hücre fenotipleri farklı çevresel faktörler tarafından değiştirilmiş incelemek için ardından bir nanofiber dizi raporu. Bu platform uygulama göstermek için bu çalışma insan pluripotent kök hücreler (hPSCs) kendini sürekli yenileyen fenotipleri üzerinde duruluyor. Burada, bir Multiplexed yapay hücresel MicroEnvironment (MACME) dizi imalatı nanofiber dizi veya mikrosıvısal yapısı için hazırlık yordamlarını mevcut. Ayrıca, profil oluşturma, hücre birden çok floresan işaretleri, birden çok floresan görüntü ve istatistiksel analizler, boyama tek hücrenin genel adımlar açıklanmaktadır.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan pluripotent kök hücreler (hPSCs)1,2 unlimitedly kendi kendini yenilemek ve ilaç geliştirme, hücre tabanlı terapiler, doku mühendisliği ve rejeneratif tıp devrim olabilir çeşitli doku soy, ayırt etmek 3 , 4 , 5 , 6. genel kültür yemekleri ve microtiter levha, ancak, tasarlanmamıştır hücresel genişleme için kritik bir faktör olduğunu, kesin fiziksel ve kimyasal hücre manipülasyon ile sıra nano - için mikro-metre, hücresel düzeyde etkinleştirmek için kendini yenileme ve farklılaşma. Bu dezavantajı yönelik olarak çalışmalar hücre-kader karar ve hücre fonksiyonları4düzenlenmesinde hücresel microenvironments rolleri araştırdı. Son yıllarda, hücresel microenvironments vitro7,8yeniden oluşturmak için giderek artan sayıda çalışmalar yapılmıştır. Nano ve mikro imalat işlemleri bu microenvironments kimyasal9,10,11,12,13manipülasyonu yoluyla kurduk, 14,15,16,17 ve fiziksel18,19,20 çevre ipuçları. Şimdiye kadar sistematik olarak kimyasal ve fiziksel çevre yardımlar hücre-kader karar ve fonksiyonları içinde tek bir platform üzerinde temel mekanizmaları araştırmak için hiçbir raporlar vardı.

Burada, bir güçlü tarama platform (Şekil 1) kurmak için basit tasarım ilkelerine dayanan bir strateji tanıtmak. İlk olarak, çok yönlü, yapay hücresel microenvironments nanofiber dizi ve bir mikrosıvısal yapısı kullanarak oluşturmak için entegre bir platform geliştirme prosedürü açıklamak: Multiplexed yapay hücresel MicroEnvironment (MACME) dizi (Şekil 1A ve 2A). Nanofiber dizi nanofiber malzeme ve yoğunlukları farklı kombinasyonlarda 12 farklı microenvironments var. Electrospinning nanofibers imal etmek kullanıldı. Nanofiber malzemeleri, polistiren (PS)21, polymethylglutarimide (PMGI)22ve jelatin (GT)23, gibi hücre adezyon ve pluripotency ( bakımından etkileyebilecek kimyasal özelliklerini test etmek için tasarlanmıştır Şekil 2B). Nanofiber yoğunlukları çeşitli electrospinning zaman değiştirerek ve oluşturulan nanofibers onların yoğunlukları göre tanımlanmış (DNF, d = XLow/düşük/orta/yüksek). Mikrosıvısal yapısı 96-şey Mikroplaka standart boyut üzerinde konumlandırılmış olabilir 48 hücre kültürü chambers, yataklık polydimethylsiloxane (PDMS) oluşur. PDMS mikrosıvısal cihazlar24imal etmek genellikle kullanılan biyouyumlu ve gaz değiştirilebilen bir polimerdir. Her mikrosıvısal kanal 700-µm olarak tasarlanmıştır geniş ve 8.4 mm uzun ve kenarlarından (Tablo 1), iki giriş vardı. Odalar farklı yükseklikte vardı (250, 500 ve 1000 µm) hangi hayatta kalma, yayılması ve hPSCs25 farklılaşma ile ilişkilendirmek ilk hücre tohum yoğunlukları (0,3 0,6 ve 1,2 × 105 hücreleri/cm2), işlemek (Şekil 2C). Bir odaya seribaşı hücre sayısı sütun yoğunluğu odası kat yukarıda orantılıdır ve böylece ilk hücre yoğunluğu tohum kültür chambers ile farklı yükseklikte içine aynı hücre süspansiyon tanıtımı tarafından kontrol ediliyordu. Tüm kanallar ≥ 250-µm-yüksek26 hücreleri düşük oksijen gerginlik27 ve yamultma stres28 etkilerini en aza indirmek için tasarlanmıştır. 250, 500 ve 1000 µm kanal yüksekten burada kısaltılmış olarak XCD x = düşük, orta ve yüksek, anılan sıraya göre. Farklı nanofiber yoğunlukları ve ilk hücre tohum yoğunlukları ortamlarıyla "Material_NF density_Cell yoğunluğu" kısaltılmış (örneğin, GT_HighNF_HighCD: yüksek yoğunluklu GT nanofibers ve yüksek ilk hücre tohum ile karakterize bir ortam yoğunluk).

