Yöntem makalesi

Basit ve etkili yönetim ve küçük balıklar böbrek enjeksiyon kullanarak dolaşım sistemi içinde Microparticles görselleştirme

DOI:

10.3791/57491

⸱

17 Haziran 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Biology at Irkutsk State University, 2Institute of Biology at Karelian Research Centre of Russian Academy of Sciences, 3Baikal Research Centre, 4Institute of Materials Research and Engineering, Agency for Science, Technology, and Research (A*STAR), 5University of Oulu, Optoelectronics and Measurement Techniques Laboratory

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu makalede, floresan microparticles hızlı, minimal invaziv enjeksiyon circulatory system küçük balıklar ve balık kan microparticles in vivo görselleştirme içine prensipleri gösterilir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Canlı bir organizma içine mikro büyüklükteki parçacıkların yönetim sistemik damarlara görselleştirme, ilaç ve aşı teslim, transgenik hücreleri ve küçük optik sensörler implantasyonu için uygulanabilir. Ancak, biyolojik ve veteriner laboratuvarları çoğunlukla kullanılan, küçük hayvanların içine intravenöz microinjections çok zor ve eğitimli personel gerektirir. Burada, biz balık böbrek içine enjeksiyon tarafından microparticles giriş yetişkin zebra balığı (Danio rerio) dolaşım sistemi içine için sağlam ve verimli bir yöntem göstermek. Damarlara tanıtılan microparticles görselleştirmek için balık solungaçları basit bir intravital görüntüleme tekniği öneriyorum. Vivo zebra balığı kan pH kontrolü başarılı bir enjekte microencapsulated floresan kullanarak sonda, SNARF-1, açıklanan tekniği mümkün uygulamalarından birini göstermek için. Bu makalede pH duyarlı boya encapsulation ayrıntılı bir açıklamasını ve hızlı enjeksiyon prensipleri ve görselleştirme floresan sinyali VIVO içinde kayıt için elde edilen microcapsules gösterir. Enjeksiyon önerilen yöntemi düşük mortalite oranı ile karakterizedir (0-%20) ve yüksek verimlilik (% 70-90 başarı) ve yaygın olarak bulunan cihazlar kullanılıyor Enstitü kolaydır. Tüm açıklanan yordamları süs balıkları ve medaka gibi diğer küçük balık türleri üzerinde gerçekleştirilebilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikro büyüklükteki parçacıklar yönetim hayvan bir organizma içine ilaç ve aşı teslim1, damarlara görselleştirme2, transgenik hücre implantasyonu3ve küçük optik sensör implantasyon gibi alanlarda önemli bir görevdir 4 , 5. ancak, implantasyon yordam microscale parçacıklar halinde küçük Laboratuvar hayvanlarının damar sistemi için özellikle hassas Sucul organizmalar için zordur. Zebra balığı gibi popüler araştırma numuneler için bu tavsiye edilir bu yordamları açıklık video protokollerini kullanarak.

İntrakardiyak ve kapiller microinjections'microobjects dır zebra balığı kana eğitimli personel ve benzersiz mikrocerrahi özellikleri gerektirir. Daha önce bir retro-orbital el ile enjeksiyon3 tüm hücreleri yönetim için kolay ve etkili bir yöntem olarak önerilmiştir. Ancak, deneyim, göz kılcal ağ küçük alanı nedeniyle bu teknik üzerinden istenilen sonucu elde etmek için çok pratik alır.

Burada, biz güçlü ve verimli microparticle implantasyon dolaşım sistemi içine için bir yöntem yetişkin zebra balığı, böbrek dokusunun içine doğrudan el ile enjeksiyonla kılcal damar ve böbrek damarlarının açısından zengin olduğu açıklanmaktadır. Bu teknik zebra balığı böbrek6içine hücre transplantasyonu için video protokolünü dayanır ama travmatik ve zaman alıcı mikrocerrahi adımları elendi. Önerilen yöntem tarafından düşük mortalite ile karakterizedir (0-%20) ve yüksek verimlilik (% 70-90 başarı) ve yaygın olarak bulunan cihazlar kullanılıyor Enstitü kolaydır.

