Yöntem makalesi

Ablasyon nöronal nüfusunun iki fotonlu lazer ve kalsiyum görüntüleme ve davranış kayıt zebra balığı larva kullanarak kendi değerlendirme kullanma

DOI:

10.3791/57485

⸱

2 Haziran 2018

 , 
1Division of Molecular and Developmental Biology, National Institute of Genetics, Department of Genetics, SOKENDAI (The Graduate University for Advanced Studies)

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, zebra balığı larvaları üzerinden bir iki fotonlu lazer nöronların genetik olarak etiketlenmiş bir subpopulation ablate için bir protokol mevcut.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bir subpopulation davranış nöronların rolü tanımlamak için faaliyete yaşayan hayvanlarda engelleme sonuçlarını test etmek esastır. Ne zaman sinir hücreleri seçerek floresan problar ile etiketlenir lazer ablasyon nöronların bu amaç için etkili bir yöntemdir. Bu da çalışmanın, bir subpopulation iki fotonlu mikroskop kullanarak ve onun işlevsel ve davranışsal sonuçları test nöronların ablating lazer protokollerde açıklanmıştır. Bu çalışmada, zebra balığı larva'av yakalama davranışı bir çalışma modeli kullanılır. Pretecto-hipotalamik devre davranış bulaşıcı görsel olarak tahrik av altında yatan olduğu bilinmektedir. Zebra balığı Pretetto lazer ablated ve hipotalamus (ILH; pretectal projeksiyon hedef) alt lob nöronal aktivite incelenmiştir. Av yakalama davranışı pretectal ablasyon sonra da test edildi.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nasıl davranış beyinde nöronal aktivite doğar anlamak için bu davranışı üretimi söz konusu sinir devreleri tanımlamak gereklidir. Küçük, şeffaf beyinleri geniş bir alanda hücresel çözünürlükte nöronal aktivite araştırmak olanak sağlar çünkü beyin fonksiyonu eğitim davranışı ile ilişkili larva aşamasında, zebra balığı ideal bir hayvan modeli sağlar. davranış1gözlem sırasında beyin. Görüntüleme belirli nöronlar nöronal faaliyete GCaMP2gibi genetik olarak kodlanmış kalsiyum (Ca) göstergeleri (turk) icadı sayesinde mümkün olmuştur. GCaMP transgenik zebra balığı işlevsel sinir devre davranışı ile hayvanlar3davranışlar içinde Ca görüntüleme yaparak ilişkilendirmek için yararlı olması için kanıtlanmış.

CA görüntüleme nöronal aktivite ve davranışı arasındaki bağıntıları kanıtlamanın, nedensellik, göstermek için nöronal aktivite ve onun consequence(s) davranışı üzerinde test bastırılması iken önemli adımlar. Bunu sağlamanın çeşitli yolları vardır: belirli sinir devreleri4, nörotoksinler belirli nöronlar5,6, halorhodopsin7gibi optogenetic araçların kullanımını ifade değiştirir genetik mutasyonun kullanın ve Lazer ablasyon hedeflenen nöronlar8,9. Lazer ablasyon belirli nöronlar nispeten az sayıda etkinliğinde ortadan kaldırılması için özellikle uygundur. Geri dönüşü olmayan sinir hücreleri öldürmek tarafından nöronal aktivite kaldırılması davranış sonuçları değerlendirilmesi kolaylaştırır.

Zebra balığı larva safhasında gözlenen bir ilginç av yakalama (Şekil 1A) davranıştır. Bu görsel olarak destekli, hedefe yönelik davranış olumlu bir deneysel sistem görme keskinliği10, visuomotor dönüştürme11,12,13, görsel algı ve tanınması için çalışma sağlar. nesneleri14,15,16,17,18ve karar verme19. Nasıl yırtıcı yırtıcı ve AVI algılama av nasıl yol açar tarafından davranış yakalamak neuroethology20merkezi bir soru olmuştur kabul edilmektedir. Bu yazıda, Pretetto çekirdeğinde projeksiyonları tarafından kurulan pretecto-hipotalamik devre rolü ele (çekirdek pretectalis superficialis pars magnocellularis, bundan sonra sadece Pretetto kaydetti) için ILH. Lazer-ablasyon Pretetto, av yakalama etkinliğini azaltmak ve nöronal visual av algı21ile ilişkili ILH etkinliğinde kaldırılması gösterilmiştir. Burada, yerine getirmek için kullanılan iletişim kuralları lazer ablasyon ve onun etkisi Ca2 + görüntüleme ve davranış kayıt içinde zebra balığı larva açıklanmıştır kullanarak test.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. bir Subpopulation bir lazer iki fotonlu mikroskop kullanarak nöronların ablasyon