Daha sonra sistematik olarak hücre davranış çevresel faktörler (Şekil 1B) yanıt olarak araştırmak için tek hücreli çözümlemesi yapma nasıl açıklar. Bir kanıtı-of-concept olarak, biz en iyi hücresel ortam hPSC öz-yenileme, hangi hPSC bakım (Şekil 1B)29tuşu fonksiyonu tanımlanır. İstatistiksel analizler tarafından takip, yansıma tabanlı sitometresi bireysel hücresel fenotipik yanıt-e doğru hücresel ortamlar nicel yorumu sağlar. Çeşitli hücresel işlevler arasında bu kağıt hPSC öz-yenileme korumak için en uygun koşulları tanımlamak için detaylı bir yordam içermektedir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. MACME dizi imalatı

Not: Tüm malzeme ve ekipmanları malzemeleri tabloda listelenir.

  1. Nanofiber dizi ve bir kalıp bir mikrosıvısal yapısı için maskeler hazırlanması
    1. Üç boyutlu (3D) görüntüler nanofiber diziler ve 3D-Bilgisayar grafikleri yazılım paketleri (Tablo 1) kullanarak mikrosıvısal yapılar için kalıplar için kullanılan maskeler oluşturmak.
      Not: 3D görüntü okumak ve bir 3D basımevinde. Yazdırılan maskeleri ve kalıp 1.1.1 bir adımda grafik yazılımı kullanılarak tanımlanmış 3D görüntülerle aynı boyutlara sahip.
    2. Maskeleri ve bir 3D printerlere harcama maddeler kullanarak bu tasarımları dayalı bir kalıp yazdırın.
      Not: Bu protokol için bir mürekkep jet gibi 3D printerlere harcama maddeler UV tedavi edilebilir reçine ile kullanılan30' du. Yazıcı çözünürlüğü 635 × 400 dpi ve x, 15 µm oldu Y ve Z, sırasıyla, ancak, gerçek X, Y çözünürlüğü yaklaşık dört kat daha düşük.
  2. Nanofiber-dizi hazırlık (Şekil 3A)
    1. Polimer çözümleri electrospinning için hazır olun.
      1. Tetrahydrofuran ile % 13 PMGI sıvı ile %9 (w/v)22oranında seyreltin.
      2. PS 0,08 gram dissolve (sayı ortalama molekül ağırlığı (Mn): 130.000) THF:dimethylformamide (1:1 hacim oranı)21ve birimin Son 1 mL (% 8 (w/v) PS çözüm) kadar getirmek için THF:dimethylformamide ekleyin.
      3. 0.1 g gt suda çözülür: asetik asit: etil asetat (1:1.6:2.1 hacim oranı) ve eklemek su: asetik asit: Etil Asetat olarak birimin Son 1 mL (% 10 (w/v) GT çözüm) kadar getirmek için açıklanan23,31.
    2. Makine SAÇTIRMA magnetron kullanın, electrospinning Kur içinde bir katot olarak hizmet veren bir Polistiren (PS) baseplate (127.7 × 85.5 mm), üzerinde 5-nm kalınlığında ince bir platin tabaka Kasası.
    3. 23-G paslanmaz çelik künt iğne ile donatılmış bir 5 mL şırınga içine her Polimer çözüm yükleyin.
    4. Yer ve çapa 12-cm toplayıcı electrospinning cihazın dışında bir şırınga pompa iğne şırınga.
    5. Şırınga iğne yüksek voltajlı güç kaynağına bağlayın ve 11'e uygulamak için ayarla kV.
    6. 0.2 mL/h pompalama hızını ayarlayın.
    7. Sıcaklık ve nem 30 ° C ve < %30 (v/v) tutmak.
    8. 1.2.2 adımda hazırlanan baseplate maskeyi tak.
    9. Electrospinning zaman değiştirerek farklı yoğunlukları ile maske deliklerden baseplate üzerinde nanofibers imal (örneğin, 20, 60, 90 ve 180 s).
    10. Maskeyi baseplate kaldırın.
      Not. Etanol electrospun GT nanofibers GT nanofibers maskesi ile birlikte kapalı soyulması önlemek için maskeyi çıkarmadan önce püskürtülür.
