Yöntem makalesi

İnsan nazal epitel hücre pulcuklarının nesil bireyselleştirilmiş Kistik fibrozis transmembran gürültülerinden regülatör çalışma için

DOI:

10.3791/57492

⸱

11 Nisan 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Division of Pulmonary Medicine, Cincinnati Children's Hospital Medical Center

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada insan nazal epitel hücreleri kültürleri üç boyutlu küresel oluşturmak için bir yöntem açıklanmaktadır. Pulcuklarının sonra sürücüye Kistik fibrozis transmembran gürültülerinden regülatörü (CFTR) teşvik-bağımlı iyon ve CFTR işlevi için bir proxy gibi küresel luminal boyutunda değişiklik miktarının sıvı salgılanması.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kistik fibrozis transmembran gürültülerinden regülatörü (CFTR) modülatör ilaçlar getirilmesi bakım Kistik fibrozis (CF) devrim yarattı iken, genotip yönetmen terapi modeli şu anda kullanımda olan bazı sınırlamaları vardır. İlk, nadir veya çöküşünde mutasyon grupları kesin klinik hariç tutulur. Ayrıca, ek modülatör uyuşturucu pazara girerken, modülatör seçimler tek bir özne için optimize etmek zor olacak. Her iki bu sorunların CFTR işlevi ve modülasyon hasta kaynaklı, bireyselleştirilmiş preklinik modeli sistemlerinin kullanımı ile ele alınmaktadır. İnsan nazal epitel hücreleri (HNEs) böyle bir model için solunum doku kolayca erişilebilir bir kaynaktır. Burada, CFTR işlevi ve modülasyon birincil HNEs kullanarak bir üç boyutlu küresel model nesil açıklar. HNEs minimal invaziv bir moda, koşullu programlama koşullarında genişletilmiş ve küresel kültürün içine seribaşı bireylerde etkilenmezsiniz. Tohum 2 hafta içinde küresel kültürler 3' ile 5'-siklik adenozin monofosfattır (kampı) uyarılmış HNE pulcuklarının oluşturmak-agonistler CFTR iþlevini etkinleþtirmek için üretiliyor. Küresel şişlik ardından CFTR etkinliği bir proxy olarak sayılabilir. HNE pulcuklarının hastalık morbidite ve mortalite yansıtan bir epitel ilgili bir erişilebilir, kişiselleştirilmiş modeli oluşturmak için burun hücreleri minimal invaziv, henüz solunum kökeni yararlanmak. Hava-sıvı arayüzey HNE kültürler için karşılaştırıldığında, pulcuklarının hangi genel kirlenme oranı azaltır olgun, nispeten hızlı olan. Bu doku edinme göreli kolaylığı ile dengeleniyor olsa mevcut haliyle modeli düşük işlem hacmi ile sınırlıdır. HNE pulcuklarının güvenilir bir şekilde ölçmek ve CFTR etkinlik bireysel düzeyde karakterize etmek için kullanılabilir. Vivo uyuşturucu yanıt için bu miktar bağlamak için devam eden bir çalışma HNE pulcuklarının CFTR modülasyon hasta yanıt bir gerçek preklinik tahmin olup olmadığını belirler.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kistik fibroz (CF) 70.000 kişi dünya çapında1etkileyen ölümcül bir otozomal resesif hastalik var. Bu hayat-kısalma genetik hastalığı Kistik fibrozis transmembran gürültülerinden regülatör protein (CFTR)2mutasyonların neden olur. CFTR gastrointestinal sistem, ter bezi de dahil olmak üzere birden çok polarize epiteli apikal zarı arasında klorür ve bikarbonat hareketi sağlayan iyon kanalı olarak adenozin trifosfat-bağlayıcı kaset aile ve işlevleri üyesi olan, ve solunum ağaç, diğerleri arasında3,4. Bu nedenle, işlevsiz CFTR çoklu sistem epitel disfonksiyon, solunum hastalıkları1den kaynaklanan çoğu mortalite ile yol açar. CF akciğerde hava yolu CFTR tahrik yüzey sıvı (ASL) yönetmelik ve mukus yayın yol açar kalınlaşmış mukus, hava yolu obstrüksiyonu, kronik enfeksiyon ve ilerici hava yolu remodeling kaybı ve akciğer işlev1,5kaybı.

Hastalığın nedeni olarak CFTR disfonksiyon kimlik rağmen CF tedaviler geleneksel belirtileri (örneğin, pankreas enzim replasman tedavisi, hava yolu geçiş izni terapiler)1azaltma üzerinde duruldu. Bu yaklaşım son zamanlarda roman therapeutics, "doğrudan hedef işlevsiz CFTR CFTR modülatörler," olarak adlandırdığı advent tarafından devrim. Bu yaklaşım belirti yönetimi'nden hastalığı değiştirme için klinik manzara kaymıştır bakım ama birkaç sınırlamalar6,7,8,9,10taşır. Modülatör her CFTR mutasyon eşlik eden protein kusur için özel ve genetik nüfus11seçmek için sınırlı bir faaliyettir. Bu sınırlama protein kusurların türdeş olmayan doğası gereği, aynı zamanda nadir mutasyon gruplar klinik çalışmalar impracticality tarafından tahrik edilmektedir. Buna ek olarak, iyi okudu genotip (örneğin, F508del/F508del CFTR, en yaygın CFTR mutasyon), ile konular arasında işte geniş değişkenlik hastalık yükü ve modülatör yanıt6,7',8 ,9,11.

Her iki bu sorunların üstesinden gelmek için müfettişler preklinik test12kişiselleştirilmiş modelleri kullanılmasını önerdi. Bu kavram vivo içinde konu terapiler kişiselleştirilmiş bir moda öngörmede hastaya özgü doku bileşik sınama, bir bireyselleştirilmiş ex vivo modeli sistemi oluşturmak için kullanır. Bir kez doğrulanmış, böyle bir model sürücü hassas tedavi hastanın altta yatan CFTR genotip ne olursa olsun klinisyenler tarafından kullanılabilir.

