Burada, biz ChIP-Seq gerçekleştirmek için yöntemleri tarif ve CARIP-yeni nesil sıralama, Kütüphane hazırlık dahil olmak üzere küresel epigenomic ve kromatin ilişkili RNA oluşturmak için Seq, ES hücrelerde eşler.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
CARIP-Seq ve ChIP-Seq: kromatin ilişkili RNA ve Protein-DNA etkileşimleri embriyonik kök hücreleri tanımlamak için yöntemleri
Bu makalede
Özet
Özet
Embriyonik kök (ES) hücre kendini yenileme ve farklılaşma dışsal sinyalleri ve transkripsiyon faktörleri, epigenetik düzenleyiciler ve combinatorially gen etkisi histon sonrası çeviri değişiklikler iç ağlar tarafından yönetilir Yakındaki genlerin ifade durumu. Kromatin dinamikleri ve gen ekspresyonu düzenleyen çeşitli proteinler ile etkileşim için RNA da gösterilmiştir. Kromatin ilişkili RNA immunoprecipitation (CARIP) yeni nesil sıralama (CARIP-Seq) tarafından takip RNA'ların kromatin proteinleri kromatin immunoprecipitation ardından yeni nesil sıralama () tarafından süre ile ilgili ankete roman bir yöntemdir ChIP-Seq) histon, transkripsiyon faktörleri ve küresel ölçekte-ES hücrelerdeki epigenetik değiştiriciler translasyonel modifikasyon konumunu eşlemek için bir güçlü genomik tekniktir. Burada, CARIP-Seq ve ChIP-Seq yeni nesil sekanslama için Kütüphane inşaat dahil olmak üzere, küresel kromatin ilişkili RNA ve epigenomic haritalar ES hücreleri oluşturmak için gerçekleştirmek için yöntemleri açıklanmaktadır.
Giriş
Embriyonik kök (ES) hücre kader kararlar arasında ekstrasellüler sinyalleri ve transkripsiyon-düzenleyiciler, histon değiştiriciler ve histon kuyrukları sonrası çeviri değiştirilmesi de dahil olmak üzere bir dizi iletişim tarafından düzenlenmektedir. Bu etkileşimler kromatin erişilebilirlik ve kromatin paketlenmesi birine iki durumu kolaylaştırmak: euchromatin, açık ve transcriptionally etkin olan ve sık ve genellikle transcriptionally etkin olmayan heterochromatin. Transkripsiyon faktörleri DNA fingerprinting bağlama benzeşim ve euchromatic bölgeleri ile epigenetik değiştiriciler ortak Gen ifadesinin kontrolünde katılmak için. ChIP-Seq1, dahil....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. fare ES kültürünü koşullarda besleyici içermeyen hücreleri.
Not: Fare ES hücreleri geleneksel medya jelatin ve mitotically Inaktif olan fare embriyonik fibroblastlar (MEF), mono-tabakası ile kaplı bir hücre kültür tabak (iMEFs) üzerinde kültürlü. Ancak, MEFs RNA ve MEF ilişkili kromatin kontaminasyonu önlemek için aşağı akım epigenetik veya ifade analizleri önce kaldırılması gerekir.
- Besleyici katman hazırlanması: jelatin suda 2 mL % 0,1 jelatin ekleyerek bir 6-şey hücre kültür plaka ceket ve plaka için 20-30 dk 37 ° C'de kuluçkaya.
- 2 mM L-glutamin, % 10 fetal Sığır serum (FBS) ve 1 x penisilin/streptomisin içeren % 1....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Başarılı bir şekilde H3K4me3, H3K4me2 ve KDM5B bu çip Seq Protokolü6kullanarak ES hücrelerdeki genom çapında bağlama sorguladık. ES hücreler kültürlü besleyici-Alerjik koşullarda (Şekil 1) ve yukarıda açıklandığı gibi çapraz bağlı. Sonication daha sonra ChIP-Seq Protokolü 3.2. adımında açıklandığı gibi gerçekleştirilen ve DNA üzerinde bir % 2 özel jel (Şekil 2) çalıştırarak değerlendirilir. Daha sonra ChIP.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Çip Seq küresel protein-DNA etkileşimleri konumunu değerlendirmek için yararlı bir yöntemdir (Örn., transkripsiyon faktörleri/histon enzimler/histon modifikasyonları ve DNA değiştirme) ES hücrelerde, yeni geliştirilen CARIP-Seq Protokolü içinde yararlı iken RNA'ların genom çapında Derneği ile kromatin bileşenlerinin sorguluyor. Çip Seq ES Hücre epigenetik manzara ve diğer hücre tipleri değerlendirmek için kullanılan temel bir araçtır. ChIP-Seq ve CARIP-Seq kitaplıkları kalitesini büyük ölçüde ChIP-grade antikorl.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar hiçbir çıkar çatışması beyan ederim.
Teşekkürler
Bu eser Wayne State Üniversitesi, Karmanos Kanser Enstitüsü, Ulusal Kalp, akciğer ve kan Enstitüsü (1K22HL126842-01A1) B.L.K. için layık bir hibe tarafından desteklenmiştir Bu eser Wayne State Üniversitesi yüksek performans Grid bilgi sayısal kaynaklar için kullanılan (< https://www.grid.wayne.edu/>). Jiji logg CARIP Seq veri analizi ile yardım için teşekkür.