    11. Adım 1.2.4-1.2.10 nanofiber-dizi imalat tamamlanması kadar yineleyin.
    12. Nanofiber dizi 16 h için 25 ° C'de bir desiccator içinde kalan solvent buharlaşır için yerleştirin.
    13. 0.2 M 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hidroklorid (EDC) ve 0.2 M N-hydroxysuccinimide (NHS) 4 h2325 ° C'de etanol içinde Crosslink GT nanofibers.
    14. 16 h için 25 ° C'de GT nanofibers iki kez %99,5 (v/v) etanol ve vakum-kuru ile yıkayın.
  3. İmalat mikrosıvısal yapıları (Şekil 3B)
    1. Ajan ve PDMS Bankası 20 g kür PDMS 2 g mix (1:10 ağırlık oranı; Pre-PDMS). 24
    2. 1.2. adımda fabrikasyon kalıp üzerine pre-PDMS karışımı dökün.
    3. Bir desiccator 30 dk için pre-PDMS karışımı de-gaz.
    4. Pre-PDMS karışımı için 16 h 65 ° c fırında tedavi.
  4. MACME derleme diziler (Şekil 3B)
    1. Adımda 1.3.4 kalıp ve temiz %70 (v/v) etanol ile tedavi PDMS yapısı akasındaki.
    2. Atmosferik corona deşarj PDMS yapısı32alt tarafında tedavi.
      Not: Bu protokol için corona bir katman 3 veya 4 kez bir "Kullanışlı" corona deşarj aparatı ile tüm yüzeyi serbesttir. Oksijen Plazma tedavi atmosferik corona deşarj ile yüzey adhesiveness değiştirmek için değiştirildi.
    3. Nanofiber dizi PDMS yapısıyla hızlı bir şekilde bir araya getirin.
    4. Fırın-65 ° C de 2 gün boyunca pişir.

2. yükleme hESCs MACME diziye

  1. Xeno-Alerjik hücrelerde kimyasal olarak kültür orta (hPSC orta olarak adlandırılır) 10 µM Y-27632 ROCK inhibitörü34 35-mm hücre kültürü ile takıma hPSC bakım33 için tanımlanan H9 insan embriyonik kök hücreleri (hESCs) rutin kültür için korumak çanak membran jel matris (MG) ile kaplı.
  2. Geçiş hücreleri her 4-7 gün rekombinant tripsin benzeri proteaz kullanarak.
  3. MACME dizi ile % 99.5 etanol, salonları 10 min için yükleme tarafından sterilize ve etanol kaldırın. Bu işlemi 3 kez tekrarlayın.
  4. Mg, 10 µg/mL vitronectin (VN), 12 µL tanıtmak ve %0,1 (w/v) GT denetimine chambers kültür ve odaları odası yüzeylerde kat 1 h için 37 ° C'de kuluçkaya.
    Not: Bu protokol için MG, VN ve GT başvuru proteinler hücre adezyon ve kültür olarak seçildi. Çünkü MG ve VN hPSC öz-yenileme korumak için kullanılan standart hücre kültürü matrisler olumlu denetim kullanılır; iki boyutlu GT kaplama (2DGT) ya da non-kaplama (NC) negatif denetimler olarak kullanılmıştır.
  5. Önceden ısıtılmış hPSC orta MACME dizi tüm odaları tanıtmak. Salonları 37 ° C'de 30 dk için kuluçkaya
  6. Yıkama H9 hESC ile DPBS, 35 mm çanak üzerinde kültürlü rekombinant tripsin benzeri proteaz 0.5 mL yemek için ekleyin ve 1 dk. için 37 ° C'de kuluçkaya ve dikkatli bir şekilde sadece proteaz ile karışık supernatants Aspire edin.
    Not: Aspirasyon aşamada hücreleri müstakil değil.
  7. Yavaşça tekrar tekrar hücreleri ayırmak ve müstakil hücreleri 15 mL konik tüp aktarmak için çanak yüzeye karşı orta dağıtmak, hemen hPSC orta ekleyin.
  8. 3 dk. aspiratı süpernatant 200 x g, santrifüj kapasitesi ve önceden ısıtılmış hPSC orta hücrelerde askıya alma.
  9. Hücre süspansiyon (1,2 × 106 hücre/mL) 12 µL her mikrosıvısal odasına tanıtmak.
    Not: Hücreleri bir odasına başka bir micropipette kullanarak tanıtmak. Odama seribaşı hücre sayısı odası kat yukarıda sütun yoğunluğu ile orantılı olduğundan, düz-se bile aynı hücre süspansiyon örnekleri kullanılmıştır ilk hücre tohum yoğunluğu denetlenebilecek. Pipetting nazikçe yapılır emin olun. Aşırı orta odalarından bir pamuk uçlu sopa yükledikten sonra kullanarak kaldırın. MACME dizi sık kullanılan laboratuvar Pipetler ve otomatik pipet sistemleri ile uyumludur ve herhangi bir özel ekipman gerektirmez.