İnsan bronş epitel (HBE) hücreleri explant dokudan akciğer nakli zamanda elde edilen böyle bir model için CF13,14olasılığı kurdu. Bir hava-sıvı arayüzü (ALI) yetiştirilen HBEs fonksiyonel CFTR miktar doğrudan electrophysiologic test veya aracılığıyla dolaylı olarak önlemler ASL homeostazı13,15için izin verir. Bu model yapılmış CFTR Biyoloji anlamak için kritik ve CFTR modülatörler16gelişiminde önemli bir sürücüydü. Ne yazık ki, HBE modelleri savunulabilir edinimi (akciğer nakli veya bronşiyal fırçalama) invaziv doğası ve örnekleri eksikliği nedeniyle kişiselleştirilmiş bir model olarak nadir mutasyonlar ya da hafif hastalığı olanlar için değildir. Tersine, bağırsak dokusu, rektal veya duodenal biyopsi örnekleri elde edilen bağırsak geçerli ölçüm (ICM) veya şişme tabanlı organoid tahlil için bireyselleştirilmiş CFTR işlevi17,18, eğitim için kullanılabilir 19. Organoid deneyleri, özellikle, CFTR etkinlik20,21,22çok hassas modelleri vardır. Her iki modelde sınırlı doku kaynak (bağırsak dokusu, çoğu hastalık patoloji solunum olmakla birlikte) ve satın alma yarı invaziv yöntem. Alternatif olarak, çeşitli araştırmacılar insan nazal epitel (HNE) hücreleri modeli CFTR restorasyon23,24,25inceledik. HNEs güvenli bir şekilde fırça veya kürtaj bireylerde her yaştan tarafından hasat edilebilir ve ALI, kültürlü zaman HBEs25,26,27,28birçok özellikleri özetlemek. HNE monolayer kültürlerin geleneksel olarak Skuamöz dönüştürme ve olgunluk29için uzun bir süre ile sınırlı. Ayrıca, rapor kısa devre geçerli ölçüm sonuçları HNEs daha fazla HBEs, terapötik etkinlik25algılamak için küçük bir pencere düşündüren olan daha küçük.

Kişiselleştirilmiş, non-invaziv, solunum doku kültürü manken CFTR işlevinin ihtiyacını göz önüne alındığında, bir şişme tabanlı organoid tahlil duyarlılık HNEs non-invaziv ve solunum doğası ile birleştirmek çalıştı. Burada, HNEs 3 boyutlu "küresel" kültürleri bireyselleştirilmiş CFTR çalışma için tahlil şişme tabanlı30' u üreten bizim yöntemi açıklamak. HNE pulcuklarının güvenilir küre merkezi veya Lümen doğru epitelyal tepe ile kutuplaştırmak. Bu model çok sayıda alt solunum epitel özelliklerini recapitulates ve ALI kültürleri daha çabuk olgunlaşır. Fonksiyonel bir tahlil olarak HNE pulcuklarının güvenilir modülasyon iyi okudu mutasyon gruplar (örneğin, F508del CFTR) yanı sıra bir aralığı CFTR işlevi ölçmek. Bu şişme tabanlı tahlil CFTR su apikal tuz sızma aşağıdaki gibi dolaylı olarak küresel sıvı akını ölçme, iyon/tuz taşıma özellikleri üzerinde büyük harfe dönüştürür. Bu disfonksiyonel CFTR ile daha az şişer veya küçültmek bu şekilde uyarılmış pulcuklarının tamamen işlevsel CFTR ile sağlam, güzel. Bu görüntü analizi öncesi ile sayısal ve 1 h sonrası stimülasyon pulcuklarının, luminal alan ölçme ve yüzde belirleyerek değiştirebilirsiniz. Bu ölçü sonra uyuşturucu bioactivity bir hastaya özgü moda için ekran için deneysel grupları arasında karşılaştırılabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HNE örnekleri Cincinnati Çocuk Hastanesi Tıp Merkezi CF Araştırma Merkezi işe konulardan tedarik. Tüm yöntem tanımlamak burada kurumsal inceleme Kurulu (IRB) Cincinnati Çocuk Hastanesi Tıp Merkezi tarafından onaylanmıştır. Yazılı izni test önce tüm konulardan elde edildi.

1. genişleme medya ve antibiyotik ortam hazırlamak

  1. Tablo 1' de listelenen ortam bileşenleri toplamak. Oda sıcaklığında donmuş malzeme çözülme ve gerekli stok çözümler Tablo 1 "Genişleme medya" altında gösterildiği gibi olun.
    Not: toksik yutulur eğer ve bir cilt, göz ve solunum tahriş edici kolera toksin ele alırken dikkatli olun. Yapmak ve tüm çözümleri ve medya Biyogüvenlik kabini içinde temiz koşullar altında birleştirir.
  2. 50 mL gonore pipet kullanarak, kaldırmak ve diğer malzemelerin eklenmesi için telafi etmek için bir kapsayıcı üzerinden temel orta (Dulbecco modifiye kartal orta/F12) 50 mL atın. Tüm temel medya el ile bir autoclaved 1 L cam şişe içine dökün.
  3. 50 mL gonore pipet veya 1 mL pipet uygun şekilde kullanarak, tüm kalan bileşenleri Tablo 1 "Genişleme medya" bölümünden ortamı içeren autoclaved cam şişe içine aktarın. Hafifçe el ile karıştırmak için şişe girdap.
  4. Filtre medya içine taze, steril 1 L, 0,22 µm polyethersulfone (PES) flask üreticinin yönergeleri kullanarak filtre ve "Genişleme medya" ve tarihi ile ek açıklama ekleyebilirsiniz.
  5. Antibiyotik ortam hazırlamak. Tablo 1 "Antibiyotik kitle iletişim araçları" altında gösterildiği gibi gerekli antibiyotik hisse senedi çözümler olun
    1. 50 mL serolojik pipet kullanarak, genişleme medya 150 mL taze 250 mL autoclaved cam şişe için transfer.
    2. 1 mL pipet kullanarak ortamı içeren autoclaved cam şişe içine Tablo 1 "Antibiyotik medya" bölümünden tüm bileşenleri ekleyin. Girdap medya görünüm Tekdüzen olana el ile karıştırmak için.
    3. Medya bir taze, steril 250 mL, 0,22 µm PES filtre kabı üreticinin yönergelerini kullanarak filtre ve "Antibiyotik medya" ve tarihi ile ek açıklama ekleyebilirsiniz.
  6. Medya 4 ° C'de en fazla bir ay için bulutlu, kirlenme öne atarak saklayın.