Hangi enjeksiyon kalite, sayısı bir kaba göreli değerlendirme doğrulanmasına izin verir (floresan veya renkli olmaları durumunda) implant microparticles gill kılcal damarlar içinde görselleştirme önerilen protokol önemli bir parçası olduğunu enjekte parçacıklar ve dolaşımdaki kandan doğrudan fizyolojik ölçümler için spektral sinyal algılama. Açıklanan tekniği olası uygulamaları bir örnek olarak, biz SNARF-1, ilk olarak önerilen Borvinskaya bir microencapsulated floresan sonda kullanarak zebra balığı kan pH vivo ölçümleri için protokol göstermek ve ark. 20175.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm deneysel yordamlar AB Direktifi 2010/63/AB hayvan deneyleri için uygun olarak yapılmıştır ve hayvan konularda araştırma komitesi, Enstitüsü biyoloji Irkutsk State Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.

1. Microcapsules imalatı

Not: bir floresan boya taşıyan Microcapsules ters şarj edilmiş polyelectrolytes7,8katman katman Meclisi kullanarak hazırlanır. Tüm yordamları oda sıcaklığında yapıldı.

  1. Gözenekli CaCO3 microcores floresan boya kapsayan sentezlemek için 2 mL (çoğu polimer bağlı floresan boya FITC-BSA gibi kullanılabilir) SNARF-1-dextran çözeltisi ~ 2 mg/mL konsantrasyonu 0.6 mL ile her biri 1 mol/L çözümleri CaCl2, mix ve Na2CO3 hızlı karıştırma altında.
    Not: floresan boyalar farklı hassasiyetleri photobleaching için dikkat; bir ışığa duyarlı floresan sonda (gibi SNARF-1) kullandıysanız, işleme ve depolama microparticles ile mümkün olduğunca az ışık olarak gerçekleştirilmelidir.
  2. Sonra 5-10 s ajitasyon, süspansiyon 2 mL microcentrifuge tüpler ve santrifüj 15 transfer 10.000-12.000 CaCO3 microcores cips için g, s.
  3. Süpernatant atmak, çekirdek ~ 2 mL deiyonize su ile yıkayın ve Pelet sallayarak resuspend.
  4. Toplamda üç kez Santrifüjü yıkama yordamı yineleyin. Son Santrifüjü sonra süpernatant atmak.
  5. Microcores onların toplama azaltmak için bir ultrasonik banyo 1 dk. için kuluçkaya.
    Dikkat: kulak kulaklık ile korumak unutmayın.
  6. İlk polimer katman şablonlar yatırmak için ~ 2 mL bir 4 mg/mL lik poly(allylamine hydrochloride) (PAH) 1 mol/L NaCl içinde çekirdek resuspend.
    1. Microcores ~ 5 dakika sürekli sallayarak ile çözüm unutmayın.