  10. HPSC orta her 12 h ve kültür için 4 gün değiştirin.
    Not: Orta sabit birimler (1.6, 3.2 ve 6.4 µL) odaları farklı boyutlarda kullanılarak sürdürülür. Kültür hücreleri kesme hücre kültürü orta35,36alışverişi dışında stres en aza indirmek için statik bir koşul altında.

3. nicel tek hücreli profil oluşturma

  1. Plaka üzerinde floresan hücre boyama
    Not:     hPSCs kendini sürekli yenileyen, fenotipik değişiklikler çözümlemek için bu iletişim kuralı için üç anahtar fenotipik işaretleri bu iletişim kuralı seçili: OCT4, 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) ve Annexin V pluripotency, yayılmasını önleme ve Apoptozis durumunu ölçmek için , sırasıyla (Şekil 2b). 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) hücre çekirdeği tanımlamak için kullanılır. Pluripotent kritik transkripsiyon faktörlerin OCT4 biridir.
    1. H9 hESCs 30 dk 37 ° C'de 10 µM EdU alkin ile takıma hPSC orta MACME dizilerde kuluçkaya.
    2. Annexin-bağlama arabellek (10 mM HEPES (pH 7,4), 140 mM NaCl, 2.5 mM CaCl2) ile yıkadıktan sonra bir turuncu-floresan boya Annexin V eşlenik 15dk için 20 ° C'de hücrelerle leke.
    3. PBS hücrelerde 15dk için 20 ° C'de % 4 (v/v) paraformaldehyde ile düzeltmek ve PBS hücrelerle iki kez yıkayın.
    4. PBS ile % 0.3 (v/v) Triton X-100 16 h için 20 ° C'de kullanarak hücreleri permeabilize.
      Not: Paraformaldehyde plastik taban plakası ve PDMS mikrosıvısal yapısı arasındaki bağı zayıflar. Böylece, dekolmanı adımda 3.2.1 diziden PDMS tabakasının da bu adımdan sonra gerçekleştirilir.
    5. Kırmızı-floresan boya azid 30 dk 20 ° C'de önbellekle Tris tabanlı reaksiyon hücrelerde kuluçkaya.
    6. Engelleme arabellek (PBS ile %5 (v/v) normal keçi serum, %5 (v/v) normal eşek serum, %3 (w/v) Sığır serum albümin, % 0,1 (v/v) ara-20 ve %0.1 (w/v) N-Lauryl-β-D-maltoside) 16 h için 4 ° C'de hücrelerde kuluçkaya.
    7. %0,5 (v/v) Triton X-100 çözüm ile PBS ve insan OCT3/4 antikor (fare IgG) 16 h için 4 ° C'de kuluçkaya.
    8. Fareyle yeşil-floresan boya etiketli eşek Anti-IgG (H + L) 60 dk 37° C'de engelleme arabellekte kuluçkaya.
    9. PBS DAPI ile içinde 30 dk 20 ° C'de kuluçkaya.
    10. PBS-DAPI PBS ile değiştirin.
    11. 4 ° C'de MACME dizi resim alma kadar korumak.
  2. Görüntü edinme (Şekil 4)
    1. MACME dizi PDMS mikrosıvısal yapısından akasındaki.
    2. Kalan PBS MACME diziden çıkarın, PBS 90%(v/v) gliserol hücrelere uygulayın ve coverslips lekeli hücrenin üzerine yerleştirin.
    3. Plaka baş aşağı bir ters floresans mikroskobu sahnede ayarlayın.
    4. 12-bit renkli görüntüler düşsel bilgisayar yazılımı mikroskop tarafından kontrol (sahne, filtreler, çekim hızı ve odak sistemleri) tüm motorlu bileşenleri kullanılarak otomatik olarak elde.
      Not. Bu protokol için maksimum yoğunluk değerleri ulaşmak için pozlama süreleri ayarlanır (en yüksek piksel yoğunluğu: 4096), ama yok doygunluk, her görüntü, DAPI, OCT4, Annexin V ve EdU.
  3. Bilgisayar destekli görüntü işleme ve floresan sinyal miktar (Şekil 5)
    Not:     aşağıdaki hücre görüntü analizi dayalı bir yukarıda açıklanan Yöntem37olarak gerçekleştirilir.
    1. Renkli görüntüler gri tonlamaya dönüştürme.
    2. Otsu yöntemi ile her DAPI görüntü için bir tek eşik değerini hesaplamak ve piksel olarak ön plan ve aşağıda eşiğin sınıflandırmak arka plan olarak. Ön plan değeri DAPI floresan yoğunluğu uygun olmasını sağlamak.