2. farklılaşma ortam hazırlamak

  1. Tablo 2' de listelenen ortam bileşenleri toplamak. Oda sıcaklığında donmuş malzeme çözülme ve Tablo 2' de gösterildiği gibi gerekli stok çözümler olun.
    Not: üreme toksindir, retinoik asit ele alırken dikkatli olun yutulması halinde toksik olabilir ve cildi tahriş neden olur. Yapmak, aliquot ve tüm çözümleri ve medya Biyogüvenlik kabini içinde temiz koşullar altında birleştirir.
  2. Kaldırmak ve diğer malzemelerin eklenmesi için telafi etmek için bir konteyner temel ortamından 52 mL atın. Tüm temel medya bir autoclaved 1 L cam şişe içine dökün.
  3. 25 mL serolojik pipet veya 1 mL pipet uygun şekilde kullanarak, tüm kalan bileşenleri Tablo 2 ' den aktarım ortamı içeren autoclaved cam şişe ve hafifçe el ile karıştırmak için girdap.
  4. Filtre medya içine taze, steril 1 L, 0,22 µm polyethersulfone (PES) flask üreticinin yönergeleri kullanarak filtre ve "Farklılaşma medya" ve tarihi ile ek açıklama ekleyebilirsiniz.
  5. Medya 4 ° C'de en fazla bir ay için bulutlu, kirlenme öne atarak saklayın.

3. kat kültür yemekleri ve plakası besleyici fibroblastlar

Not: Biyogüvenlik kabini temiz koşullar altında tüm adımları gerçekleştirin.

  1. 0.5 mL kollajen stokunun ve 37,5 mL steril su 50 mL konik tüp içinde karıştırın.
  2. 4-5 mL kollajen çözeltisi her temiz P100 kültür yemeğin pipet tüm yüzeyi kaplı sağlanması.
  3. Yemekleri kapakları ile kapak ve gecede kuluçkaya 37 ° C ve % 5 CO2' de.
  4. Biyogüvenlik kabini, tüm tabak kapakları kaldırın. Eriyik-e doğru yemek kapak, sonra Aspire edin girdap.
  5. Ultraviyole (UV) ışık 1 h. yer kapakları bulaşıkları sırt üstünde, alüminyum folyo ile yığın ve kapak yemekler için maruz sterilize.
  6. Kaplamalı mağaza yemekler 4 ° C'de UV altında yeniden sterilizasyon için 3-6 ay, 15-30 dakika hücre kültür kullanmadan önce ışık.
  7. HNE örnek alma önce 24 saat önceden boyalı çanak ve etiket fare embriyonik Fibroblast (MEF) ve Tarih olarak sterilize et.
  8. Gonore pipet ile plaka (yaklaşık 5 mL) kapsayacak şekilde genişleme medya ekleyin.
  9. Tezcan 2 x 106 şişe MEFs bir 37 ° C waterbath radyasyona maruz. En kısa zamanda MEFs çözdürülen, yarım şişe (yaklaşık 106 hücreleri) el ile dağıtmak için dönen bir 1-mL pipet ile çanak ekleyin.
  10. 37 ° C ve % 5 CO2 HNE kültür için hazırlık gecede'de kuluçkaya.
    Not: gerekirse, adımları 3.7-3.10 olabilir kaplama hücreleri önce 60 dk kadar gerçekleştirilen gecede ideal olsa da.

4. elde etmek ve HNE örnek işlem

  1. IRB onaylı izni/onayı için tüm konular elde emin olun.
  2. Gevşek mukus temizlemek için hasta darbe burun var.
  3. Alt konka bir rhinoscope kullanarak görselleştirmek. Lezyonlar veya polip yok örnek toplama engel mevcut olduğundan emin olun.
  4. Burun hücreleri ilk burun deliği kürtaj ya da fırçalama tarafından toplanan.
    1. Kürtaj: Bend küret, hafif, ~ 135° açı ile apex küret Kupası uzak oluşturmak için onun orta nokta. Küret burun yerleştirin ve alt konka altında küret Kupası ilerlemek. Yavaşça küret Kupası karşı alt konka basın ve konka küret çekerek kazımak ileri, yinelenen toplam 3 - 4 kez okunmuş.
    2. Fırça: Sitoloji aşağı fırça konka, sonra Döndür ve burun çıkmadan biraz 4 - 5 kez, fırça girip hareket geçmek.
  5. Yer küret/fırça 15 ml konik antibiyotik medya ile dolu. Diğer burun küret/fırça aynı konik tüp içine yerleştirerek için adımları 4.3-4.4 yineleyin.
  6. Buz üzerinde işlem için hazır kadar konik saklayın. İşlem içinde 4 h örnek edinimi oluşur ancak 24 saat kadar satın alma sonra gerekirse meydana gelebilir emin olun.

5. süreç ve yemekleri hücrelerde HNE genişletin

Not: Biyogüvenlik kabini temiz koşullar altında tüm adımları gerçekleştirin.

  1. 1-mL pipet ve medya konik örnekten kullanarak, Curettes|/Sitoloji fırçaları aynı konik tüp içine kapalı tüm hücreleri yıkayın. Temiz bir kez, Curettes| atmak / fırçalar.
  2. 360 x g ve 5 min için 4 ° C, konik santrifüj kapasitesi.
  3. Hücre Pelet bozmamaya dikkat çekici Aspire edin süpernatant.
  4. Hücre Pelet 3 ml karışımı homojenize için 1 mL ucu ile pipetting hücre dekolmanı çözümün yeniden askıya alma.
  5. 360 x g ve 5 min için 4 ° C, konik santrifüj kapasitesi.
  6. 5.3-5.5 bir kez yineleyin.
  7. Hücre Pelet bozmamaya dikkat çekici süpernatant kalan Aspire edin.
  8. Pelet antibiyotik medya ve bir hemasitometre ile hücreleri hesaplama 1 ml yeniden askıya alma.
  9. 1-mL pipet kullanarak, hücreleri 3.10 adımda hazırlanan dropwise boyalı, fibroblast numaralı seribaşı çanak üzerine plaka. Tam olarak çanak kapağı ve hücre yüzeyi boyunca dağıtmak için antibiyotik medya ekleyin. Etiket içeriği ve tarihi ile yemek ve 37 ° C ve % 5 CO2kuluçkaya.
  10. 48 saat sonra hücreler kültür yemek için eklenen emin olun. Medya Aspire edin ve yeterince taze antibiyotik plaka kapsayacak şekilde ortamı ile değiştirin.
  11. Medya 3 değiştirmek bir vakum çizgi ve Pasteur pipet ile eski medya alıyorum ve plaka karşılamak için yeterli taze medya ile değiştirme haftalık, x. Antibiyotik medya 5 gün sonra üç kez haftalık yerine sürekli genişleme medyaya medya değiştirin.
    Not: Kontaminasyon riski kültür ilk haftasında yüksektir. Taze örnekler Çapraz bulaşma riskini en aza indirmek için ayrı bir kuluçka makinesine tutun.
  12. Birkaç kez haftalık hücre büyümesini kontrol edin. Bir kez hücreleri yaklaşık % 70-80 birleşmesi, geçiş hücreleri için devam edin.

