Yöntem makalesi

İki boyutlu yarı denaturing deterjan özel Jel Elektroforez amiloid veya amiloid benzeri liflerin boyutu heterojen onaylamak için kullanımı

DOI:

10.3791/57498

⸱

26 Nisan 2018

 , 
1Department of Molecular Biology, UT Southwestern Medical Center

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada biz iki boyutlu yarı denaturing özel Jel Elektroforez amiloid benzeri lifler türdeş olmayan boyutta varlığını doğrulamak ve amiloid liflerinin ayrışma sırasında jel boyutu heterojenite kaynaklanmaktadır olasılığını dışlamak için kullanın koşma oluşum.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Amiloid Dil veya amiloid benzeri lifler birçok insan hastalıkları ile ilişkili olan ve şimdi birçok sinyal yolları için önemli olduğunu keşfetti edilmektedir. Kolayca bu elyaf çeşitli deneysel koşullarda oluşumu algılama yeteneğini potansiyel işlevleri anlamak için önemlidir. Pek çok yöntem lifler, algılamak için kullanılan ama bazı dezavantajları olmadan olmaz. Örneğin, elektron mikroskobu (EM) veya Kongo kırmızısı veya Thioflavin T ile sık sık boyama arıtma liflerinin gerektirir. Öte yandan, yarı denaturing deterjan özel Jel Elektroforez (SDD-yaş) hücre özleri arıtma olmadan SDS dayanıklı amiloid benzeri lifler algılanmasını sağlar. Buna ek olarak, boyut farkı liflerinin karşılaştırmasını sağlar. Daha da önemlisi, Western Blot tarafından spesifik proteinlerin lifler içinde tanımlamak için kullanılabilir. Daha az zaman alıcı ve labs daha geniş bir dizi için daha kolay erişilebilir. SDD-yaş sonuçları genellikle değişken heterojenite derecesini gösterir. Protein kompleksi SDS huzurunda Elektroforez sırasında ayrılma heterojenite parçası oluşur olup olmadığını sorusunu gündeme getiriyor. Bu nedenle, ikinci bir boyut SDD-ÇAĞINDA görülen boyutu heterojenite gerçekten fiber heterojenite vivo içinde bir sonucu ve bozulma ya da ayrılma sırasında proteinlerin bazı değil bir sonucu olup olmadığını belirlemek için SDD-Age istihdam Elektroforez. Bu yöntem, amiloid veya amiloid benzeri liflerin kısmen SDD-yaş işlemi sırasında dissociating değil hızlı, nitel onay sağlar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protein misfolding nedeniyle amiloid lifleri oluşumu, Alzheimer hastalığı, Parkinson hastalığı ve Huntington hastalığı1gibi patolojik koşullarda bir rol oynamaya uzun bilinmektedir. Daha yakın zamanlarda, amiloid veya amiloid benzeri liflerin oluşumu sinyal yolları insanlar Anti-yayılmacı doğuştan gelen bağışıklık yanıtı2 necroptosis3,ve4sırasında dahil olmak üzere ve daha düşük organizmalar bir parçası olmak için gösterilen Maya5,6gibi. Bu nedenle, bu elyaf laboratuarda algılama yeteneğini önemlidir. Şu anda, amiloid ve amiloid benzeri lifler algılamak için üç ana yolu vardır: Boyalar, EM ve SDD-yaş kullanımı.

Boya, Kongo kırmızısı veya Thioflavin T, gibi kullanımı hızlı ve kolayca detectable mikroskopi veya spektroskopisi7kullanarak olmanın avantajı sunuyor. Ancak, mikroskopi, Kongo kırmızısı, söz konusu olduğunda tarafından hangi proteinleri oluşturan lifler veya boyutu lifler, hiçbir özgüllük algılar. Benzer şekilde, Kongo kırmızısı veya Thioflavin T bağlayıcı protein kompleksleri için algılamak için spektroskopisi kullanımı yalnızca bir pozitif veya negatif sonuç sağlar.

EM lifleri ve aynı zamanda lif uzunluğu ve çapı8hakkında kantitatif bilgi varlığının kesin kanıt sağlar. Ancak, bu yöntem çok sıkı arıtma gerektirir. Ayrıca, EM pahalı ekipman kullanan bir özel bir tekniktir.