      Not: Görüntü analiz süreci 5 adım içerir; birincil nesneleri DAPI tanımlaması görüntüler, OCT4, Annexin V ve EdU görüntüleri, ikincil nesneler tanımlaması sırasıyla ve nesne yoğunluğu ölçümü. Şekil 3 görüntü işleme ayarda görüntüleri grafik kullanıcı arabirim (GUI) sağlar.
    3. Her resmin üzerine OCT4 ve EdU yoğunluklarda floresan ölçmek.
    4. Annexin V ile yayılma yöntemi ile lekeli bölgeyi tanımlamak ve floresan yoğunluğu ölçmek.
  4. 3.4. istatistiksel analiz bireysel hücresel fenotipleri tek hücreli görüntüleme üzerinde görselleştirmek için
    1. Her fenotipik işaretçisi giriş floresan yoğunluklarda merkezleme ve eşit ağırlık vermeyi bu değişkenler ölçekleme normalleştirmek.
    2. Kendiliğinden organize harita (SOM) analizi istatistiksel bilgi işlem ve önceki çalışmalar38,39tarafından açıklandığı gibi grafik için bir yazılım ortamı kullanarak gerçekleştirin.
      1. "Dört işaretleri, DAPI, EdU, Annexin V ve OCT4 floresan yoğunluklarda karşılık gelen kendine özgü dört kitabında vektörel çizimler" ile 25 SOM düğümleri oluşturur.
      2. Her microenvironment tek tek hücreleri "kazanan" (en çok benzeyen) düğüme atamak ve arsa göre kazanan düğümün kitabında vektörel çizimler ağırlıklı ortalama ağırlığı öğrenme oranı nerede kullanarak güncelleştirilmiş hücre frekans (burada, 0,05 olarak varsayılan).
        Not: Verileri veri kümeleri birkaç hücreleri içeren istatistiksel SOM sonuç vermedi çünkü az 1.000 hücreleri içeren odalarından dışarıda.
    3. Denetimsiz hiyerarşik kümeleme tarafından kümeleme yazılımı40Pearson korelasyon dayalı ortalama-bağlantı yöntemini kullanarak SOM-düğüm değerleri ile gerçekleştirin.
    4. Küme veri dendrogram ve heatmap sayısı41işlemek.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MACME diziler: tasarım ve üretim: Nanofiber teknolojisi ile birlikte, biz mikrosıvısal hücre kültürü ve önce hPSC öz-yenileme veya farklılaşma35,36 (Şekil 1) için en iyi koşulları tanımlamak için istihdam teknikleri eleme kullanılır. Bu hücre kültür odalar ve koşulları tam olarak kontrol edilebilir ve Genişletilebilir42,43

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu iletişim kuralı nitelikli hPSCs bakım için sağlam kültür sistem kurmak için ilk tarama yöntemi gösterir. İlk olarak, nasıl farklı yapay ECMs ve hücre yoğunluğu ile a nanofiber düzenlemek, MACME dizi entegre bir mikrosıvısal aygıtını kullanarak tohum bir platform hazırlamak için nitelendirdi. İkinci, nicel yansıma tabanlı tek hücreli fenotipleme bireysel hücresel sonuçları ve farklı biyokimyasal ve biyofiziksel özellikleri tarafından değiştirilmiş davranışları değerlendirmek için gerçekleştirilen50

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz Prof. N. Nakatsuji iCeMS, Kyoto Üniversitesi, insan ES hücreleri verdiğiniz için teşekkür ederiz. Ayrıca Tokyo Teknoloji Enstitüsü'nde atomik kuvvet mikroskobu kullanımında verdiği destek için Prof. A. Maruyama teşekkür. Finansman cömertçe sağlanan Japonya Derneği tarafından bilim promosyon için (JSP'ler; 22350104, 23681028, 25886006 ve 24656502); fon ayrıca yeni enerji ve Endüstriyel teknoloji geliştirme organizasyonu (Ned-o) ve Terumo Life Science Foundation tarafından sağlandı. TEFE-iCeMS dünyanın önde gelen uluslararası araştırma merkezi girişimi (TEFE), Milli Eğitim Bakanlığı, kültür, spor, bilim ve teknoloji (MEXT), Japonya tarafından desteklenir. Bu çalışmanın bir parçası Kyoto Üniversitesi Nanoteknoloji Hub ve "Nanoteknoloji platformu Projesi" MEXT, Japonya sponsorluğunda AIST Nano-işleme tesisinde tarafından desteklenmiştir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Polistiren (PS)Sigma#182435Ortalama Mw: 290.000, ortalama Mn: 130.000
Polimetilglutarimid (PMGI)MicroChemG113113
Jelatin (GT)SigmaG2625Domuz derisinden, A tipi
Sylgard 184 silikon elastomer kitiDoe Corning Toray#1064291PDMS kürleme maddesi ve silikon elastomer taban bu kitin bileşenleridir.