6. geçiş HNE hücreleri

  1. %0,1 tripsin çözeltisi ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) hazırlayın.
    Not: bir deri, solunum sistemi, ve gözü tahriş edici tripsin işleme dikkatli olun.
    1. Tripsin domuz pankreas dan 15 mg konik bir tüp içinde ağırlık.
    2. EDTA 56 mg ayrı bir konik tüp tartın.
    3. Biyogüvenlik dolapta tripsin ve EDTA autoclaved 250 mL cam şişe içine aktarın. Steril fosfat tamponlu tuz (PBS) küçük bir aliquot tam transferi sağlamak için tripsin/EDTA tüpler durulama için kullanın.
    4. 150 mL için toplam çözüm getirmek için steril PBS ekleyin. Kapağı sıkıca kapatın.
    5. Tamamen eriyene kadar 37 ° C waterbath çözümünde tripsin kuluçkaya. Her 15 dakikada denetleyin ve derhal bir kez çözünmüş kaldırın.
      Not: tripsin çözüm Eğer çok uzun süre ısıtmalı denatüre gibi uzun bir süre (Örneğin, bir gecede), için denetlenmeyen terk etmeyin.
    6. 2-3 spreyler % 70 etanol ile şişe temiz ve Biyogüvenlik kabini dönmek.
    7. %0,1 tripsin-EDTA çözeltisi taze steril 250 mL, 0,22 µm PES filtre kabı üreticinin yönergelerini kullanarak filtre ve içeriği ve tarihi ile ek açıklama ekleyebilirsiniz.
    8. Tripsin-EDTA çözüm 4 ° C'de en fazla bir ay için Eğer bulutlu atarak saklayın.
  2. Farklılaşma medya, %0,1 tripsin-EDTA çözeltisi ve steril PBS oda sıcaklığında üzerinde 30 dk. temiz % 70 etanol ve temiz Biyogüvenlik kabini aktarmak ile getirmek.
  3. Biyogüvenlik kabini, Aspire edin ve doku kültürü çanak medyadan atmak için bir vakum hattı ve Pasteur pipet kullanın. Çanak ekleme, dönen ve 5 mL temiz serolojik pipet kullanarak PBS de alıyorum tarafından yıkayın.
  4. 5-mL serolojik pipet kullanarak doku kültürü yemek için 5 mL %0,1 tripsin-EDTA çözeltisi ekleyin ve 37 ° C ve % 5 CO2 kuluçka makinesi 5 min için geri dönün.
  5. 4-10 x ters bir mikroskop hücrelerdeyse görselleştirin. Hücreleri yemek ayırmak, yuvarlak hale ve yüzer kontrol edin. Yavaşça kültür çanağı hücreleri çıkarmak ve/veya en hücreleri müstakil kadar bir ek 5 min için yeniden kuluçkaya yan dokunun.
    Not: bir kez kültür çanak müstakil hücreleri hızlı bir şekilde kaldırmak için dikkatli; uzun süre maruz kalmak tripsin-EDTA zarar % 0,1 hücre canlılığı.
  6. 10 mL serolojik pipet kullanarak, yemek için genişleme medya 5 mL ekleyin ve tüm sıvı içeriği (Toplam 10 mL) etiketli, steril 50 mL konik tüp içine toplamak.
  7. Hücreleri kalırsa kültür çanak yapışık, 6.4 ile 6.6 iki kez, aynı konik tüp toplama içeriği için adımları yineleyin.
    1. Hücreleri kalırsa yapisan kültür çanak tripsin çözüm maruz kalma, üç tur kullandıktan sonra steril hücre kazıyıcı yavaşça çıkarın kalan. Çanak kazıma sonra kazıyıcı ve genişleme medya 5 mL ile çanak yıkama ve aynı etiketli konik tüp toplamak.
      Not: pulcuklarının için passaging fark trypsinization gerçekleştirmek için bu yordam değiştirin. Tripsin ekledikten sonra çözüm (adım 6.4.), ara çanak sık fibroblastlar (genellikle 1-2 dk) bağlantısız kadar yemek için bağlı sadece poligonal epitel hücreleri bırakarak. Toplamak ve bu hangi ileri genişleme için passaged süpernatant, kenara. 6.4-6,6 aynı tripsin çözüm kullanarak adımları yineleyin ve küresel kültür için yalnızca kalan epitel hücreleri toplamak.
  8. 360 x g 5 min ve 4 ° c için de konik santrifüj kapasitesi Konik medyadan Aspire edin.
  9. Hücre Pelet 1 mL genişleme medya ve sayısı hücreleri bir hemacytometer kullanarak resuspend.
  10. Bir kez sayılabilir, hücreleri gerekirse ayrılabilir ve ya pasajlı (fibroblast ortak kültür, adım 3, hazırlanması da dahil olmak üzere ve hücreler için genişleme, adımları 5,9-5.12 kaplama) yeni bir kültür tabak üzerine iletmek veya pulcuklarının (7. adım) kültürlü.
    Not: genişleme, 0.5-1 × 10 tohumlama yoğunluğu için yeni bir kültür yemek için passaging6 hücre P100 tabak içinde tavsiye edilir eğer.

7. tohum hücreleri HNE küresel kültürler için

Not: Santrifüjü, temiz Biyogüvenlik kabini dışında bu adımdaki tüm yordamları gerçekleştirmek.