Not: Kullanıcılar Ca görüntüleme aşağıdaki ablasyon edâ planlıyorsanız, UAShspzGCaMP6s satır21kullanın. Kullanıcılar davranış kayıt ablasyon takip edâ planlıyorsanız, ablasyon EGFP pozitif hücrelerinin daha GCaMP6s ifade hücrelerinin gerçekleştirmek kolay olan UAS:EGFP çizgi kullanın.

  1. Etiketler belirlenmesi için belirli sinir hücreleri ve UAS:EGFP ya UAShspzGCaMP6s Gal4 bir satýr çiftleşme kadar ayarlayarak başlar. Sedef homozygotes elde edilebilir için her iki ebeveyn sedefli arka plan kullanmayı unutmayın.
    Not: Sedef homozygotes yok melanophores vücut yüzeyi (Şekil 1B) içerir. Mevcut çalışma, (ki Pretetto etiketleri) bir Gal4 satır gSAIzGFFM119B ve başka bir Gal4 hattı (hangi ILH etiketleri) hspGFFDMC76A kullanılan21vardır.
  2. Ertesi gün çiftleşme kurulumu, zebra balığı yumurta toplamak ve onları bu noktada faiz nöronlar floresan gazetecilere ifade edecek larva aşaması için yükseltmek.
  3. Zebra balığı larva de %2 düşük erime noktası-özel (Şekil 1B) bağlayın.
    1. %2 özel stok çözelti hazırlama başlayın: 2 g dağıtılması düşük erime noktası özel toz 100 mL sistem su (yani, dolaşımdaki su sisteminde yetişkin zebra balığı korumak için kullanılan su)22 veya E3 su23, su getirerek Kaynama noktası bir mikrodalga ve şiddetle karıştırma için.
    2. Kaynar kadar % 2 düşük erime noktası özel hisse senedi mikrodalga. 6-cm Petri kabına kapağı üzerine özel 3.5-4.0 mL dökün. Böylece devam etmeden önce dokunmak sıcak özel soğur kadar bekleyin.
    3. Daha sonra (Bu adımda anestezi değil) tek bir larva özel yerleştirin. Böylece dik, diseksiyon iğne (Şekil 1C), konumu ve larva yönünü ayarlama tutmak larva uygun konumlandırma sağlamak için özel katılaşır kadar.
      Not: Larva iken özel katılaşır çevresinde yüzerek devam edecektir.
    4. Larva konumlandırılmış, 5 min için tamamen kuvvetlendirmek özel izin verme.
    5. 5 mL tricaine çözeltisi (1 x çalışma konsantrasyonu % 0,4) özel dökün.
      Not: Hareketleri larva tarafından lazer Ablasyon sırasında önlemek için larvalar ablasyon işlemi imzalat tutulması gerekir.
  4. Bir iki fotonlu lazer mikroskobu sisteminde beyazlatma işlevini kullanarak larva ablate.
    1. Bir iki fotonlu lazer tarama mikroskop altında özel katıştırılmış larva yerleştirin ve mikroskopi sistemini başlatın.
    2. Görüntü alma yazılımı başlatmak ve lazer (Şekil 1D) açmak için "Lazer" sekmesinde "On" düğmesini tıklatın. "Modu-kilitli için." "Meşgul" değiştirmek için lazer "durum" bekleyin
    3. 880 lazer dalga boyu "Kanallar" sekmesinde ayarlanan nm (maksimum güç: Yaklaşık 2300 mW) EGFP ablasyon ya da 800 nm (maksimum güç: yaklaşık 2.600 mW) GCaMP ablasyon için.
    4. 20 X objektif lens lens tabanca taşıyarak el ile seçin. "Yerleştirme" sekmesini tıklatın, "GFP" optik yolları değiştirmek ve floresan göz tarafından doğrudan görüntülemek için.
    5. Zebra balığı larva beyin görüntüleme merkezinde bulun; sonra iki fotonlu mikroskobu geri dönmek "Satın alma" sekmesini tıklatın.