OpenSCADBu, mikroakışkan cihazın kalıbını tasarlamak için kullanılan ücretsiz bir 3B bilgisayar grafik yazılımıdır (http://www.openscad.org/).
AutoCAD 2014AutodeskBu, nanofiber dizi hazırlamada kullanılan maskenin tasarımı için kullanılan bir 3B bilgisayar grafik yazılımıdır (https://www.autodesk.com/products/autocad/overview).
3D yazıcı, AGILISTA-3000Keyence
UV ile kürlenebilen reçine, AR-M2KeyenceBu, Agilista tarafından 3D baskı için kullanılır.
Asetik asitSigma# 338826≥ % 99,99
Etil asetatSigma# 270989Susuz,% 99,8
Tetrahidrofuran (THF)Sigma# 401757
MSP-30TVakum CihazıMagnetron püskürtme makinesi
Nunc OmniTrayThermo Fisher Scientific# 242811Bu, nanofiber dizisinin oluşturulduğu bir polistiren taban plakasıdır. Bu plaka boyutu tipik olarak 127,7 x 85,5 mm'dir.
Tabanca tipi korona deşarj makinesiShinko Electric & EnstrümantasyonCFG-500Bu kullanışlı cihaz, protokoldeki 1.5 "MACME dizilerinin montajı" adımında PDMS katmanının alt yüzeyinin aktivasyonu için korona oluşturmak için kullanılır.
5 mL şırıngaTerumoSS-05SZ
Paslanmaz çelik künt iğne (23 gauge)Nipro# 2166Dış çap ve uzunluk sırasıyla 0,6 ve 32 mm'dir.
Yüksek voltajlı güç kaynağıTechDempaz
1-Etil-3- (3-dimetilaminopropil) karbodiimid, hidroklorürDojindoW001
N-HidroksisüksinimidSigma# 56480
Matrigel hESC Nitelikli MatrisCorning# 354277Bu protein protokolde bazal membran jel matrisi olarak adlandırılır.
CellStick Vitronektin, İnsan, ÇözümKÖK HÜCRE Teknolojileri# 07004
TeSR-E8KÖK HÜCRE Teknolojileri# 05940İnsan ES ve iPS hücrelerinin bakımı için besleyici içermeyen, kseno içermeyen kültür ortamı
Y-27632Wako Saf Kimya Endüstrileri# 253-00513
TrypLE Express Enzim (1X), fenol kırmızısıThermo Fisher Scientific# 12605028Bu, yapışık memeli hücrelerinin ayrışması için rekombinant tripsin benzeri bir proteazdır.
Alexa Fluor 647 ile Click-iT EdU Görüntüleme Kiti AzidesThermo Fisher ScientificC10086Plaka üzerinde floresan boyamada çoğalan hücrelerin floresan etiketlemesi, bu kitin ürün kılavuzu boyunca gerçekleştirilmiştir.
Annexin V, Alexa Fluor 594 eşlenikThermo Fisher ScientificA13203
4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)Thermo Fisher ScientificD1306
Oct-3/4 Antikor (C-10)Santa Cruz Biyoteknolojisc-5279
Eşek Anti-Fare IgG H & L (DyLight 488)abcamab96875Bu, plaka üstü floresan hücre boyamada kullanılan ikincil bir antikordur.
ECLIPSE Ti-ENikonBu, CFI Plan Fluor 4×/0.13 NA objektif lens (Nikon), CCD kamera (ORCA-R2, Hamamatsu), cıva lambası (Intensilight, Nikon), XYZ otomatik tabla (enkoderli Ti-S-ER motorlu tabla, Nikon) ve dört floresan kanalı (DAPI, GFP HYQ, TRITC, Cy5; Nikon)
NIS-Elements Advanced ResearchNikonBu, otomatik görüntü elde etmek için kullanılan bir mikroskop görüntüleme yazılımıdır.
CellProfiler, Sürüm 2.1.0Bu, hücre görüntü analizi (http://cellprofiler.org/) için ücretsiz bir açık yazılımdır.
RSOM analizi bu yazılımın kohonen paketi ile gerçekleştirilir. Bu ücretsiz olarak kullanılabilir (https://www.r-project.org/).
Küme 3.0Bu, açık kaynaklı kümeleme yazılımıdır (http://bonsai.hgc.jp/~mdehoon/software/cluster/software.htm). Bu yazılım ile denetimsiz hiyerarşik kümeleme gerçekleştirilir.
Java TreeViewBu açık kaynaklı yazılım (http://jtreeview.sourceforge.net/), kümeleme verilerini bir ısı haritası ve bir dendrogram olarak görselleştirmek için kullanılır.