  1. Membran matris üzerinde üreticinin talimatlarına (küresel iyi başına 100 µL) başına buz çözme.
    Not: steril 500 µL aliquots alış irsaliyesindeki membran matrisinin yapmayı düşünün; Bu miktar tek bir 4-şey plaka tohum.
  2. (Kimden adım 6,9) differentially trypsinized, pasajlı hücreleri matrisin mL başına 500.000 hücre son bir konsantrasyon için uygun sayıda ayırın. 4-şey plaka için 200.000 hücreler kullanın. Bir 1,5 mL tüp içinde toplamak.
  3. 360 x g 4 ° C'de 5 min için hücre ve medya karisimin santrifüj kapasitesi Tamamen, ama dikkatli bir şekilde Aspire edin ve hücre Pelet bozmamaya dikkat çekici bir 1 mL pipet kullanarak medya atın.
  4. 1 mL pipet ucu kullanarak, başına 100 µL hücreleri içeren 1,5 mL tüp membran matrisinin de planlanan ekleyin. Tüp buz üzerinde tutun.
  5. Yukarı ve aşağı için dikkatle pipet ve membran Matris hücrelerinde iyice resuspend. Katılaşma matrisin önlemek hızlı hareket. Tamamen hava kabarcıkları matris/hücre karışımı içine tanıtıldı değil emin olmak için pipet ucu boşalma kaçının.
  6. 100 µL matris aliquots 4-şey IVF kültür plaka her kuyuya tohum.
    1. Temiz bir makas çifti, bir 200 µL pipet ucu distal 3-4 mm gelene dek kırpın.
    2. Bölünen ucunu kullanarak, dikkatle 100 µL hücre/matris karışımı her şey ortasına pipet. Yavaş yavaş, her şey ortasında tek bir matris "damla" yapma amacı ile pipet. Açılan küresel kalmalıdır ve iyi tarafını dokunmamanız gerektiğini. Plaka taşıma sırasında bu Damlalar rahatsız edici önlemek için çok dikkatli yapmak.
    3. Membran matris damla 30 dk, 37 ° C ve % 5 CO2 katı kadar kuluçkaya.
    4. Dikkatle matrisi bırakma bozmamaya dikkat çekici 500 µL farklılaşma medya her kuyuya pipet. Bu matrisin bırakın ve daha eklemek gerekirse medya sadece kapak emin olun.

8. ayırt etmek ve HNE pulcuklarının Olgun

  1. 1 mL pipet ucu kullanarak, yavaşça tüm medya kuyudan Aspire edin; geride herhangi bir pulcuklarının canlı kalabilir ama pulcuklarının matrix, o kısmında yok edecek matris aspirating kaçının.
  2. Bir taze 1 mL pipet ucu kullanarak, yavaşça farklılaşma medya 500 µL matrix çevresinde de ekleyin. Pipet ile matris dokunmaya değil ve matrisi bırakma rahatsız edici kaçının.
  3. Pulcuklarının 37 oC, inkübatör ve devam eden büyüme için % 5 CO2 dönün. Haftalık üç 8.1 ile 8,3 arasındaki adımları yineleyin.
  4. Her gün 20 X ters bir mikroskop altında küresel Morfoloji değerlendirin. Pulcuklarının kaplama 3-5 gün içinde oluşturmak ve yaklaşık 10 gün içinde olgunluğa ulaşır.

9. pretreat, teşvik ve HNE pulcuklarının analiz için görüntü

  1. Pulcuklarının görüntüleme yukarıda açıklanan30olarak önce istediğiniz gibi pretreat.
    Not: VX809 ön için medya 48-72 saat önce görüntüleme için VX809 3 µM ekleyin. VX809 hisse senedi 1 µL 10 mm mix ( Malzeme tabloyabakın) medya bu konsantrasyon için 3,3 ml.
  2. Her değişim pulcuklarının 1 ml taze farklılaşma medya pulcuklarının Imaging önce Önarıtma (Adım 8.1-8.3) dahil olmak üzere, bir de.
  3. Taze stimülasyon uyuşturucu Çözümleri (Forskolin, 3-İzobütil-1-methylxanthine [IBMX], VX770 ve CFTR inhibitörü 172 [Inh172]) ( Malzeme tabloyabakın) hisse senetleri hazırlayın. Forskolin/IBMX için her stokunun 1 µL 98 µL 1,5 mL tüp etiketli tek bir steril su ekleyin. VX770 ve Inh172 için her stok 1 µL 99 µL ayrı etiketli 1,5 mL tüpler steril su ekleyin. Toplam hacim için her şey test çözüm 50 µL için izin ver. Biyogüvenlik kabini steril koşullarda çözümleri hazırlayın.
  4. Küresel plaka 37 ° C ve %5 CO2elektronik görüntü yakalama yazılımı ve XY ayarlama için mekanik bir sahne ile donatılmış bir ters mikroskobu monte, küme bir inkübe odası aktarın. Düşsel bilgisayar gibi mikroskop ve kamera üzerinde kapatmak.
  5. Bir iyi pulcuklarının temel çekim.
    1. Görüntü yakalama yazılımı (Slidebook 5.5 aşağıdaki yönergeleri için) açın. Bir kez başlatılan, "Dosya", sonra "Yeni"'ı tıklatarak yeni bir dosya açın. Buna göre dosya adı ve "Kaydet" i tıklayın.
    2. Dikkatle kültür plaka kapağı çıkarın ve bir matrisi bırakma hedefi Merkezi.
    3. Matrisi bırakma en üstünde başlayarak, bir tablo içinde mikroskop mercek ile 20 x büyütme pulcuklarının bulmak için hareket. Yukarı ve aşağı, en geniş noktasında küre yakalamaya odaklan. Her küresel görüntüleme sonra yeniden tanımlamak için matrisi bırakma haritasında konumunu açıklama ekleyin.
    4. Yazılım, "Görüntü yakalama"'ı tıklatın. Maruz kalma, "El ile" seçeneğini ve 50 Bayan girin diğer ayarları uygun olduğundan emin olun (depo gözü faktörü: 1 x 1, W: 512, H: 512, X ve Y konumu: 0). her görüntü için uygun bir ad (Örneğin, küresel 1 satır taban çizgisi) "Adı" kutusuna girin. "Canlı bir görüntü görüntüleme ve"temel görüntü yakalamak için kaydetme"" Başlat.
    5. Adımları 9.5.1-9.5.4 hedefe ulaştı veya tüm matrisi bırakma görüntüsü kadar yineleyin.
      Not: Grup farklılıkları gibi birkaç koşul başına 3-5 pulcuklarının olarak ile tespit edilebilir, ancak, bizim uygulama gücünü artırmak için koşul başına 10 veya daha fazla pulcuklarının görüntü haline gelmiştir. Tahlil değişkenliği Şekil 2 "Temsilcisi sonuçları" bölümü ile 8-10 pulcuklarının konu örnek olarak başına örnekleri gösterilmiştir.
  6. Pulcuklarının teşvik.
    1. 200 µL pipet kullanarak uygun stimülasyon uyuşturucu 50 µL matrix bozmamaya dikkat çekici şey, ortamlara içine ekleyin.
      Not: Bu 10 kat seyreltme (500 µL medya içine 50 µL) sonra son ilaç konsantrasyonu olacak: forskolin 10 µM, IBMX 100 µM, VX770 1 µM, Inh172 10 µM.
    2. Sadece kampı için tek forskolin/IBMX ekleyin.
    3. Kamp + VX770 için forskolin/IBMX ilk, sonra VX770 2 dk sonra ekleyin.
    4. Inhibe koşulları için Inh172 eklemek ilk o zaman forskolin/IBMX 2 dakika sonra.
  7. Hemen stimülasyon sonra yanında timelapse düşsel 1 h için şişme küresel monitör. Yazılım, "Görüntü yakalama"'ı tıklatın. "Timelapse" tıklatın ve Aralık 30 s, süre 60 dk. uygun bir ad girin ve "Kaydet" düğmesini tıklatın timelapse başlatmaya ayarla.
    Not: Standart timelapse her 30 tek bir küresel görüntülerini yakalamak etmektir bir yüksek kaliteli video sağlamak için s. Alternatif olarak, alt-büyütme yakalama tüm şey (Örneğin, 4 X) ve daha az yansıma istenirse yakalanan gerçekleştirin. Bir otomatik sahne kullanılır, önceden tanımlanmış koordinatları kullanarak tüm pulcuklarının timelapse gerçekleştirin; Aksi halde, bir alt kümesini pulcuklarının timelapse şişme nitel bir inceleme sağlamak ve sistematik hiçbir sorunları (Örneğin, kuyudan matris dekolmanı) görüntüleme sırasında ortaya emin olmak için kullanın.
  8. Hemen sonrası stimülasyon çekim (başına adım 9.5) tüm pulcuklarının, 1 h timelapse görüntü tamamlandığında, 9.5.3. adımda oluşturduğunuz harita kullanarak.
    1. Odak aynı uçak (hücre, pulcuklarının veya enkaz büyük ölçüde çevreleyen odak kalitesini kolaylaştırmak bu oluşum) takip görüntüleri için kullanılan emin olmak için ön stimülasyon resimlere bakın.
    2. Adım 9.5.4 (Örneğin, küresel 1 sonrası stimülasyon) eşleştirilmiş bir ek açıklama ile dosyaları kaydedin.
      Not: pulcuklarının şişmeye devam edebilir timelapse hemen sonra bu adımı tamamlayın.
  9. Görüntülü medyada de taze farklılaşma ortamı ile değiştirin.
  10. Her şey/koşul, stimülasyon uyuşturucu için deneysel koşullar belirtildiği şekilde ayarlama için adımları 9.5 9,9 aracılığıyla yineleyin.
  11. Tüm görüntüleme tamamlandığında pulcuklarının kuluçka 37 ° C ve % 5 CO2dönün.
    Not: inkübe mikroskop odası kısırlık bağlı olarak pulcuklarının sonrası stimülasyon kirlenme oldukça yaygın olabilir. Görüntülü pulcuklarının Çapraz bulaşma riskini en aza indirmek için ayrı bir kuluçka makinesine tutmak ya da hemen sonra görüntüleme pulcuklarının atmak.