    2. 15 sonra Santrifüjü, s süpernatant ilişkisiz PAH ile atmak. Kapalı microcores en az 3 kez aracılığıyla birden çok Santrifüjü ve adımları yıkama deiyonize su ile yıkayın. Son Santrifüjü sonra süpernatant atmak.
    3. Microcores onların toplama azaltmak için bir ultrasonik banyo 1 dk. için kuluçkaya.
      Not: Uygulamalı floresan boya katyonik ise, poli (sodyum 4-styrenesulfonate) başlatma (PSS) ın 1 mol/L NaCl (bkz. Adım 1.7).
  7. 1.6 ~ 2 mL bir 4 mg/mL lik (Ayrıca 1 mol/L NaCl içeren) PSS ile ikinci polimer tabaka şablonlar yatırmak için adımları yineleyin.
  8. 12 polimer kat yatırmak için 1,6 ve 1.7 altı kez adımları yineleyin.
    Not: Bu uzun bir aradan (~ 12 saat veya daha fazla) almak için tavsiye edilmez çünkü CaCO3 microcores kapsama olmadan Li2 eğilimi ~ 3-5 kadar yordamdaki katmanları yatırılan. Not PSS kapsama microcores daha yüksek bir toplama neden olur ve uzun sessizlik (PLL-g-PEG) sadece PAH veya poli-L-lizin Polietilen glikol ile aşılı dıştaki katman olduğunda önerilir.
  9. Kapalı microcores 2 mg/ml PLL-g-PEG (~ 1 mL microtube başına) en az 2 h için kuluçkaya.
    1. Microcores sıralı Santrifüjü ve resuspension adımları üzerinden su ile yıkayın. Son Santrifüjü sonra süpernatant atmak.
  10. İçi boş microcapsules elde etmek için CaCO3 şablonlar 2 mL (pH 7.1 NaOH ile düzeltilmiş) 0,1 mol/L ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) çözeltisi ekleyerek kapalı microcores geçiyoruz.
    1. Microcapsules 45 s ve atma, kuluçka ~ 5 dk sonra santrifüj kapasitesi süpernatant EDTA ile.
    2. 1.10-1.10.1 adımları iki kez tekrarlayın.
  11. Microcapsules % 0,9 NaCl üç kez aracılığıyla birden çok Santrifüjü adımlar içinde 45 ile yıkayın s takip adımlar yıkayarak. Son Santrifüjü adımdan sonra süpernatant atmak.
    Not: Son microcapsule çözüm enjeksiyon için (örneğin ampisilin, 0.1 mg/mL ekleyerek) steril tutulmalıdır ve medya araştırma (izotonik ortam nötr pH ile) ile biyouyumlu olmalıdır.
  12. Bir hemasitometre bir floresan mikroskop altında hazırlanan microcapsules konsantrasyonu tahmin ediyoruz. Microcapsules resimleri bir dizi, çapı yüz microcapsules ImageJ9 veya eşdeğer yazılım kullanma hakkında ölçmek ve bir çubuk grafik kullanarak boyutu dağıtım araştırmak.
  13. Mağaza elde edilen karanlıkta prob kapsüllenir.
    Not: sonra birkaç yıkama steril % 0,9 NaCl, microcapsules ay 4 ° C'de depolanan Tam microcapsules depolama sırasında kurutma tavsiye edilmez.