    6. 'Önce ablasyon' koşulu bir kayıt olarak, bir z-yığın görüntü 20 X objektif lens ile hızlı tarama-(ısı-zarar görmemesi için) hızda al. Daha sonra önce ve sonra ablasyon deneyler (Şekil 2A) çekilen görüntüleri karşılaştırın. "Z-yığın" z-yığın seçeneği seçin ve sonra larva beyin ventral tarafta odaklanarak alt sınırı (tıklayın "ayarla ilk" düğmesi") ve üst sınırı ("Son Set"düğmesini tıklatın) sekmesini genişletmek odaklanan sonra z fiş almak için tıklatın dorsal çoğu yüzey beyin. O zaman, z-yığın resim alma çalıştırmak için "Başlat Experiment" düğmesini tıklatın.
    7. 63 X objektif lens lens tabanca taşıyarak el ile seçin.
    8. Epi-floresan mikroskopi geçiş, görünümü merkezinde göz tarafından ablated için hücreleri bulun, sonra tarama mikroskobu lazer geri dönmek "Satın alma" sekmesini tıklatın için "Yerleştirme" sekmesini tıklatın.
  5. "Satın alma modu" sekmesinde, "Çerçeve boyutu" 256 x 256 ayarlayın. "Canlı"'yı tıklatın ve nöronlar ilgi gözlemlemek.
  6. En arka taraftan başlayarak, ablated için hücreleri odakta olan bir odak düzlemi bulmak.
  7. Küçük, dairesel bir alan "Bölgeler" işlevini kullanarak yaklaşık üçte hücrenin boyutu çapı üzerinde her neuron ilgi (ROI) bir bölge olarak işaretleyin.
  8. Bir lazer Işınma Zamanı yaklaşık 200 µs/piksel veya 200 µs/0,5 µm için karşılık gelen 13,93 s/256 x 256 piksel (134.42 µm x 134.42 µm), için tarama hızını ayarlar. Ayrıca, 4 tekrar ayarla (' yineleme döngüsü: 4'). Böylece yeterli ablasyon elde alternatif olarak, yineleme ve tarama hızı optimize edin.
  9. Örnek (öncesi ve sonrası ablasyon) ve '(ROIs ayarlamak için) bölgeleri' veya eşdeğer işlevleri kullanılan yazılım (Şekil 1D) görüntüye ablasyon, 'saat serisi (2 döngüleri)' ile birlikte 'Bleaching' işlevi gerçekleştirir.
  10. (Önce ablasyon) ilk görüntü ve zaman serisi ikinci resimde (sonra ablasyon) karşılaştırarak döngüsü, beyazlatma, floresan (Şekil 2B) arka plan düzeyinde gözlenen için hedeflenen hücreleri azalır, sonra emin.
  11. Floresans ablasyon sonra hala varsa, yineleme sayısını artırmak.
  12. Daha sonra odak düzlemi biraz daha derin (yani, ventral yan doğru) hareket ve nerede un ablated hücreleri görünür sonraki odak düzlemi seçin.
  13. Ağartma işlevi (yukarıda adım 1.9) açıklandığı gibi yapar. İlgi sinirsel yapısındaki tüm hücreleri ablated kadar bu adımları yineleyin.
  14. Ablated için sinirsel yapıları kapsayan tüm odak uçaklar gittikten sonra kaldırıldı floresan için hücreleri denetleyin. Bazı hücreler hala nedeniyle yetersiz ablasyon floresan olmak bulunursa, lazer-onları tekrar açıklandığı gibi ışınlatayım.
  15. Larva özel lazer ile sonra kurtarılan gerekiyorsa, bu larva zarar verebilir çünkü dışında özel güç çalışmayın. Bunun yerine, dikkatle özel larva çevresinde küçük kesim dik onun vücut yüzeyine yapın. Daha sonra anestezik etkisi geçiyor zaman özel dışında kendi yüzmeyi larva için bekleyin.
  16. Ablasyon için sonraki larva geçin veya denetim başka bir nüfus davranış soruşturma altında ilişki kurmadan nöronların kullanarak deneyler yapmak.
    Not: Burada, kontrol, UAS:EGFP nöronlarda olfaktör ampul olarak; gSAIzGFFM119B larva lazer ablated-(Şekil 2A, sağ) açıklanan aynı iletişim kuralını kullanarak.
  17. Birkaç saat veya Ca görüntüleme (Bölüm 2) veya davranış kayıt (Bölüm 3) devam etmeden önce kurtarma için 1 gün izin. Bu kurtarma sırada, larva sağlık (yani, normal spontan yüzme, ablated alan, vbetrafında belirgin hiçbir ısı hasarı) denetleyin ve herhangi bir kötü sağlık belirtileri gösteren larva kaldırın.