10. HNE küresel görüntüleri analiz

  1. Tüm çekilen görüntü analiz yazılımı ile uyumlu bir biçimde dışa aktarın. Yazılım, ","İhracat", üzerine getirin" seçeneğini seçin ve "Varsayılan sayısı, tüm görüntüleri olarak TIFF..." seçin. Sabit sürücü veya çözümleme için a birden parlamak götürmek için kaydedin.
    Not: bir ticari analiz yazılım (Malzemeler tablo) ve .tiff dosyalarını iyi performans ve analiz kullanarak diğer platformları da gerçekleştirilebilir olsa burada, açıklanır. Dosyaları adlandırırken görüntüleri analiz personel deneysel koşullar için kör ama hangi görüntüleri (öncesi ve sonrası stimülasyon) eşdeğer analizi sağlamak için eşleştirilmiş farkında olmalıdır.
  2. Analiz yazılımı kullanarak, her küresel görüntünün luminal alanını betimlemek ve veri analiz yazılımı dışa aktarın.
    1. Açık analiz yazılımı. "Dosya", sonra "açık" ve küresel görüntüleri içeren dosya klasörüne gidin. Analiz için tüm görüntü seçin ve "Aç"'ı tıklatın.
    2. "Ölçü" tıklayın ve "Bölge ölçümleri" seçin. Bölge ölçümleri iletişim kutusunun içinde droptab "Yapılandırma" seçin ve "Görüntü adı" ve "Alan" kutuları işaretli olduğundan emin olun.
    3. "Log" tıkırtı ve seçme "Açık veri günlük". "Tamam" veri günlük diyalog kutusu ve adı dosya üzerinde buna göre (örneğin, koşul X, Tarih) tıklatın. Bu tüm ölçümler bir e-tabloya aktarır.
    4. "İzleme bölgesi" aracı düğmesini seçin ve dikkatle analiz için ilk resimdeki küresel Lümen iz. Bölge ölçüm diyalog kutusunda, "Günlük ölçüm içine çok iyi olmak oturum için veri"'ı tıklatın.
    5. Tüm pulcuklarının analiz edilir kadar adımları 10.2.2-10.2.4 yineleyin.
  3. Yüzde değiştirmek hesaplamak (100 * [Post-STIM - temel] ÷ satır taban çizgisi) her bireysel küresel için taban çizgisinden luminal alanda görüntü çifti ve analizleri için veri derlemek.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HNEs kültür yemek için eklemek ve 72 h tohum içindeki hücreleri küçük adaları oluştururlar; iyi ve kötü ada oluşumu, bir hafta örnekleri şekil 1A ve 1B, sırasıyla gösterilir. Bu adalar 15-30 gün boyunca yemek kapsayacak şekilde genişletmek gerekir. Küçük ya da suboptimal örnekleri daha uzun sürebilir ve genellikle yararlı pulcuklarının vermez. Kirlenme bulaşıcı ajanlar ile derin sarı/bulutlu medya tarafından başarısızlık hücrelerin kültür yem...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu iletişim kuralı burun hücre hasta kaynaklı küresel kültürler CFTR işlevi ve bireyselleştirilmiş bir belirli bir modelini üretmek mümkün nesil açıklar. Yakından zorluk önlemek için katıldı süreç içinde birkaç temel adım vardır. Önce bir güzel örnek hastanın burun değil. İyi bir örnek olmalıdır > 50.000 hücreleri, sınırlı mukus/enkaz ve içinde 4 h (başarı da buza nakliye gecede ile kolay ulaşılabilir olmasına rağmen) işlemek için hazır olun. Uygulama örnekleri küret veya fırça ile çalışma personeli tarafından alınıyor g...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu eser Kistik Fibrozis Vakfı Therapeutics tarafından desteklenen, sayı CLANCY14XX0 vermek ve Kistik Fibrozis Vakfı numarası CLANCY15R0 verin. Yazarlar Kristina Ray hasta işe alım ve yasal gözetim ona yardım için teşekkür etmek istiyorum. Yazarlar ayrıca HNE kültür yetenekleri nesilde destekli Kistik Fibrozis Vakfı tarafından desteklenen HNE çalışma grubu teşekkür etmek istiyorum: Preston Bratcher, Calvin pamuk, Martina Gentzsch, Elizabeth Joseloff, Michael Myerburg, Dave Nichols, Scott Randell, Steve Rowe, G. Marty Solomon ve Katherine Tuggle.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1.5 mL Eppendorf TüpABD Bilimsel 4036-3204
150 mL Filtre ŞişesiMidsci TP99150Medyayı filtrelemek için
15 mL Konik TüpMidsci 
1 L Filtre ŞişesiMidsci TP99950Ortamı filtrelemek için
35 mm Cam Tabanlı ÇanakMatTek CorporationP35G-0-20-COpsiyonel