2. Optik Kurulum ve kalibrasyon mikroenkapsüle SNARF-1'in hazırlanması

Not: Kaba pH ölçümleri mikroenkapsüle SNARF-1 ile floresan mikroskop7iki kanallarında görüntüleri kullanılarak yapılabilir, ancak tek kanallı floresan mikroskop fiber spektrometre için bağlı bu protokolü uygulandı.

  1. Floresan filtre uygulanan floresan boya özelliklerine göre floresan mikroskop için gerekli kümesi yerleştirin ve floresan lamba açmak.
    1. Kolu göz mercekleri için çekin.
      Uyarı: Aşırı ışık Spektrometre matris zarar verebilir. Böylece, spektrometre kullanılmadığında kolu "mercek" modunda olduğundan emin olun.
    2. Fiber optik bir ucunu Spektrometre ve bir kolimatör diğer ucunu bağlayın. Bağdaştırıcıları kullanarak, Kolimatör kamera tüpü odak veya floresan mikroskop diğer kullanılabilir bağlantı noktası ekleyin.
    3. Spektrometre üzerinde açın. Spektrometre denetim programını çalıştırıp Spektrometre ölçümleri için hazırlamak.
  2. Microcapsule toplu kalibrasyonunun ~ 5 µL microcapsule süspansiyon (~ 10 000 microcapsules µL deiyonize su başına), mikroskop slaytta yer ve karanlık bir yere (örneğin, bir termostat 35 ° c) içinde belgili tanımlık damla kuru.
    1. Microencapsulated SNARF-1 spektral özellikleri ayarlamak için bir dizi arabellekleri ~ 6-9 aralığındaki farklı pH değerleri kullanın. ~ 10 µL SNARF-1-dextran ile kurutulmuş microcapsules üzerine bir arabellek bırak ve bir coverslip ile kaplayın.
    2. Cam slayt mikroskop sahnesinde yerini. × 40 amacı istimal microcapsules bulun.
    3. Mikroskop kolu kamera bağlantı noktasına çevirin. Onların Floresans Spektrometre ile kayıt. Göz mercekleri başa kolu çevirin.
      Not: spektral sinyal çok arka plan düzeyinin sağlayın ve görüş alanı içinde microcapsules bir balonun içinde (daha düşük bir boyuta gerekirse geçiş yaparak) olmadığından emin olun. Aynı microcapsules uzun süreli aydınlatma kaçının. SNARF-1 için photobleaching duyarlıdır.
    4. 2.2.3 farklı microcapsules için 10 - 15 kez yineleyin.
  3. Floresan en yüksek oranları (örneğin, R veya Scilab kullanarak) hesaplamak için tüm kayıtlı spectra ve medyan oranı (için her arabellek) ve aşağıdaki formülü kullanarak orta pH arasındaki regresyon çizgisini belirler:
    figure-protocol-1
    Not: SNARF-1 ile iki doruklarına protonated ve deprotonated boya emisyon için karşılık gelen bir spektrum vardır ve tepeler arasındaki oran orta pH cevap veriyor. Bu çalışmada, 605 ve 660 nm floresan yoğunluğu arasındaki oranı kullanılır. Bu dalga boyu kullanılan filtre kümesini bağlı olarak seçilir. a ve b (örneğin, R kullanarak) doğrusal olmayan regresyon belirlenecek katsayıları vardır. 0,15 ve 1.1 değerlerdir, sırasıyla, minimum ve maksimum değerlerini ben605/i660 kalibrasyon sırasında gözlenen.
  4. Balık kan yaklaşık 10 µL yaklaşık 5 Yetişkin hayvanlardan toplamak. Yer balık Petri kabına 1 µL/mL ile içine su karanfil yağı anestezi için süspansiyon ve hayvan yan döner ve fin pinch için yanıt vermiyor kadar bekleyin (genellikle ~ 2-3 dk). Balık bir cam slayt üzerinde aktarın. Balık kuyruğu lanset ile kesti ve kuyruk damar yaklaşık 2 µL balık kan toplamak.
    Not: kan pıhtılaşma önlemek için heparin (5000 U/mL) ile belgili tanımlık kesme tedavi ve heparinized cam kılcal damarlar ve microcentrifuge tüpler kan toplamak için kullanın.
    1. Yaklaşık 10 µL kan elektrot ucunu üzerine bir pipet ile damla ve pH pH-metre kullanarak belirleyebilirsiniz.
    2. Kan kurutulmuş microcapsules ile bir slayt üzerine bırakın ve kalibrasyon arabelleklerini (adım 2.2 2.3) açıklandığı gibi floresan yoğunluğu oranı kayıt.
  5. Eğri (için daha fazla ayrıntı bkz: Borvinskaya ve ark. 20175) balık kanı ölçümlerde maç yapmak için kalibrasyon eğrisi doğrusal katsayısı ayarlayın.

3. hazırlık enjeksiyon için

  1. Çelik iğne ucu keskin lanset ile plastik kaldırarak insülin kalem (veya şırınga) yayın.
    Not: Herhangi bir ince iğne (Ø0.33 mm veya daha az) veya cam kılcal (genellikle Ø1 mm) mikroenjeksiyon10,11için hazırlıklı ol.
  2. İğneyi yarıya kadar cam microcapillary yerleştirin; hızlı ve yavaş bir gaz meşale kullanarak lehim.
  3. Cam microcapillary için microinjector bağlamak ve üç kez steril su ile yıkayın. Sıvı iğne akar emin olun.
  4. Sistem distile su ile doldurun.
    Not: sistemde hava kabarcığı yok olduğundan emin olun.