2. kalsiyum görüntüleme Pretetto ablated zebra balığı larva av uyarılmış nöronal etkinliklerini kaydetmek için

  1. Kayıt odası hazırlamak için güvenli-mühür hibridizasyon odası conta yapıştırıcı yüzü cama bakacak şekilde bir cam slayt üzerinde koymak ve en iyi mühür kaldırın.
    Not: Bu 9 mm jant çapında ve derinlik (Şekil 3A) 0.8 mm bir küçük kayıt odası oluşturur.
  2. Daha sonra bir naylon mesh yerleştirin (açılış boyutu: 32 µm) kesip alt var bir 50 mL tüp üzerinde. Kap kafes Tube (Şekil 3B) bağlamak için kullanın.
  3. Paramecia (av larva için görsel uyarıcı kullanılacak olan) hazırlayın.
    Not: Terliksi Hayvan Kültür (adım 2.3.1 ve 2.3.2) hazırlamak önceden.
    1. Paramecia tohum kültür ticari kaynakları veya akademik biyo-kaynak merkezleri24 önceden alabilirsiniz.
    2. Kültür autoclaved pirinç saman ve Pelet kuru bira mayası22 (Şekil 3C) içeren suda birkaç gün Terliksi Hayvan .
    3. Terliksi Hayvan kültür 2 elekler gittikçe dökün (150 µm diyafram ile bir başka bir 75 µm diyafram ile tarafından takip) enkaz kültür kaldırmak için.
    4. Paramecia akışı aracılığıyla önceki adımda bir naylon mesh (13-µm diyafram) toplamak.
    5. Paramecia bir sıkmak şişe sistemi su (Şekil 3D) kullanarak bir cam kabı içine naylon mesh üzerinde yeniden askıya alma.
  4. Kafes (Şekil 3B) (Şekil 3E) x 2 sistem suda yıkayın.
    Not: Bu adımın amacı da çalışmanın amacı gözlemlemek için görsel olarak nöronal aktivite tahrik olduğu gibi herhangi bir olası odorants ve Terliksi Hayvan kültür ortamı, içerdiği tastants kaldırmaktır.
  5. Zebra balığı larva tricaine çözüm anestezi için yerleştirin.
  6. Tek bir larva iken % 2 düşük erime noktası özel olarak bağlayın.
    1. İlk olarak, % 2 düşük erime noktası özel mikrodalga ve 1/10 birim konsantre tricaine x 10 için özel ekleme.
    2. Tricaine içeren özel bir damla kayıt odası (Şekil 3A) yerleştirin.
    3. Onayladıktan sonra özel çok sıcak değil, (Kimden adım 2.5) imzalat larva özel yüzeyi hafif bombeli görünüyor ki hemen aşırı herhangi bir özel kaldırma özel yerleştirin.
    4. Hızlı bir şekilde larva dik bir diseksiyon iğnesi (Şekil 1C) gelecek şekilde yönlendirin.
      Not: Bu yordamları özel katılaşır önce birkaç saniye içinde tamamlanmalıdır.
    5. Larva şekilde alacak biçimde yerleştirildiğinden, 5 min için tamamen kuvvetlendirmek özel izin verme. Sonra bir damla 1 x tricaine çözüm özel dökün.
  7. Zebra balığı larva başının etrafında özel kaldırmak ve cerrahi bir bıçak kullanarak yüzmeyi Terliksi Hayvan için yer açın. Bunu yapmak için ilk olarak, özel (Şekil 3F) içinde bir kaç küçük kesim yapmak. Sonra yavaşça odası üzerinde sistem su dökerek aşırı özel dikkatli bir şekilde çıkarın.
    Not: Bu adımda, tricaine yıkanması.
  8. Daha sonra bir amip görsel bir uyarıcı hizmet için kayıt odasında koymak.
    Not: Terliksi Hayvan zebra balığı larva Başkanı yüzer zaman nöronal yanıt (Şekil 3G) uyandırmak.