3-İzobutil-1-Metilksantin (IBMX)Fisher Scientific AC228420010 1 mL DMSO'da 22.0 mg'lık 100 mM'lik bir stok çözeltisi hazırlayın
50 mL Konik TüpMidsci  
AccutaseYenilikçi Hücre Teknolojileri A.Ş.AT-104Hücre ayırma çözeltisi
AdeninSigma-AldrichA2786-25GTablo 1'e
Amfoterisin BSigma-AldrichA9528-100MGTablo 1'e
bakın Sığır Beyni Ekstresi (9mg / mL)Lonza CC-4098Bkz. Tablo 2
Seftazidim hidratSigma-AldrichC3809-1GBkz
. Tablo 1 Hücre Sıyırıcılar 20 cm Orta bilim 
CFTR Inh172Tocris Bioscience34304.0 mg'lık 10 mM stok çözeltisi hazırlayın
Sigma-AldrichC8052-.5MGTablo 1'e bakın
CYB-1Tıbbi Ambalaj ŞirketiCYB-1Sitoloji fırçası
Dimetil sülfoksit (DMSO)Sigma-AldrichD5879-500ML
Dulbecco'nun Modifiye Eagle Media (DMEM)/F12 Hepes Yaşam Teknolojileri 11330-057Temel Ortam; Bkz. Tablo 1 ve 2
Epidermal büyüme faktörü (Rekombinant insan proteini, hayvansal kökenli ücretsiz)Thermo Fisher ScientificPHG6045Tablo 1'e bakınız
EpinefrinSigma-AldrichE4250-1GTablo 2'ye bakınız
EthanolFisher Scientific 2701
EtanolaminSigma-AldrichE0135-500ML16.6 mM çözeltisi; Tablo 2'ye bakın
Etilendiamintetraasetik Asit (EDTA)TCI America E0084
Fetal Sığır Serumu (yüksek performanslı FBS)Invitrogen 10082147Tablo 1'e bakınız
ForskolinSigma-AldrichF6886-50içinde 4.1 mg'lık 10 mM stok çözeltisi hazırlayın
.356231Corning Matrigel Büyüme Faktörü Azaltılmış (GFR) bazal membran matrisi, fenol kırmızısı içermez, LDEV içermez, 10 mL.
HemacytometerHausser Scientific1483
İnsan Kollajen Solüsyonu, Tip I (VitroCol; 3 mg/mL)Advanced BioMatrix5007-AKollajen solüsyonu
HyClone (aka FetalClone II) GE Sağlık SH30066.03HIBkz. Tablo 2
Hidrokortizon Kök HücreTeknolojileri07904Bkz. Tablo 1 ve 2
İnsülin, insan rekombinant, çinko çözeltisiLife Technologies 125850144 mg / mL çözelti; bakınız Tablo 2
IVF 4 Kuyulu Çanak, İşlenmemişNUNC (Fisher Scientific aracılığıyla)12566350Sferoidler için 4 oyuklu plaka; 24 oyuklu bir plakaya benzer kuyu boyutu
MEF-CF1-IRRGlobalstemGSC-6001GIşınlanmış murin embriyonik fibroblastları
Metamorf 7.7Moleküler CihazlarAnaliz Yazılımı; https://www.moleculardevices.com/systems/metamorph-research-imaging/metamorph-microscopy-automation-and-image-analysis-software alıntı için
Olympus IX51 Ters MikroskopOlympus CorporationDurdurulanGörüntüleme Mikroskobu. Değiştirme: Olympus IX53, https://www.olympus-lifescience.com/pt/microscopes/inverted/ix53/  Teklif için
Pen StrepLife Technologies 15140122Bkz. Tablo 2
FsophoryletheanolamineSigma-AldrichP0503-5GBkz. Tablo 2
Retinoik AsitSigma-AldrichR2625-50MGBkz. Tablo 2
RhinoprobeArlington Scientific, Inc.96-0905Nazal küret
Slidebook 5.53i, Akıllı Görüntüleme Yenilikleri DurdurulanGörüntüleme Yazılımı. Değiştirme: Slayt Kitabı 6, bir teklif için https://www.intelligent-imaging.com/slidebook
Steril Fosfat Tamponlu Salin (PBS)Thermo Fisher Scientific20012050
Steril SuSigma-AldrichW3500-6X500ML
Doku Kültürü Kabı 100Tekno Plastik Ürünler93100Genişleme için doku kültürü kabı
TobramisinSigma-AldrichT4014-100MGTablo 1'e bakınız
Transferrin (İnsan Transferrin 0.5 mL)Lonza CC-4205Bkz. Tablo 2
TriiyodothryoninSigma-AldrichT6397-1G3,3&asal;,5-Triiyodo-L-tironin sodyum tuzu  [T3]; Tablo 2'ye bakınız
Domuz Pankreasından TripsinSigma-AldrichT4799-10G
Ultroser-GCrescent Chemical (Fisher Scientific aracılığıyla),20 mL lipofilize toz; Bkz. Tablo 2
Streptomyces orientalisSigma-AldrichV2002-5G'denTablo 1'e bakın
VX770Selleck ChemicalsS11440.4 mg'lık 1 mM stok çözeltisi hazırlayın
içinde 4.5 mg'lık 10 mM stok çözeltisi satın alın veya hazırlayın
; KAYA inhibitörü ve nbsp;Enzo Yaşam Bilimleri ALX-270-333-M025 Tablo 1'e bakın
TP91015TP91050 bakın TP99010 1 mL DMSO Kolera Toksin B'de (Vibrio cholerae'den) 1 mL DMSO Büyüme Faktörü Azaltılmış Matrigel Corning, Inc. : NC0393024, vankomisin hidroklorür 1 mL DMSO VX809 Selleck Chemicals S1565 içinde 1 mL DMSO Y-27632 Dihidroklorür