SDD-yaş SDS dayanıklı mega Dalton protein kompleksleri amiloid veya amiloid benzeri lifler de dahil olmak üzere tespit etmek için kullanılmıştır. Birçok avantaj sunar. İlk olarak, arıtma liflerinin gerektirmez ve peform9için kolaydır. İkinci olarak, göreli boyutu ve fiber heterogenicity miktarı dahil olmak üzere liflerinin boyutu hakkında Nitel bilgi sağlar. Western Blot Elektroforez sonra gerçekleştirilen çünkü son olarak, bu SDD-yaş yarı denaturing olduğu için bazı epitopları hangi gizli kalmasını unutulmamalıdır, ancak kendisi için herhangi bir proteinin bir antikor olduğunu var olup olmadığını belirlemek kolaydır algılama antikor tarafından olmak zordur.

Son zamanlarda, reseptör etkileşen protein kinaz 1 (RIPK1) ve 3 (RIPK3) bildirilmiştir formu amiloid lifleri için platformlar necroptosis sırasında nekroz3programlanmış bir tür sinyal olarak hizmet etmek için. Bu iplikler okurken, bizim laboratuvar lineage kinaz etki alanı gibi (MLKL), karışık başka bir necroptosis ilişkili protein de amiloid benzeri lifler4kurdu gösterdi. Ancak, SDD-yaş ile incelenmesi üzerine, MLKL lifleri boyutunu birbirlerine (şekil 1) aynı çıktı RIPK1 ve RIPK3 lifler farklı çıktı. MLKL necroptosis necrosome10denilen karmaşık sinyal oluşturmak için RIPK1/RIPK3 için bağlar tanınmış olduğundan bu beklenmedik bir şeydi.

En az iki açıklaması vardır. İlk olarak, iki tamamen farklı amiloid benzeri lifler necroptosis sırasında bir içeren RIPK1/RIPK3 ve diğer içeren MLKL şeklinde. İkinci olarak, tek bir içeren RIPK1/RIPK3/MLKL necroptosis ama MLKL ilişkilendirmesiyle diğer proteinler sırasında oluşmuş amiloid benzeri lifler zayıf yeterince SDD-yaş sırasında ayrışıp türüdür.

Bu sorunu çözmek için bir iki boyutlu (2D) SDD yaşından öneriyorum. SDD-yaş-kararlı amiloid veya amiloid benzeri lifler aynı geçiş desen birinci ve ikinci boyut Elektroforez sırasında olacaktır. Bu tespit bir membran proteinleri aktarma ve Western blot taşıma sonra olacak. İstikrarlı elyaf keskin köşegen desen sergileyecek. Bu herhangi bir sapma lifler SDS-Elektroforez nedeniyle değişiklikleri meydana öneririz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. hazırlayın örnekleri