  9. Kayıt odası bir epi-floresan mikroskop altında bir bilimsel CMOS Kamera (Şekil 3H) ile donatılmış ve bir 2.5 X objektif lens (Şekil 3ben) seçin.
  10. GCaMP floresan sinyallerini hızlandırılmış kayıtları toplamak.
    1. Donanımlı kamera görüntü satın alma uygulamasını başlatın.
    2. "Sıra bölmesi" ve "Sabit Disk kaydı" üstünde belgili tanımlık cam seçin. Tarama ayarları bölümünde, "çerçeve istenen sayısı" 900 ya da herhangi bir diğer toplam çerçeve numarasına ayarlayın.
      Not: Varsa, bir modül ile hızlandırılmış kayıt yazılımı kullanır (burada, "Sabit Disk kayıt") sağlayan bir sabit disk üzerine veri verimli kaydetme.
    3. "Yakalama" Bölmesi'nde, pozlama süresi 2 x 30-ms (yani, 33,3 fps) ve Binning 2 olarak ayarlamak.
    4. GCaMP benzer uyarma/emisyon spectra GFP için olduğu gibi dokunmatik panel kontrol mikroskobunun GFP için ayarla bir filtre seçin.
    5. "Live" içinde belgili tanımlık fotoğraf makinesi görünümünü ve odak (Şekil 4A), larva bulun ve sonra "Live durdurmak"'ı tıklatın ve "Başlat" düğmesine tıklayın için yakalama Bölmesi'ni tıklatın. Film .cxd veya satın alma durumu ile ilgili bilgiler başka bir biçimde kaydedin.
  11. Sonra kayıtları, hızlandırılmış film Fiji25özgür yazılım kullanarak beyin yapısında ayarlayın yatırım getirisi için Ortalama piksel değerlerini elde ederek GCaMP6s floresan sinyallerini (Ca sinyalleri) analiz.
    Not: Fiji olduğunu birçok yararlı tapa-içinde ile a yorum-in ImageJ'ın önceden yüklenmiş ve .cxd biçimi görüntü dosyaları ile Bio-oluşum-ebilmek okumak eklentisi.
  12. Larva biraz kayıt sırasında taşırsanız, Fiji'de TurboReg eklenti26 çalıştırarak görüntü kaydı gerçekleştirmek. Menüden, 'Eklentiler', 'Kayıt' ve 'TurboReg' seçin.
  13. Nasıl çalışma amacı göre verileri çözümlemek için göz önünde bulundurun. Bir örnek aşağıdadır.
    1. F/F0 (floresan yoğunluğu tarafından floresan yoğunluğu istirahat veya herhangi bir Ca geçici gerçekleştirilmeden önce bölünmüş her zaman) aşağıdaki gibi hesaplar:
    2. Ayarla ROIs Pretetto veya ROI Yöneticisi'ni kullanarak ILH: menüde, "Analiz"Araçlar,""ROI Yöneticisi"," seçin ve "Ekle" (Şekil 4A) ROIs listesinde.
    3. ROIs için Ortalama piksel değerlerini hesaplamak (i.e., floresans yoğunluklarını GCaMP6s in) ROI Yöneticisi panelde seçerek: "Daha fazla," "Çok ölçü" ve "Tamam." Sonuçları bir elektronik tablo dosyası olarak kaydedin.
    4. Sinyalleri gürültülü olarak, sinyalleri 11 saat-elektronik tablo verilerini işleyen bir Web uygulaması kullanarak puan (hareketli ortalama) için Ortalama.
    5. F (zamanla yoğunluklarda floresan) F0 tarafından bölmek (floresan yoğunluğu bazal düzeyinde) normalleştirilmiş floresan yoğunluğu hesaplamak için. Veri görselleştirme, örneği değiştikçe normalleştirilmiş GCaMP6s floresan yoğunluğu Pretetto ve ILH renk kodlu ve Terliksi Hayvan yörüngeler (Şekil 4B - D) eşleştirilmiş.