4. enjeksiyon

  1. Microcapsules hazırlanan süspansiyon resuspend (steril % 0.9 NaCl veya diğer medya kullanılan 0.5 ila 6 milyon microcapsules microliter başına bir konsantrasyon ile enjeksiyonlar için) için 1 dk ultrasonik banyo kullanarak.
    Not: microcapsules, aşağıdaki enjeksiyon sırasında çökelti eğilimindedir bu yana şişeyi microcapsules ile mekanik sallamak (bir rotor kullanarak) veya el ile her birkaç dakikada onları resuspend ve onların toplama önlemek için.
  2. ~ 2-3 için bir petri anestezi (0.1 mL/L karanfil yağı suya askıya) ile içine balık yer dk. kadar bekleyin balık yan döner ve fin hafif bir tutam yanıt vermiyor.
  3. Bir kaşık kullanarak, anestezi çıkmış balık aktarmak ve yavaşça (sağ elini kullanan kişi için) sola doğru veya (sol elli kişi için) sağa doğru kafa ile yanal bir konumda nemli bir sünger üzerine yerleştirin.
  4. Sadece enjeksiyon önce 1-2 mm cam kılcal damar içine hava microinjector ile bağlı emmek. O zaman, dağınık microcapsules yaklaşık 2 µL ile yük.
    Not: enjeksiyon önce microcapsule çözüm hangi balık tutulur sıcaklık ayarlanması gerekir.
  5. Yavaşça sigara dominant el ile sünger balık gövdesini stabilize etmek.
    1. Sonradan içini kaplamak balık bulmak. Zihinsel genişleten bir kesimi operculum karın boşluğu sonuna kadar seçer. Bu segmentteki ortasını bulmak. İğne 1 mm daha düşük ventral yönde koymak.
    2. Kazıma bir hareketi, yavaşça balık bir kenara ölçekler ve bir delik yapmak hareket. Tablo yüzeye 45 ° açılı ve vücuda iğne yerleştirin.
    3. Dikkatli bir şekilde buna karşı aittir kadar iğne omurga doğru itin.
    4. Microcapsules süspansiyon yaklaşık 1 µL böbrek bırakın ve yavaş yavaş iğne tutar.
      Not: uygun delik site bulmak için daha kolay, pratik Şekil 2A ve 2B'yigösterildiği gibi bir alt ışık kullanarak balıklar transilluminating tarafından gövde böbrek bulmak için yararlıdır.
  6. Enjeksiyon yerinde dökülmüş herhangi bir microcapsules kaldırmak için su akışı ile kuyruk başından balık durulayın.

5. içinde Vivo görselleştirme

  1. Balık baştan gill kapağını çıkarın ve balık solungaçları denude için diseksiyon makası kullanın. Solungaçları su ile durulayın.
  2. Bir kaşık kullanarak, balık mikroskop slayda aktarmak ve floresan mikroskop sahnesinde yerini.
    Not: balık solungaçları ardışık işlemler sırasında kurumasına olduğunu emin olun. Bunu önlemek için düzenli olarak onları nemlendirin su Pasteur pipet (yaklaşık her 1-2 dk) kullanarak.
  3. Odayı karartmak ve düşük büyütme (x 10 amaç) kullanarak floresan microcapsules bulmak için solungaçları inceleyin.
    Not: balık dolaşım sistemi içine bazı floresan parçacıkların giriş için yordam kullanıldığında, solungaçları, birkaç bireylerin enjeksiyonları önce beklenmedik floresan parçacıklar için incelemek için önerilir. Vahşi-türü zebra balığı solungaçları autofluorescence yok ama bazı durumlarda sporadik floresan parçacıklar (gıda parçaları veya tek hücreli simbiont) solungaçları üzerinde mevcut olabilir. Gerekli, bu tür parçacıklar belirli şekilleri göre kabul edilebilir eğer (örneğin, gıda adet düzensiz şekli, küresel microcapsules aksine var) veya floresan spektrum (Yani, renk).
    1. Objektifin daha yüksek bir büyüklük (× 40 amaç) geçin ve bir microcapsule veya microcapsules bir grup görüş alanı ortasına yerleştirin.
    2. Yandaki bağlantı noktasına bağlı bir Spektrometre ile açmak. Spektral sinyal kaydedebilir.
    3. Mercek için geri kolu çevirin.
    4. Ölçümler için farklı microcapsules birkaç kere tekrar edin.
  4. Balık akvaryum kurtarma için uygun havalandırma ile aktarın.
    Not: en az uygulama ile enjeksiyon ve 2-3 dk balık başına yaklaşık bir oranda kayıt sinyal yapmak mümkündür. Ölçüm bir bireysel birkaç kez anestezi tekrarlanan zararsız, düşük doz veya başka bir yöntemi fiksasyon kullanımı ile tekrar edilebilir. Uzun vadeli gözlem için bir sistem ile sürekli anestezi12kullanın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Elde edilen sonuçları sunulan Protokolü üç ana kategoride birinden gelir: bir floresan boya (Şekil 1), microcapsules daha fazla görselleştirme ile böbrek enjeksiyon encapsulation tarafından floresan microparticles oluşumu Gill kılcal damarlar (Şekil 2 ve 3) ve pH seviyeleri (Şekil 4) kan son olarak, in vivo spektral kayıt SNARF-1 floresans izlemek için.