  1. Kültür 2 x 106 amiloid HT-29 kolon kanser hücrelerinin 10 ml, Dulbecco'nın modifiye kartal orta (% 10 fetal sığır serum ve penisilin-streptomisin içeren DMEM) 10 cm doku kültürü tabak içinde üreten. Kültür hücreleri 37 ° C kuluçka %5 CO2gece.
    1. Sonra % 80 confluency için hücrelerin büyümesine, fosfat tamponlu tuz (PBS) 10 mL hücrelerle yıka. 3 mL tripsin çözeltisi ekleyin ve 3 dk 37 ° C'de kuluçkaya.
    2. Hücreleri yemek tamamen Disosiye sonra kültür orta 10 mL ekleyin ve 15 mL konik tüp 10 mL pipet hücrelerle aktarmak. Senaryo Özeti 3 dakika oda sıcaklığında 1000 x g santrifüj kapasitesi. Orta Aspire edin, 5 mL kültür ortamının hücrelerde resuspend ve bir hücre sayaç kullanarak hücreleri saymak. Her iki 10 cm tabak tabak 2 x 106 hücreler.
    3. Hücreleri uygun ve gecede 37 ° C kuluçka %5 CO2kurtarmak için izin verir. Amyloids 20 ng/mL tümör nekrozis faktör-alfa (TNF-α), 100 nM şaplak atmak mimetic ve 20 µM pan-caspase inhibitörü Z-VAD-FMK11ile oluşumu ikna etmek için bir yemek için tedavi uygulanır. Kasanın TSZ kısaltılır. Araç ile diğer çanak bir denetim olarak tedavi.
  2. Uygun süreyi sonra genellikle 6 h, lysate hücre hasat.
    1. Plastik bir sıyırıcı plaka kapalı hücre scrape ve 10 mL pipet 15 mL konik tüp içine aktarmak için kullanın. 1000 x g 4 ° C'de 3 dk de hücreleri santrifüj kapasitesi
    2. Hücreleri tarafından 10 mL buz soğuk PBS resuspending ve 1000 x g 4 ° C'de 3 dk de centrifuging 2 kez yıkamak PBS çözüm Aspire edin.
      Not: İşlemi burada hücre Pelet sıvı azot içinde dondurma ve ˗80 ° C ilâ 1 aylığına depolayarak duraklatılmış.
    3. Hücre Pelet 1.5 mL microcentrifuge tüp aktarmak ve buz üzerinde 30 dk için lizis arabellek 0.3 ml kuluçkaya. 4 ° C'de 15 dakika 20.000 x g, santrifüj Süpernatant lysate tüm cep telefonu var.
      Not: İşlemi burada örnek-20 ° C'de için birkaç ay kadar depolayarak duraklatılmış.
    4. Bir Bradford tahlil üreticisinin protokolüne göre tarafından protein konsantrasyonu ölçmek. 4 x 3 µg/µL örnek 20 µL hazırlamak ve 10 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya SDD-yaş yükleme arabellek ekleyin.

2. hazırlayın ve jelleri çalıştırın

  1. 200 ml 1 x Tris-asetat arabelleği (TAE) bir cam kabı ve özel eritmek için bir mikrodalga Isı özel 2 g ekleyin. 1 mL % 20 SDS % 0,1 SDS son bir konsantrasyon için ekleyin. Karıştırmak için dikkatli bir şekilde girdap. Kabarcıklar SDS eklenmesinden sonra oluşturmamanız için dikkat ediniz.
  2. Özel çözüm 15 cm x 14 cm jel levha dökün. 1-mL pipet herhangi bir kabarcıkları ortadan kaldırmak için kullanın. Bir 20-iyi tarak en üste yerleştirmek.
  3. İlk Boyut: pipet 60 µg, her hücrenin sağ şeritte lysate. (Boya açık yaklaşık ¾ jel yoluyla olana) jel 60 V 4 h için çalıştırın çalışan tampon olarak % 0,1 SDS içeren TAE kullanarak.
  4. İkinci Boyut: jel 90 ° saat yönünün tersine (Şekil 2A) dikkatle döndürün. Jel 60 V 4 h için çalıştırın.
    Not: Genel çalışan 4 V/cm jel uzunluğu bir durumdur. Çalışan koşulların tam olarak birinci ve ikinci boyutları için aynı olduğunu önemlidir.

3. transfer

  1. Proteinler polivinilidin difluoride (PVDF) membran (Şekil 2B) aktarmak için kılcal aktarma yöntemini kullanın.
    1. Aktarma arabelleği için 500 mL ekleyin bir yaklaşık 20 cm x 20 cm kapsayıcı. 5-cm yüksek yığın kağıt havlu konteyner yanında yapmak. Yığının üst yüzey alanı jel boyutları büyük olması gerekir.
    2. 14 cm x 15 cm filtre kağıdı Aktarım arabellek emmek ve kağıt havlu yığını üzerine yerleştirin. Hiçbir kırışıklık veya kabarcıklar ile kağıda yerleştirmek için dikkat ediniz. Filtre kağıt başka bir parça ile tekrar.
    3. 14 cm x 15 cm PVDF membran için 30 metanol içinde etkinleştirmek s sonra filtre tüm kabarcıklar kaldırmak için bir rulo kullanmak için dikkat çekici kağıt üzerinde katman. Jel Aktarım arabellek ile durulayın ve yine herhangi bir kabarcıklar inişli çıkışlı membran üstüne katman.
    4. Plastik film ile yakın Aktarım arabellek kapsayıcıya kağıt havlu kenarı kapsar. Bir sonraki adımda inşa kağıt köprü kağıt havlu yığını ile doğrudan temas gelebilir değil önemlidir.
    5. 15 cm x 35 cm filtre kağıt Aktarım arabellek emmek ve böylece bir ucunu üst jel kapsar ve diğer ucunu Aktarım arabellek kapsayıcısında yerleştirin. Başka bir köprü ile yineleyin.
    6. Kapsayıcı plastik wrap ile kapak ve gecede oda sıcaklığında bekletin.