3. lazer ablasyon aşağıdaki davranış sonuçları değerlendirilmesi

  1. Bir video kamera ile donatılmış bir stereoscope oluşan bir davranış kayıt sistemi ayarlayın. Bir fotoğraf makinesi bir uygun görüntü alma yazılımı ile ticari veya özel yapım (Şekil 5A) kullanın.
  2. Aydınlatma koşulu Terliksi Hayvan görüntü işleme tarafından tespit edilebilir en iyi duruma. Örneğin, bir yüzük beyaz LED ışık bir ile (Şekil 5B) kullanılmalıdır.
    Not: Mesafe ve açısını, LED örnek (yani, karanlık arka planda parlak veya parlak arka planda karanlık) ve vardır, bu nedenle, başarılı görüntü işleme için kritik görünümünü etkiler. Rondela (Şekil 5C) en iyi yüksekliğini belirler.
  3. (Bölüm 1'de açıklanan lazer ablasyon deneme kurtarılan) bir zebra balığı larva (hangi bir cam slayt için bağlı olduğu) bir davranış kayıt odası kaldırıldı orijinal en iyi mühür ile (Şekil 5D) yerleştirin.
  4. 50 paramecia Kültür (adım 2.3.5) toplamak bir micropipette kullanarak ve kayıt odasına koyun.
  5. Bir kapak notu kayıt odası üstüne yerleştirin. Küçük bir damla su ile ilgili kapak formu hava odasında tanıtımı önlemek için kayıt odası su yüzeyinde yerleştirmeden önce koymak.
    Not: Bu adımda, biraz su paramecia ile kayıt odasından taşma. Paramecia kayıt odasında kalan sayısı yaklaşık 30-40 olacak.
  6. (Bir larva ve parameciaiçeren) kayıt odası aydınlatma sistemi (Şekil 5D) yerleştirin.
  7. 11 dk (6600 çerçeveler) için 10 kare/sn, hızlandırılmış kaydını Başlat seçimini yapın.
  8. (İsteğe bağlı) Davranış için test edildi her larva için lazer ablasyon (yani, devamsızlık veya önemli ölçüde azaltılmış sayısı, floresan hücreleri etkinliğini doğrulamak için floresan mikroskopi tarafından lazer ablated alanlarda floresans gözlemlemek Lazer ışınlanmış alan).
    Not: Işınlama sonra bile, floresan bazı hücreler hala daha sonra Gal4 gen ekspresyonu ablasyon27sonra Ayrıştırılan hücrelerdeki başlangıçlı nedeniyle görülebilmektedir.
  9. Larva'nın davranışı, tekdüzelik arka planda eksikliği telafi etmek için kaydettikten sonra her kare piksel piksel bölünmesi Fiji ortalama bir görüntü yerine getirilir: 'Süreç 'Görüntü hesap makinesi',' tıklayın ' işlemi: bölmek ', ' 32-bit (float) sonuç ', ve ' Tamam '. Ortalama bir resim yapmak, 'Resim', 'Yığar', 'Z-projesi', 'Ortalama yoğunluğu' ve 'OK' (Şekil 5E, F)'ı tıklatın.
  10. Paramecia sayısı 'Analiz 'Parçacıklar analiz',' ı tıklatarak odasında yaptı sayısı tüm paramecia, kapsayan bir alan aralığı ayarını 'Gösteri: maskeler' onay kutusunu kontrol ve 'Tamam' tıklatın. 'Show: maskeler' seçeneği ayıklanan paramecia görüntüyle (Şekil 5G), parçacıklar (paramecia) her kare sayısı listesini sağlar.