YAZARLARIN KATKILARI:
B.L.K. CARIP-Seq yöntemi gebe, tasarlanmış ve ChIP-Seq ve CARIP-Seq deneyler, sıralama veri analiz ve el yazması askere. Tüm yazarları okudum ve onaylanmış bu el yazması son sürüm.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Fare lösemi inhibitör faktörü (ESGRO LIF) | EMD Millipore | 106 < / sup>veya 107 < / sup> | |
| birimleri GSK3 ve beta; inhibitör CHIR99021 (GSK3i) | Stemgent | Çözücü: DMSO 10mM | |
| MEK inhibitörü PD0325901 (MEKi) | Stemgent | Çözücü: DMSO 10mM | |
| Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM), yüksek glikoz | İnvitrojen | 11965092 | |
| PBS (fosfat tamponlu salin) | İnvitrojen | 10010031 | |
| Tripsin-EDTA (% 0.25), fenol kırmızısı | Gibco | 25200056 | |
| Penisilin-Streptomisin (10.000 U / mL) | Gibco | 15140122 | |
| 2-Merkaptoetanol (50 mM) | Gibco | 31350010 | |
| MEM Esansiyel Olmayan Amino Asit Çözeltisi (100X) | Gibco | 11140076 | |
| EmbryoMax ES Hücre Nitelikli Fetal Sığır Serumu, 500 ml | EMD Millipore | ES-009-B | |
| EmbryoMax %0.1 Jelatin Çözeltisi | EMD Millipore | ES-006-B | |
| Glisin | Sigma | G7126-500G | 1.25 M suda stok konentrasyonu |
| Formaldehit çözeltisi | Sigma | F8775-500ML | |
| TE (Tris EDTA) pH 8.0 1X | Kalite Biyolojik | 351-011-131 | |
| Fenilmetansülfonil florür (PMSF) çözeltisi | Sigma | 93482-250ML-F | |
| cOmplete Proteaz İnhibitörü Kokteyli | Roche | 11697498001 | |
| Sodyum dodesil sülfat çözeltisi (%20) | Kalite Biyolojik | A611-0837-10 | |
| Q125 sonifier | Qsonica | 4422 | |
| Triton X-100 çözeltisi | Sigma | 93443-100ML | |
| Sodyum deoksikolat | Sigma | 30970 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| İmmünopresipitasyon için Dynabeads Protein G | Invitrogen | 10004D | |
| İmmünopresipitasyon için Dynabeads Protein A | Invitrogen | 10002D | |
| Dynabeads Protein A / Protein G ve Mıknatıs Başlangıç Paketi | Invitrogen | 10015D | |
| Lityum klorür | Sigma | L4408 | |
| IGEPAL CA-630 | Sigma | I8896 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Dynabeads mRNA Saflaştırma Kiti (toplam RNA preparatlarından mRNA saflaştırması için) | Invitrogen | 61006 | |
| SuperScript Çift Sarmallı cDNA Sentezi Kit | Invitrogen | 11917010 | |
| QIAquick PCR Saflaştırma Kiti | Qiagen | 28104 | |
| End-It DNA Uç Onarım Kiti | Lucigen | ER81050 | |
| Klenow Parçası (3'→ 5' ekzo-) | NEB | M0212L | |
| dATP (10 mM) | İnvitrojen | 18252015 | |
| T4 DNA ligaz | NEB | M0202L | |
| TrackIt 1 Kb Plus DNA Merdiven | İnvitrojen | 10488085 | |
| E-jel EX agaroz jelleri, %2 | Invitrogen | G402002 | |
| Phusion yüksek kaliteli HF tamponlu 2X ana karışım | Thermo Fisher | ||
| ChIPAb + Trimetil-Histon H3 (Lys4) - ChIP Onaylı | Antikor EMD Millipore | 17-614 | |
| Anti-Histon H3 (di metil K4) antikoru [Y47] - ChIP Sınıfı (ab32356) | Abcam | ab32356 | |
| Corning Costar Düz Tabanlı Hücre Kültürü Plakaları (6 kuyulu) | Fisher | 720083 | |
| Falcon Standart Doku Kültürü Kapları (10cm) | Fisher | 08772E | |
| Bioruptor pico | Diagenode | B01010001 | |
| Qubit Flurometre 2.0 | Thermo Fisher | ||
| Qubit dsDNA HS Test Kiti | Thermo Fisher | Q32851 | |
| MinElute Reaksiyon Temizleme Kiti | Qiagen | 28204 | |
| MinElute Jel Ekstraksiyon Kiti | Qiagen | 28604 | |
| Anti-Histon H4 (tri metil K20) antikoru - ChIP Sınıfı (ab9053) | Abcam | ab9053 | |
| Labquake döndürücü | Thermo Fisher | 400110Q | |
| Illumina HiSeq platformu | Illumina | ||
| TURBO DNase | Invitrogen | AM2238 |
Kaynaklar
- Barski, A., et al. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell. 129 (4), 823-837 (2007).
- Chen, X., et al. Integration of external signaling pathways with the core transcriptional network in embryonic stem cells....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