H9 insan embriyonik kök hücreWiCell Kök Hücre BankasıWA09

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  2. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  3. Ameen, C., et al. Human embryonic stem cells: Current technologies and emerging industrial applications. Crit Rev Oncol Hematol. 65 (1), 54-80 (2008).
  4. Nishikawa, S., Goldstein, R. A., Nierras, C. R. The promise of human induced pluripotent stem cells for research and therapy. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (9), 725-729 (2008).
  5. Robinton, D. A., Daley, G. Q. The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy. Nature. 481 (7381), 295-305 (2012).
  6. Sartipy, P., Bjorquist, P., Strehl, R., Hyllner, J. The application of human embryonic stem cell technologies to drug discovery. Drug Discovery Today. 12 (17-18), 688-699 (2007).
  7. Discher, D. E., Mooney, D. J., Zandstra, P. W. Growth factors, matrices, and forces combine and control stem cells. Science. 324 (5935), 1673-1677 (2009).
  8. Joyce, J. A., Pollard, J. W. Microenvironmental regulation of metastasis. Nat Rev Cancer. 9 (4), 239-252 (2009).
  9. Danhier, F., Feron, O., Preat, V. To exploit the tumor microenvironment: Passive and active tumor targeting of nanocarriers for anti-cancer drug delivery. J Control Release. 148 (2), 135-146 (2010).
  10. Murphy, W. L., McDevitt, T. C., Engler, A. J. Materials as stem cell regulators. Nat Mater. 13 (6), 547-557 (2014).
  11. Patel, A. K., et al. A defined synthetic substrate for serum-free culture of human stem cell derived cardiomyocytes with improved functional maturity identified using combinatorial materials microarrays. Biomaterials. 61, 257-265 (2015).
  12. Zhang, R., et al. A thermoresponsive and chemically defined hydrogel for long-term culture of human embryonic stem cells. Nat Commun. 4, (2013).
  13. Anderson, D. G., Putnam, D., Lavik, E. B., Mahmood, T. A., Langer, R. Biomaterial microarrays: rapid, microscale screening of polymer-cell interaction. Biomaterials. 26 (23), 4892-4897 (2005).
  14. Celiz, A. D., et al. Discovery of a Novel Polymer for Human Pluripotent Stem Cell Expansion and Multilineage Differentiation. Adv Mater. 27 (27), 4006-4012 (2015).
  15. Hansen, A., et al. High-Density Polymer Microarrays: Identifying Synthetic Polymers that Control Human Embryonic Stem Cell Growth. Adv Healthcare Mater. 3 (6), 848-853 (2014).
  16. Mei, Y., et al. A high throughput micro-array system of polymer surfaces for the manipulation of primary pancreatic islet cells. Biomaterials. 31 (34), 8989-8995 (2010).
  17. Saha, K., et al. Surface-engineered substrates for improved human pluripotent stem cell culture under fully defined conditions. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (46), 18714-18719 (2011).
  18. Bettinger, C. J., Langer, R., Borenstein, J. T. Engineering substrate topography at the micro- and nanoscale to control cell function. Angew Chem Int Ed Engl. 48 (30), 5406-5415 (2009).
  19. McMurray, R. J., et al. Nanoscale surfaces for the long-term maintenance of mesenchymal stem cell phenotype and multipotency. Nat Mater. 10 (8), 637-644 (2011).
  20. Sun, Y., Jallerat, Q., Szymanski, J. M., Feinberg, A. W. Conformal nanopatterning of extracellular matrix proteins onto topographically complex surfaces. Nat Methods. 12 (2), 134-136 (2015).
  21. Nitanan, T., et al. Effects of processing parameters on morphology of electrospun polystyrene nanofibers. Korean J Chem Eng. 29 (2), 173-181 (2012).
  22. Liu, L., et al. Chemically-defined scaffolds created with electrospun synthetic nanofibers to maintain mouse embryonic stem cell culture under feeder-free conditions. Biotechnol Lett. 34 (10), 1951-1957 (2012).
  23. Liu, L., et al. Nanofibrous gelatin substrates for long-term expansion of human pluripotent stem cells. Biomaterials. 35 (24), 6259-6267 (2014).
  24. Kamei, K., et al. Phenotypic and transcriptional modulation of human pluripotent stem cells induced by nano/microfabrication materials. Adv Healthcare Mater. 2 (2), 287-291 (2013).
  25. Peerani, R., et al. Niche-mediated control of human embryonic stem cell self-renewal and differentiation. EMBO J. 26 (22), 4744-4755 (2007).
  26. Yamamoto, K., et al. Fluid shear stress induces differentiation of Flk-1-positive embryonic stem cells into vascular endothelial cells in vitro. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 288 (4), 1915-1924 (2005).