  11. Paramecia sol kayıt odasında sayısı zaman içinde arsa. Paramecia sayısı tahminleri gürültülü olduğu için hareketli ortalama 600 kare (1 dk) elektronik tablo bir aralıktaki her noktasında yapmak tavsiye.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Belirli nöronlar genetik olarak EGFP ya da GCaMP6s Ifade Gal4 satırlarında tahrik, etiketlenmiş. Gal4 hattı gSAIzGFFM119B bir çekirdek pretectal alanında (magnocellular yüzeysel pretectal çekirdeği), hem de bir subpopulation olfaktör ampul nöronların etiketlemek için kullanıldı. Başka bir Gal4 satır, hspGFFDMC76A, ILH etiketlemek için kullanıldı. Biz lazer-pretectal nöronlar bilateral ablated (resim 2A sol paneli) ve aynı zamanda nöronların o...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İki fotonlu lazer özellikle bireysel nöronlar ablate için mükemmel bir uzaysal çözünürlük olmasına rağmen ısı nedeniyle beyin dokusu üzerinde istenmeyen herhangi bir zarar vermemek için çok dikkatli alınmalıdır. Ablasyon deney konusunda en önemli adım lazer ile en uygun miktarda tespit etmektir. Yetersiz ışınlama nöronlar öldürmek başarısız olur. Çok fazla ışınlama istenmeyen etkileri neden olur çevreleyen doku ısı-hasar olacak. Lazer ile (ROIs, yinelemeler ve tarama hızı alanları) optimum aralığı dar gibi görünüyor. Bir...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar raporlanacak hiçbir çıkar çatışması var.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmalar MEXT, JSP'ler KAKENHI Grant numaraları JP25290009, JP25650120, JP17K07494 ve JP17H05984 alınan hibe tarafından finanse edilmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
NuSieve GTG AgarozLonzaCat.#50080düşük erime sıcaklıklı agaroz
6 cm petri kabıFALCONÜrün#:351007
diseksiyon iğnesiAS ONE CorporationCat. No. 2-013-01https://keystone-lab.com/en/item/detail/404142
LSM7MPCarl Zeissiki fotonlu lazer tarama mikroskobu
W Plan-Apochromat 63x/1.0Carl Zeiss63X objektif lens
Imager.Z1Carl Zeissbir epi-floresan mikroskobu
ZENCarl ZeissKonfokal mikroskoplar için görüntü elde etme yazılımı
Güvenli Contalı Hibridizasyon Odası Contası, 8 odacıklı, 9 mm çap x 0,8 mm derinlikMoleküler ProblarKatalog # S-24732Ca görüntülemede kayıt odası olarak kullanılır
Görüntüleme OdalarıGrace Bio-LabsCoverWell Görüntüleme Odaları PCI-A-2.5Davranışsal kayıt odası olarak kullanılır
cerrahi bıçakMANIOftalmik bıçak MST15
ORCA-Flash4.0Hamamatsu Photonicsmodeli: C11440-22CUbilimsel bir CMOS kamera
HCImageHamamatsu Photonicsgörüntü acuisition yazılımı
Sabit Disk Kayıt modülüHamamatsu PhotonicsFilm dosyalarını kısa sürede bir sabit disk sürücüsüne kaydetmeyi sağlayan bir yazılım modülü
SZX7Olympusstereoskop
DF PL 0.5XOlympusSZX7
Point Grey Grasshopper3 4.1 MP Mono USB3 VisioFLIR Systems, Inc.Ürün No. GS3-U3-41C6NIR-CCMOS kamera
XIMEA xiQ kameraXIMEAÜrün No. MQ042RG-CMCMOS kamera
bir halka LED ışıkCCSModel: LDR2-100SW2-LABeyaz LED
Naylon örgü 32 ve mikro; mTokyo EkranN-No.380Thttp://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/
Naylon örgü 13 ve mikro; mTokyo EkranN-No. 508T-Khttp://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/
Metal seive 150 mikron diyafram açıklığıTokyo Ekranhttp://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami
Metal seive 75 mikron diyafram açıklığıTokyo Ekranhttp://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami
EBIOSAsahi Gıda & Sağlık Hizmetleri, Ltd. Şti.kuru bira mayası
LabVIEWNational InstrumentsPhysics'i programlamak için entegre bir geliştirme ortamı
 iki fotonlu lazer 
için objektif lens, Mai-Tai HP Spectra