...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Microparticles enjeksiyon zebra balığı böbrek içine göstermek için yarı geçirgen microcapsules bir göstergesi boya ile yüklenen kullanılmıştır. Böylece, iletişim kuralı kullanarak katman katman derleme ters şarj edilmiş polyelectrolytes7,8,15,16,17 microcapsules imalatı için yönergeler içerir ,18 (Şekil ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar büyük ölçüde Bogdan Osadchiy ve Evgenii Protasov (Irkutsk State University, Rusya) yardımıyla video Protokolü hazırlanmasında kabul etmiş oluyorsunuz. Bu araştırma için temel araştırma (#15-29-01003) Rus Bilim Vakfı (#15-14-10008) ve Rus Vakfı tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
SNARF-1-dekstran, 70000 MWThermo Fisher ScientificD3304Floresan probu. Mikrokapsül dolgu maddesi olarak başka herhangi bir uygun polimere bağlı floresan boya
Albümin-floresein izotiyosiyanat konjugatı (FITC-BSA)SIGMAA9771Floresan probu
Rhodamine B izotiyosiyanat-Dekstran (RITC-dekstran)SIGMAR9379Floresan probu
Kalsiyum klorürSIGMAC1016CaCO3 şablon oluşumu
Sodyum karbonatSIGMAS7795CaCO3 şablon oluşumu
Poli(alilamin hidroklorür), MW 50000 (PAH)SIGMA283215Katyonik polimer
Poli(sodyum 4-stirensülfonat), MW 70000 (PSS)SIGMA243051Anyonik polimer
Poli-L-lizin [20 kDa] polietilen glikol [5 kDa], g = 3.0 ila 4.5 (PLL-g-PEG)SuSoSPLL(20)- g[3.5]-PEG(5)Mikrokapsüllerin biyouyumluluğunu artırmak için nihai polimer
Sodyum klorürSIGMAS8776Uygulanan polimerleri çözmek için
Su Arıtma SistemiMilliporeSIMSV0000Deiyonize su hazırlamak için
CaCO3 şablon oluşumu
Eppendorf  Araştırma  artı pipet, 1000 ve mikro; LEppendorfDozaj çözümleri
Eppendorf  Araştırma  artı pipet, 10 & LEppendorfDozajlama çözeltileri
Pipet uçları, hacim aralığı 200 ila 1000 & mikro; LF.L. Medical28093Dozaj çözeltileri
Pipet uçları, hacim aralığı 0.1-10  μ LEppendorfZ640069Dozaj çözümleri
Mini-santrifüj Microspin 12, Yüksek hızlıBioSanMikrokapsül santrifüjleme-yıkama prosedürü için
Mikrosantrifüj tüpleri, 2 mLEppendorfZ666513Mikrokapsül sentezi ve depolanması
Çalkalayıcı Intelli-karıştırıcı RM-1LELMY Ltd.Mikrokapsül agregasyonunu azaltmak için
Ultrasonik temizleyiciMikrokapsül agregasyonunu azaltmak için
Kafa telefonları Kulakları ultrasondan korumak için
Etilendiamintetraasetik asitSIGMAEDSCaCO3 şablonlarını çözmek için
