Rekombinant retroviral integrase ve DNA reaksiyonlar viral DNA uçları taklit eden bir intasome bilinen bir enzimatik etkin kompleks oluşabilir. Intasomes biyokimyasal, yapısal ve Kinetik çalışmalar için kullanılır. Bu protokolü nasıl bir araya getiren ve prototip köpüklü virüs intasomes arındırmak ayrıntılı.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Derleme ve prototip köpüklü virüs Intasomes arıtma
Bu makalede
Özet
Özet
A özelliği ve gerekli adım retrovirüsü yaşam döngüsünün tanimlar viral genom entegrasyon ana bilgisayar genom. Tüm Retrovirüsler kovalent ana bilgisayara strand transfer olarak bilinen DNA viral birleştirilmesi tromboksan integrase (IN) enzim kodlamak. Entegrasyon modellenmiş vitro rekombinant retroviral inç ile olmak ve viral genom uçları taklit eden DNA reaksiyonlar olabilir. Daha yakından vivo içindeentegrasyon oluşur Tümleştirme tepki özetlemek için kompleksleri rekombinant inç ve sentetik reaksiyonlar diyaliz azaltılmış tuz konsantrasyonu arabellekte tarafından monte edilir. Entegrasyonu karmaşık, bir intasome olarak adlandırılan boyut dışlama Kromatografi tarafından saf. Prototip köpüklü virüs (PFV), söz konusu olduğunda intasome inç bir tetramer ve iki DNA reaksiyonlar ve kolayca monomeric inç ve ücretsiz oligomer DNA ayrılır. PFV intasomes entegrasyon verimliliği daha iyi dinamiklerini anlamak için deneysel koşullar çeşitli ve mekanik retroviral entegrasyon altında denetlesinler.
Giriş
Ana bilgisayar genom viral genom entegrasyonu döngüsündeki tüm Retrovirüsler1zorunlu bir adımdır. Viral enzim integrase (IN) viral DNA genom DNA ağırlamaktan her iki ucuna kovalent katılmadan tromboksan. Hücresel bir enfeksiyon sırasında Tümleştirme aracılık eder öncesi entegrasyonu karmaşık bir parçasıdır. Rekombinant inç viral DNA uçları taklit çift iplikçikli DNA reaksiyonlar ile complexed da bir hedef DNA vitro2entegrasyon gerçekleştirebilirsiniz. Bir ortak Tümleştirme tahlil vitro supercoiled plazmid DNA hedef kullanır. Her iki viral DNA reaksiyonlar (vDNA) için plazmid bütünleştirilmesi doğrusal b....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. tavlama, vDNA
- Birleştirme 1 X on tampon (10 X 10 hisse senedi: 100 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 M NaCl, 10 mM EDTA), 10 µM Oligo 1 (5' ATTGTCATGGAATTTTGTATATTGAGTGGCGCCCGAACAG 3', 100 µM hisse senedi) ve 10 µM Oligo 2 (5' CTGTTCGGGCGCCACTCAATATACAAAATTCCATGACA 3', 100 µM hisse senedi) son hacmi 1.5 mL ' . Aliquot 25 µL altmış 0,2 mL Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) tüpler içine.
Not: fluorophores veya Etiketler sonunda 5'-Oligo 2 veya bir iç amino-T 5'-sonundan itibaren Oligo 1 temel 13 olarak reaksiyonlar uygulamaya bağlı olarak değiştirilebilir. Değiştirilmiş reaksiyonlar tarafından yüksek performanslı sıvı Kromatografi (HPLC) tavlama önce saf. Biz 5' uç ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
PFV intasomes rekombinant inç vDNA toplanır. Derleme sonra intasomes (şekil 1) SEC tarafından saf. Entegrasyon etkinliği her kesir bir supercoiled DNA hedef ve özel Jel Elektroforez ile (Şekil 2) denetlesinler. Bu jel EtBr (ve fluorophore, fluorophore etiketli vDNA kullanılırsa) algılamak için ayarla floresan tarayıcıyla görüntüsü. Görüntü analiz yazılımı kullanarak, grup piksel birimleri entegrasyon verimliliği (
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Retroviral Ins entegrasyonu gerçekleştirmek için ve viral ömrünün devam viral genomik DNA ile karmaşık bir multimeric oluştururlar. Monomer intasome başına sayısı tetramers, octamers ya da muhtemelen daha yüksek sipariş multimers11,12,13,14olabilir. PFV intasomes3. bir tetramer rekombinant viral genomik DNA taklit çift iplikçikli DNA reaksiyonlar ile biter vardı.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar ifşa gerek yok.
Teşekkürler
Bu eser NIH AI099854 ve AI126742 için anahtar tarafından desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| DNA Oligomerleri | IDT N | /A | Özel DNA Oligos |
| Tris Ultra Saf | Gojira İnce Kimyasallar | UTS1003 | |
| NaCl | P212121 | RP-S23020 | |
| UltraPure EDTA | Invitrogen/Gibco | 15575 | |
| Amicon Ultra 0.5 mL santrifüj filtreler | Sigma-Aldrich | Z677094-24EA | 3 kDa MWCO |
| DTT | P212121 | SV-DTT | |
| BIS-TRIS propan, >=%99,0 (titrasyon) | Sigma-Aldrich | B6755-500G | |
| ZnCl2 | Sigma-Aldrich | 208086 | |
| MgSO4 | Amresco | 0662 | |
| Gliserol | Thermo Fisher Scientific | G37-20 | |
| Jel yükleme uçları, 1 - 200 μ L | Corning | CLS4853-400EA | |
| Tıraş bıçağı; Tek kenarlı; 100/Pk.; 100'lük | Paket Fisher Scientific | 12-640 | |
| PES Membranlı Steril Tek Kullanımlık Filtre Üniteleri > 250mL | Thermo Fisher Scientific | 568-0020 | |
| Diyaliz tüp klipsleri | Spectrum Labs | 132734 | |
| 6-8 kDa 10 mm Diyaliz Tüpü | Spectrum Medical | 132645 | |
| Superose 6 10/300 GL | GE Healthcare Yaşam Bilimleri | 17517201 | |
| Yüksek Çözünürlüklü Standart | Agatar AGTC Biyoürünler | AG500D1 | |
| Etidyum bromür | Thermo Fisher Scientific | BP1302 | |
| Turuncu G | Fisher Scientific | 0-267 | |
| Hyladder 10kb, 500 şerit | Denville Scientific | CB4225-4 |
Kaynaklar
- Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. Retroviruses. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1997).
- Valkov, E., et al. Functional and structural characterization of the integrase from the prototype foamy virus. Nucleic Acids Res. 37 (1), 243-255 (2009).
- Hare, S., Gupta, S. S., Valkov, ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