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Feierstein, C. E., Portugues, R., Orger, M. B. Seeing the whole picture: A comprehensive imaging approach to functional mapping of circuits in behaving zebrafish. Neuroscience. 296, 26-38 (2015).
  2. Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nat Biotechnol. 19 (2), 137-141 (2001).
  3. Muto, A., et al. Genetic visualization with an improved GCaMP calcium indicator reveals spatiotemporal activation of the spinal motor neurons in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (13), 5425-5430 (2011).
  4. Lorent, K., Liu, K. S., Fetcho, J. R., Granato, M. The zebrafish space cadet gene controls axonal pathfinding of neurons that modulate fast turning movements. Development. 128 (11), 2131-2142 (2001).
  5. Asakawa, K., et al. Genetic dissection of neural circuits by Tol2 transposon-mediated Gal4 gene and enhancer trapping in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (4), 1255-1260 (2008).
  6. Sternberg, J. R., et al. Optimization of a Neurotoxin to Investigate the Contribution of Excitatory Interneurons to Speed Modulation In Vivo. Curr Biol. , (2016).
  7. Arrenberg, A. B., Del Bene, F., Baier, H. Optical control of zebrafish behavior with halorhodopsin. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (42), 17968-17973 (2009).
  8. Orger, M. B., Kampff, A. R., Severi, K. E., Bollmann, J. H., Engert, F. Control of visually guided behavior by distinct populations of spinal projection neurons. Nat Neurosci. 11 (3), 327-333 (2008).
  9. Huang, K. H., Ahrens, M. B., Dunn, T. W., Engert, F. Spinal projection neurons control turning behaviors in zebrafish. Curr Biol. 23 (16), 1566-1573 (2013).
  10. Smear, M. C., et al. Vesicular glutamate transport at a central synapse limits the acuity of visual perception in zebrafish. Neuron. 53 (1), 65-77 (2007).
  11. Bianco, I. H., Engert, F. Visuomotor transformations underlying hunting behavior in zebrafish. Curr Biol. 25 (7), 831-846 (2015).
  12. Trivedi, C. A., Bollmann, J. H. Visually driven chaining of elementary swim patterns into a goal-directed motor sequence: a virtual reality study of zebrafish prey capture. Front Neural Circuits. 7, 86(2013).
  13. Jouary, A., Haudrechy, M., Candelier, R., Sumbre, G. A 2D virtual reality system for visual goal-driven navigation in zebrafish larvae. Sci Rep. 6, 34015(2016).
  14. Muto, A., Ohkura, M., Abe, G., Nakai, J., Kawakami, K. Real-time visualization of neuronal activity during perception. Curr Biol. 23 (4), 307-311 (2013).
  15. Del Bene, F., et al. Filtering of visual information in the tectum by an identified neural circuit. Science. 330 (6004), 669-673 (2010).
  16. Semmelhack, J. L., et al. A dedicated visual pathway for prey detection in larval zebrafish. Elife. 3, 04878(2014).
  17. Preuss, S. J., Trivedi, C. A., vom Berg-Maurer, C. M., Ryu, S., Bollmann, J. H. Classification of object size in retinotectal microcircuits. Curr Biol. 24 (20), 2376-2385 (2014).
  18. Romano, S. A., et al. Spontaneous Neuronal Network Dynamics Reveal Circuit's Functional Adaptations for Behavior. Neuron. 85 (5), 1070-1085 (2015).
  19. Barker, A. J., Baier, H. Sensorimotor decision making in the zebrafish tectum. Curr Biol. 25 (21), 2804-2814 (2015).
  20. Ewert, J. -P. Neuroethology: an Introduction to the Neurophysiological Fundamentals of Behavior. , Springer Verlag. (1980).
  21. Muto, A., et al. Activation of the hypothalamic feeding centre upon visual prey detection. Nat Commun. 8, 15029(2017).
  22. Muto, A., Kawakami, K. Calcium Imaging of Neuronal Activity in Free-Swimming Larval Zebrafish. Methods Mol Biol. 1451, 333-341 (2016).
  23. Westerfield, M. THE ZEBRAFISH BOOK, 5th Edition. , University of Oregon Press. (2007).
  24. National BioResource Project Paramecium. , Available from: http://nbrpcms.nig.ac.jp/paramecium/?lang=en (2017).
  25. Fiji. , Available from: https://fiji.sc (2017).
  26. Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Trans Image Process. 7 (1), 27-41 (1998).
  27. Mueller, T., Wullimann, M. F. BrdU-, neuroD (nrd)- and Hu-studies reveal unusual non-ventricular neurogenesis in the postembryonic zebrafish forebrain. Mech Dev. 117 (1-2), 123-135 (2002).
  28. Muto, A., et al. Forward genetic analysis of visual behavior in zebrafish. PLoS Genet. 1 (5), 66(2005).
  29. Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

ki Fotonlu Lazer AblasyonuN ronal Pop lasyon AblasyonuKalsiyum G r nt leme AnaliziDavran Kayd ZebrafishPretekto hipotalamik DevreZebrafish Larvas BeyniAv Yakalama DavranHipotalamusun nferior LobuEpifloresan MikroskopiZ Y n Edinimi

İlgili makaleler