Monosodyum fosfatSIGMAS9638pH tamponlarının hazırlanması
Disodyum fosfatSIGMAS9390pH tamponlarının hazırlanması
Sodyum hidroksitSIGMAS8045EDTA çözeltisinin ve tamponlarının pH'ını ayarlamak için
: Termostat odasıMikrokapsülleri cam slayt üzerinde kurutmak için
, Hemositometre, kan hücresi sayım odasıHazırlanan mikrokapsüllerin boyut, dağılım ve konsantrasyonunu araştırmak
için: Floresan mikroskop, Mikmed 2LOMOBalık kanındaki
mikrokapsüllerin in vivo görselleştirilmesiSNARF-1 için floresan filtre seti (mikroskop modeline bağlı olarak seçilmelidir; örnek verilmiştir)Chroma79010Floresan problarla mikrokapsüllerin görselleştirilmesi
Fiber spektrometresi QE ProOkyanus OptiğiMikrokapsüllerin mikroskop altında kalibrasyonu
Fiber optik QP400-2-VIS NIR, 400 μ m, 2 mOkyanus OptiğiSpektrometreyi mikroskop portuna bağlamak için
Kolimatör F280SMA-AThorlabsSpektrometreyi mikroskop portuna bağlamak için
Cam mikroskop slaytıFisherbrand12-550-A3Mikroskop altında mikrokapsüllerin kalibrasyonu
Lameller, 22 x 22 mmPearlMS-SLIDCVMikrokapsüllerin mikroskop
altında kalibrasyonuCam mikro kılcal damarlar Intra MARK, 10 & mikro; LBlaubrandBR708709Balık kanı toplamak için
Karanfil yağıSIGMAC8392Balık anestezisi
Lancet No 11Apexmed international BVP00588Balık kuyruğunu kesmek ve insülin otoenjektörü
Heparin, 5000 U/mLCalbiochemL6510-BCBalık kanı alımı sırasında balık kanı ile temas eden tüm yüzeyleri tedavi etmek için
Seven 2 Go Pro pH-metre mikroelektrotluMettler ToledoBalık kanı pH'ını belirlemek için
İnsülin kalemi iğneleri Micro-Fine Plus, 0.25 x 5 mmBecton, Dickinson and CompanyEnjeksiyon işlemi için. Herhangi bir ince iğne (Ø 0,33 mm veya daha az) uygundur
Cam kılcal damarlar, 1 x 75 mmHirschmann Laborgerä te GmbH & Co9201075Enjeksiyon prosedürü için
Gaz meşalesiÇelik iğneyi cam kılcal damara lehimlemek
Mikroenjektör IM-9BNARISHIGEMikrokapsüllerin hassas dozlanması için süspansiyon
Petri kapları, 60 mm x 15 mm, polistirenSIGMAP5481Anestezi altında balıklarla yapılan manipülasyonlar için
Plastik kaşıkAnestezi altında balıklarla yapılan manipülasyonlar için
Nemli süngerAnestezi altında balıklarla yapılan manipülasyonlar için
Diseksiyon makasıThermo Scientific31212Solungaç kapağını balık kafasından çıkarmak için
Pasteur pipeti, 3,5 mLMARKAZ331767Balık solungaçlarını nemlendirmek için
kullanılabilir için manyetik karıştırıcı Stegler : , , için