  27. Charati, S. G., Stern, S. A. Diffusion of gases in silicone polymers: Molecular dynamics simulations. Macromolecules. 31 (16), 5529-5535 (1998).
  28. Prado-Lopez, S., et al. Hypoxia promotes efficient differentiation of human embryonic stem cells to functional endothelium. Stem Cells. 28 (3), 407-418 (2010).
  29. Yanagihara, K., et al. Prediction of Differentiation Tendency Toward Hepatocytes from Gene Expression in Undifferentiated Human Pluripotent Stem Cells. Stem Cells and Development. 25 (24), 1884-1897 (2016).
  30. Kamei, K., et al. 3D printing of soft lithography mold for rapid production of polydimethylsiloxane-based microfluidic devices for cell stimulation with concentration gradients. Biomed Microdevices. 17 (2), (2015).
  31. Song, J. H., Kim, H. E., Kim, H. W. Production of electrospun gelatin nanofiber by water-based co-solvent approach. J Mater Sci Mater Med. 19 (1), 95-102 (2008).
  32. Owen, M. J., Smith, P. J. Plasma Treatment of Polydimethylsiloxane. J Adhes Sci Technol. 8 (10), 1063-1075 (1994).
  33. Chen, G. K., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nat Methods. 8 (5), 424-476 (2011).
  34. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25 (6), 681-686 (2007).
  35. Kamei, K., et al. An integrated microfluidic culture device for quantitative analysis of human embryonic stem cells. Lab Chip. 9 (4), 555-563 (2009).
  36. Kamei, K., et al. Microfluidic image cytometry for quantitative single-cell profiling of human pluripotent stem cells in chemically defined conditions. Lab Chip. 10 (9), 1113-1119 (2010).
  37. Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7 (10), 100(2006).
  38. Kohonen, T. Self-Organized Formation of Topologically Correct Feature Maps. Biol Cybern. 43 (1), 59-69 (1982).
  39. Wehrens, R., Buydens, L. M. C. Self- and super-organizing maps in R: The kohonen package. J Stat Softw. 21 (5), 1-19 (2007).
  40. Eisen, M. B., Spellman, P. T., Brown, P. O., Botstein, D. Cluster analysis and display of genome-wide expression patterns. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (25), 14863-14868 (1998).
  41. Saldanha, A. J. Java Treeview--extensible visualization of microarray data. Bioinformatics. 20 (17), 3246-3248 (2004).
  42. Du, G. S., Fang, Q., den Toonder, J. M. J. Microfluidics for cell-based high throughput screening platformsd-A review. Anal Chim Acta. 903, 36-50 (2016).
  43. Huang, S. B., et al. An integrated microfluidic cell culture system for high-throughput perfusion three-dimensional cell culture-based assays: effect of cell culture model on the results of chemosensitivity assays dagger. Lab Chip. 13 (6), 1133-1143 (2013).
  44. Wang, B. L., et al. Microfluidic high-throughput culturing of single cells for selection based on extracellular metabolite production or consumption. Nat Biotechnol. 32 (5), 473(2014).
  45. Becker, K. A., et al. Self-renewal of human embryonic stem cells is supported by a shortened G1 cell cycle phase. J Cell Physiol. 209 (3), 883-893 (2006).
  46. Neganova, I., Lako, M. G1 to S phase cell cycle transition in somatic and embryonic stem cells. J Anat. 213 (1), 30-44 (2008).
  47. Fox, V., et al. Cell-cell signaling through NOTCH regulates human embryonic stem cell proliferation. Stem Cells. 26 (3), 715-723 (2008).
  48. Xu, C., et al. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 19 (10), 971-974 (2001).
  49. Kamei, K., et al. Microfluidic-Nanofiber Hybrid Array for Screening of Cellular Microenvironments. Small. 13 (18), (2017).
  50. Sun, J., et al. A Microfluidic Platform for Systems Pathology: Multiparameter Single-Cell Signaling Measurements of Clinical Brain Tumor Specimens. Cancer Res. 70 (15), 6128-6138 (2010).
  51. Theunissen, T. W., Jaenisch, R. Molecular Control of Induced Pluripotency. Cell Stem Cell. 14 (6), 720-734 (2014).
  52. Yoo, H. S., Kim, T. G., Park, T. G. Surface-functionalized electrospun nanofibers for tissue engineering and drug delivery. Adv Drug Del Rev. 61 (12), 1033-1042 (2009).
  53. Dixon, J. E., et al. Combined hydrogels that switch human pluripotent stem cells from self-renewal to differentiation. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (15), 5580-5585 (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment ArrayNanofiber Array FabricationMicrofluidic Structure AssemblyElectrospinning ProcessStem Cell PhenotypingSingle Cell ProfilingFluorescence ImagingSOM AnalysishPSC Self RenewalPDMS Molding

Related Articles