4. Western Blot algılama

  1. Durulama zar 50 mL % 0.05 içeren PBS ile ara-20 (PBST) olarak tehlikeli madde kabına 20 cm × 20 cm. 20 mL % 5 süt PBST içinde ekleyin. Rock engellemek 30 dakika oda sıcaklığında.
  2. Tavşan anti-MLKL antikor PBST sütte %5 20 mL içine 10 µL pipet ve kapsayıcıya ekle. Gecede 4 ° C'de rocker üzerinde kuluçkaya
  3. Membran PBST 20 mL için 5 dk. tekrar 5 kere yıkayın.
  4. Anti-rabbit-HRP 20 ml % 5 süt PBST içinde 4 µL pipet ve kapsayıcıya ekle. 2 h için oda sıcaklığında rocker üzerinde kuluçkaya.
  5. Membran PBST 20 mL için 5 dk. tekrar 5 kere yıkayın.
  6. Gelişmiş Kemiluminesan substrat (ECL) ekleyin ve röntgen filmleri üreticinin protokolüne göre için maruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sonra necroptosis indüksiyon, RIPK1 ve RIPK3 hemen hemen aynı amiloid benzeri desenler (şerit 2 ve 4, şekil 1) gösterdi. Ancak, MLKL lifler daha heterojen ve RIPK1/RIPK3 lifleri (lane 6, şekil 1) küçük olmak gibiydi. Bizi ister MLKL RIPK1/RIPK3-bağımsız lifler oluşturur ya da MLKL sade bir şekilde büyük RIPK1/RIPK3/MLKL lifleri SDD-yaş sırasında ayrışıp. olasılığını adrese 2D SDD-yaş yöntem geliştirmek için istenir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En önemli bir özelliği, 2D SDD-yaş Elektroforez koşullar birinci ve ikinci boyutu için aynı olmasıdır. Benzer bir şekilde her iki sırasında geçiş lifleri 45 ° (hiçbir ayrılma veya bozulma oluştuğunu gösteren), keskin bir çapraz çizgi bağlıdır algılama yeteneğini electrophoreses. Farklı koşullar, örneğin voltaj veya çalışma süreyi değiştirme kullanarak bu sonuçlar karanlık olacak. Geleneksel 1 D için olduğu gibi bu amiloid ve amiloid benzeri lifleri bozabilir olacaktır Ayrıca, SDD-yaş, örnek kaynar, kaçınılmalıdır. Tüm tr...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar hiçbir çıkar çatışması beyan ederim.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu eser için bir arkadaş grubu tarafından desteklenen S.H.-A. NIH/NCATS (TL1TR001104), Welch Vakfı Hibe (I-1827) ve NIGMS (RGM120502A) Z.W. Z.W. bir R01 hibe'tıbbi araştırma ve kanser önleme ve Texas akademik ve Araştırma Enstitüsü (R1222) Virginia Murchison Linthicum uzman olduğunu.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
jel elektroforez ünitesiFisherHE99XPROjel çalışması için appratus.
agroseVWR97062-250Agaroz jel için.
kağıt kulesiFisher19-120-2484kağıdını aktarmak için
VWR21427-386
PVDF membranınıBio-Rad162-0177tozunu aktarmak için
Bio-Rad1706404XTUWestern blot
MLKL antikorunuGenetexGTX107538tavşan anti-MLKL antikoru
RIPK1 antikoruBD Biosciences610459fare anti-RIPK1 antikoru RIPK3
antikoruDr. Xiaodong Wangtavşan anti-RIPK3'ten antikor hediyesi. Bkz. Savunma 11.
anti-Tavşan-HRPSigmaA6154ikincil antikor
ECLFisherWBKLS0500Batı kemilüminesan HRP substrat
X-ışını filmi Westernblot sonucu içinFisherF-BX810
Hücre kültürü içinDMEMSigmaD6429
fetal sığır serumuHücrekültürü
için Sigma F4135hücre kültürü için penisilin-streptomisinSigmaP4333
Tripsin çözeltisihücre kültürü içinSigmaT4049
doku kültürü için PBSSigmaD8662
laboratuvarımızdarekombinant TNF. Referans 11'e bakın.
Dr. Xiaodong Wang'dansmac-mimetik. Referans 11'e bakın.
ZVAD-FMKApexBioA1902. Referans 11'e bakın.
Hücre SayacıBio-Rad1450102Model TC20; hücreleri saymak için
Pierce & trade; BCA Protein Test KitiThermo Scientific23225hücre lizatlarındaki protein konsantrasyonunu ölçmek için
Hücre kaldırıcıFisher07-200-364hücreleri tabaktan çıkarmak için
Lizis Tamponu (1 L)20 mL, 1 M Tris pH 7.4
10 mL gliserol
30 mL 5 M NaCl
840 mL ddH2< / sub>O
10 mL Triton-X100
(proteaz ve fosfat inhibitörleri istenildiği gibi)
10X TAE (1 L)48,4 g Tris baz
11,42 mL buzlu asetik asit
20 mL 0,5M EDTA pH 8
ddH20 ila 1 L
4X SDD-AGE yükleme tamponu (50 mL)5 mL 10X TAE
10 mL gliserol
4 mL %20 SDS
0,5 mL %10 bromofenol mavisi
31 mL ddH2O
TBS Transfer Tamponu (1 L)20 mL 1 M Tris pH 7.4
30 mL 5 M NaCl
950 mL ddH2O
PBST Yıkama Tamponu (1 L)100 mL 10xPBS
800 mL ddH2O
1 mL Tween20
10X PBS (10 L)800 g NaCl
20 g KCl
144 g Na2HPO4· 2H2O
24 g KH2PO4
10 L'ye ddH2O ekleyin
filtre aktarmak için blok süt bloke etmek için Hücre kültürü için nekrotozu indüklemek için yapılanNekrotozu indüklemek için hediyeNekrotozu indüklemek için , ,