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rivas-Aravena, A., Sandino, A. M., Spencer, E. Nanoparticles and microparticles of polymers and polysaccharides to administer fish vaccines. Biol. Res. 46 (4), 407-419 (2013).
  2. Yashchenok, A. M., Jose, J., Trochet, P., Sukhorukov, G. B., Gorin, D. A. Multifunctional polyelectrolyte microcapsules as a contrast agent for photoacoustic imaging in blood. J. Biophotonics. 9 (8), 792-799 (2016).
  3. Pugach, E. K., Li, P., White, R., Zon, L. Retro-orbital injection in adult zebrafish. J. Vis. Exp. (34), e1645(2009).
  4. Gurkov, A., Shchapova, Е, Bedulina, D., Baduev, B., Borvinskaya, E., Timofeyev, M. Remote in vivo stress assessment of aquatic animals with microencapsulated biomarkers for environmental monitoring. Sci. Rep. 6, e36427(2016).
  5. Borvinskaya, E., Gurkov, A., Shchapova, E., Baduev, B., Shatilina, Z., Sadovoy, A., et al. Parallel in vivo monitoring of pH in gill capillaries and muscles of fishes using microencapsulated biomarkers. Biol. Open. 6 (5), 673-677 (2017).
  6. Diep, C. Q., Davidson, A. J. Transplantation of cells directly into the kidney of adult zebrafish. J. Vis. Exp. (51), e2725(2011).
  7. Kreft, O., Javier, A. M., Sukhorukov, G. B., Parak, W. J. Polymer microcapsules as mobile local pH-sensors. J. Mater. Chem. 17 (42), 4471-4476 (2007).
  8. Sadovoy, A., Teh, C., Korzh, V., Escobar, M., Meglinski, I. Microencapsulated bio-markers for assessment of stress conditions in aquatic organisms in vivo. Laser Phys. Lett. 9 (7), 542-546 (2012).
  9. Ferreira, T., Rasband, W. S. ImageJ User Guide - Version 1.44. , imagej.nih.gov/ij/docs/guide/ (2012).
  10. Poland, R. S., Bull, C., Syed, W. A., Bowers, M. S. Rodent brain microinjection to study molecular substrates of motivated behavior. J. Vis. Exp. (103), e53018(2015).
  11. Liu, L., Duff, K. A technique for serial collection of cerebrospinal fluid from the cisterna magna in mouse. J. Vis. Exp. (21), e960(2008).
  12. Johnston, L., Ball, R. E., Acuff, S., Gaudet, J., Sornborger, A., Lauderdale, J. D. Electrophysiological recording in the brain of intact adult zebrafish. J. Vis. Exp. (81), e51065(2013).
  13. Gerlach, G. F., Schrader, L. N., Wingert, R. A. Dissection of the adult zebrafish kidney. J. Vis. Exp. (54), e2839(2011).
  14. McKee, R. A., Wingert, R. A. Zebrafish renal pathology: Emerging models of acute kidney injury. Curr Pathobiol Rep. 3 (2), 171-181 (2015).
  15. Donath, E., Sukhorukov, G. B., Caruso, F., Davi, S. A., Möhwald, H. Novel hollow polymer shells by colloid-templated assembly of polyelectrolytes. Angew. Chem. Int. Ed. 37 (17), 2201-2205 (1998).
  16. Antipov, A. A., Shchukin, D., Fedutik, Y., Petrov, A. I., Sukhorukov, G. B., Möhwald, H. Carbonate microparticles for hollow polyelectrolyte capsules fabrication. Colloids Surf. A. 224, 175-183 (2003).
  17. Gaponik, N., Radtchenko, I. L., Gerstenberger, M. R., Fedutik, Y. A., Sukhorukov, G. B., Rogach, A. L. Labeling of biocompatible polymer microcapsules with near-infrared emitting nanocrystals. Nano Lett. 3 (3), 369-372 (2003).
  18. Volodkin, D. V., Larionova, N. I., Sukhorukov, G. B. Protein encapsulation via porous CaCO3 microparticles templating. Biomacromolecules. 5 (5), 1962-1972 (2004).
  19. Tzaneva, V., Perry, S. F. A Time differential staining technique coupled with full bilateral gill denervation to study ionocytes in fish. J. Vis. Exp. (97), e52548(2015).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Microparticle InjectionFish KidneyIntravital ImagingMicrocapsule PreparationFluorescent ProbeBlood pH MonitoringZebrafish Circulatory SystemLayer by Layer EncapsulationGill VisualizationSpectral Analysis

İlgili makaleler