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rowe, S. M., Miller, S., Sorscher, E. J. Cystic fibrosis. N Engl J Med. 352 (19), 1992-2001 (2005).
  2. Rommens, J. M., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: chromosome walking and jumping. Science. 245 (4922), 1059-1065 (1989).
  3. Anderson, M. P., et al. Nucleoside triphosphates are required to open the CFTR chloride channel. Cell. 67 (4), 775-784 (1991).
  4. Boucher, R. C. Human airway ion transport. Part one. Am J Respir Crit Care Med. 150 (1), 271-281 (1994).
  5. Ehre, C., Ridley, C., Thornton, D. J. Cystic fibrosis: an inherited disease affecting mucin-producing organs. Int J Biochem Cell Biol. 52, 136-145 (2014).
  6. Accurso, F. J., et al. Effect of VX-770 in persons with cystic fibrosis and the G551D-CFTR mutation. N Engl J Med. 363 (21), 1991-2003 (2010).
  7. De Boeck, K., et al. Efficacy and safety of ivacaftor in patients with cystic fibrosis and a non-G551D gating mutation. J Cyst Fibros. 13 (6), 674-680 (2014).
  8. Moss, R. B., et al. Efficacy and safety of ivacaftor in patients with cystic fibrosis who have an Arg117His-CFTR mutation: a double-blind, randomised controlled trial. Lancet Respir Med. 3 (7), 524-533 (2015).
  9. Wainwright, C. E., et al. Lumacaftor-Ivacaftor in Patients with Cystic Fibrosis Homozygous for Phe508del CFTR. N Engl J Med. , (2015).
  10. Brewington, J. J., McPhail, G. L., Clancy, J. P. Lumacaftor alone and combined with ivacaftor: preclinical and clinical trial experience of F508del CFTR correction. Expert Rev Respir Med. 10 (1), 5-17 (2016).
  11. CFTR2 Database. , www.cftr2.org (2017).
  12. Mou, H., Brazauskas, K., Rajagopal, J. Personalized medicine for cystic fibrosis: establishing human model systems. Pediatr Pulmonol. 50 Suppl 40, S14-S23 (2015).
  13. Randell, S. H., Fulcher, M. L., O'Neal, W., Olsen, J. C. Primary epithelial cell models for cystic fibrosis research. Methods Mol Biol. 742, 285-310 (2011).
  14. Whitcutt, M. J., Adler, K. B., Wu, R. A biphasic chamber system for maintaining polarity of differentiation of cultured respiratory tract epithelial cells. In Vitro Cell Dev Biol. 24 (5), 420-428 (1988).
  15. Worthington, E. N., Tarran, R. Methods for ASL measurements and mucus transport rates in cell cultures. Methods Mol Biol. 742, 77-92 (2011).
  16. Van Goor, F., et al. Correction of the F508del-CFTR protein processing defect in vitro by the investigational drug VX-809. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (46), 18843-18848 (2011).
  17. Hug, M. J., Tummler, B. Intestinal current measurements to diagnose cystic fibrosis. J Cyst Fibros. 3 Suppl 2, 157-158 (2004).
  18. van Barneveld, A., Stanke, F., Ballmann, M., Naim, H. Y., Tummler, B. Ex vivo biochemical analysis of CFTR in human rectal biopsies. Biochim Biophys Acta. 1762 (4), 393-397 (2006).
  19. Dekkers, J. F., et al. A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids. Nat Med. 19 (7), 939-945 (2013).
  20. Dekkers, J. F., et al. Optimal correction of distinct CFTR folding mutants in rectal cystic fibrosis organoids. Eur Respir J. 48 (2), 451-458 (2016).
  21. Dekkers, R., et al. A bioassay using intestinal organoids to measure CFTR modulators in human plasma. J Cyst Fibros. 14 (2), 178-181 (2015).
  22. Zomer-van Ommen, D. D., et al. Limited premature termination codon suppression by read-through agents in cystic fibrosis intestinal organoids. J Cyst Fibros. , (2015).
  23. Bridges, M. A., Walker, D. C., Davidson, A. G. Cystic fibrosis and control nasal epithelial cells harvested by a brushing procedure. In Vitro Cell Dev Biol. 27a (9), 684-686 (1991).
  24. Di Lullo, A. M., et al. An "ex vivo model" contributing to the diagnosis and evaluation of new drugs in cystic fibrosis. Acta Otorhinolaryngol Ital. 37 (3), 207-213 (2017).
  25. Pranke, I. M., et al. Correction of CFTR function in nasal epithelial cells from cystic fibrosis patients predicts improvement of respiratory function by CFTR modulators. Sci Rep. 7 (1), 7375(2017).
  26. Devalia, J. L., Davies, R. J. Human nasal and bronchial epithelial cells in culture: an overview of their characteristics and function. Allergy Proc. 12 (2), 71-79 (1991).
  27. Devalia, J. L., Sapsford, R. J., Wells, C. W., Richman, P., Davies, R. J. Culture and comparison of human bronchial and nasal epithelial cells in vitro. Respir Med. 84 (4), 303-312 (1990).
  28. Thavagnanam, S., et al. Nasal epithelial cells can act as a physiological surrogate for paediatric asthma studies. PLoS One. 9 (1), e85802(2014).
  29. Jorissen, M., Van der Schueren, B., Van den Berghe, H., Cassiman, J. J. The preservation and regeneration of cilia on human nasal epithelial cells cultured in vitro. Arch Otorhinolaryngol. 246 (5), 308-314 (1989).
  30. Brewington, J. J., et al. Detection of CFTR function and modulation in primary human nasal cell spheroids. J Cyst Fibros. , (2017).
  31. Sun, H., et al. Tgf-beta downregulation of distinct chloride channels in cystic fibrosis-affected epithelia. PLoS One. 9 (9), e106842(2014).
  32. Boucher, R. C. Evidence for airway surface dehydration as the initiating event in CF airway disease. J Intern Med. 261 (1), 5-16 (2007).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

nsan Nazal Epitel H creleriCFTR Fonksiyon al masSferoid K lt r Olu turmaKo ullu Yeniden Programlama Ko ullarcAMP reten AgonistlerSferoid i me AnaliziDiferansiyasyon Medyumu nk basyonuBazal Membran MatrisiTers Mikroskop De erlendirmesiCFTR Mod lat r Testi

İlgili makaleler