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ross, C. A., Poirier, M. A. Protein aggregation and neurodegenerative disease. Nature medicine. 10, 10-17 (2004).
  2. Hou, F., et al. MAVS forms functional prion-like aggregates to activate and propagate antiviral innate immune response. Cell. 146, 448-461 (2011).
  3. Li, J., et al. The RIP1/RIP3 necrosome forms a functional amyloid signaling complex required for programmed necrosis. Cell. 150, 339-350 (2012).
  4. Liu, S., et al. MLKL forms disulfide bond-dependent amyloid-like polymers to induce necroptosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 7450-7459 (2017).
  5. Uptain, S. M., Lindquist, S. Prions as protein-based genetic elements. Annual review of microbiology. 56, 703-741 (2002).
  6. Halfmann, R., Lindquist, S. Screening for amyloid aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis. J Vis Exp. , (2008).
  7. Sipe, J. D., et al. Nomenclature 2014: Amyloid fibril proteins and clinical classification of the amyloidosis. Amyloid : the international journal of experimental and clinical investigation : the official journal of the International Society of Amyloidosis. 21, 221-224 (2014).
  8. Eisenberg, D. S., Sawaya, M. R. Structural Studies of Amyloid Proteins at the Molecular Level. Annual review of biochemistry. 86, 69-95 (2017).
  9. Bagriantsev, S. N., Kushnirov, V. V., Liebman, S. W. Methods in Enzymology. 412, Academic Press. 33-48 (2006).
  10. Sun, L., et al. Mixed lineage kinase domain-like protein mediates necrosis signaling downstream of RIP3 kinase. Cell. 148, 213-227 (2012).
  11. He, S., et al. Receptor interacting protein kinase-3 determines cellular necrotic response to TNF-alpha. Cell. 137, 1100-1111 (2009).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Amiloid Fiber Tespitiki Boyutlu Jel ElektroforeziProtein Agregasyon AnaliziH cre Lizat Haz rlamaWestern Blotting Tekni iMLKL Fiber KarakterizasyonuRIPK1 RIPK3 Kar la t rmasSDS diren li FiberlerT m r Nekroz Fakt r Alfa

İlgili makaleler