Bu makalede ayrıntılı bir metodoloji fisyon mayası bir hedef gen rasgele mutagenesis için. Örnek olarak, biz bir alt birim 19S proteasome ve ekran heterochromatin istikrarsızlaştırmak mutasyonlar için kodlar rpt4 +, hedef.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Fisyon mayası Heterochromatin kararsız hale Proteasome mutantlar seçmek için rasgele Mutagenesis Gene hedefli
Bu makalede
Özet
Özet
Bir hedef gen rasgele mutagenesis sık istenen fenotip verim mutasyonlar tanımlamak için kullanılır. Rastgele mutagenesis elde etmek için kullanılabilecek yöntemleri, hataya PCR mutantların farklı bir havuz oluşturmak için uygun ve verimli bir strateji olduğunu (i.e., mutasyona uğramış bir kütüphane). Hataya PCR yönteminin seçimi olduğunda bir araştırmacı genomik diğer bölgeler etkilenmemiş bırakarak bir genin kodlama bölge gibi önceden tanımlanmış bir bölge mutasyona istiyor. Mutant kütüphane tarafından hataya PCR güçlendirilmiş sonra uygun bir plazmid klonlanmış gerekir. Hataya PCR tarafından oluşturulan Kütüphane boyutu klonlama adım verimlilik ile sınırlıdır. Ancak, fisyon mayası, Schizosaccharomyces pombe, klonlama adım yüksek verimli tek adımlı füzyon dönüşüm yapıları oluşturmak için PCR kullanımı tarafından değiştirilebilir. İstenen fenotipleri mutantlar sonra uygun gazetecilere kullanarak seçilebilir. Burada, biz bir örnek, centromeric heterochromatin eklenen bir muhabir olarak alınmıştır ayrıntılı olarak, bu strateji tanımlarlar.
Giriş
İleri genetik hangi araştırmacılar belirli bir fenotip görüntülemek doğal olarak meydana gelen mutantlar aramak ve genetik çözümlemesi klasik bir yöntemdir. Ters Genetik mutasyonlar faiz bir gen tanıtıldı ve fenotip inceledi. İkinci durumda, hedef gen rasgele mutagenesis kez daha sonra sıcaklık hassasiyeti gibi istenen fenotipleri için seçilir veya enzimatik aktivite değiştirilen mutant bir havuz oluşturmak için kullanılır. Rastgele mutagenesis, hataya PCR1de dahil olmak üzere elde etmek için çeşitli yöntemler kullanılabilir; UV ışınlama2; kimyasal mutajen, etil methanesulfonate (EMS) veya Nitröz asit3<....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. medya hazırlanması
- Maya Özü Takviyeler ile (Evet), Evet adenin (Evet düşük Ade), Pombe Glutamat orta (PMG12) ve PMG adenin (PMG-Ade) Tablo 1' de açıklandığı gibi bileşenleri karıştırarak hazırlayın. Evet-Ade (Ade düşük) ve PMG-Ade plakaları, aynı bileşenleri hakkına sahiptir, ancak adenin ikinci gelen atlanır.
- Aşağıdaki tuz (50 x) hisse senedi kullanın: 52.5 g/L MgCl2·6H2O, 2 g/L CaCl2·2H2O, 50 g/L KCl,4 ' te distile su böylece 2 g/L Na2. Filtre 0,22-µm gözenek boyutu filtre sterilize ve 4 ° C'de depolayın
- Aşağıdaki vitamini kullan....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Şekil 1 ' de açıklanan yordamları izleyerek Edinsel Rpt4 mutantlar koloniler renklerinin değerlendirmek tarafından çözümlenebilir. Kolonilerin renkleri şeklinde ilermek cep numarasını Şekil 2' deki ilgili plakalar üzerine lekeli. Heterochromatin bölge eklenen ade6 + muhabir vahşi türü susturdu ve kırmızı kolonileri Evet-Ade tabak içinde gösterir. Bir kez heterochromatin dengeleri bozdu ve ade6 + muhabir ifade ed.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Rastgele mutagenesis hataya PCR ile belirli bir bölgede mutantların farklı bir havuz oluşturmak için güçlü bir araçtır. Bu teknik özellikle belirli bir koşulda bir proteinin işlevini değerlendirmek için arama çalışmaları için yararlıdır. Örneğin, biz burada kullanılan hataya PCR 19S proteasome alt birimi, Rpt4, heterochromatin bakım işlevini değerlendirmek için. Değişen tarafından bölge tarafından hataya PCR hedef ve tarama Koşulları ayarlama, faiz ve ekran için istenen fenotip genomik bölgesi hücreleri mutasyona başardı.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar ifşa gerek yok.
Teşekkürler
Bu proje için destek finansman temel bilim araştırma programı aracılığıyla Ulusal Araştırma Vakfı, Kore (Bilim Bakanlığı ve ICT (2016R1A2B2006354) tarafından desteklenen NMK) tarafından sağlandı.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 1. Medya< / güçlü > | |||
| Glikoz | Sigma-Aldrich | G8270-10KG | |
| Maya özü | BD Biosciences | 212720 | |
| L-Lösin | JUNSEI | 87070-0310 | |
| Adenin sülfat | ACR | 16363-0250 | |
| Urasil ve nbsp; | Sigma-Aldrich | U0750 | |
| L-histidin | Sigma-Aldrich | H8125 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 1.05108.0050 | |
| NaCl | JUNSEI | 19015-0350 | |
| MgSO4&boğa; 7H2O | Sigma-Aldrich | 63140 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 12095 | |
| Potasyum ftalat | Sigma-Aldrich | P6758-500g | |
| İnositol | Sigma-Aldrich | I7508-50G | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4501-100MG | |
| Borik Asit | Sigma-Aldrich | B6768-1KG | |
| MnSO4 | Sigma-Aldrich | M7634-500G | |
| ZnSO4&boğa; 7H2O | HAZİRAN | 83060-031 | |
| FeCl2 boğa; 4H2O | KANTO | CB8943686 | |
| Sodyum molibdat dihidrat | YAKURI | 31621 | |
| KI | JUNSEI | 80090-0301 | |
| CuSO4• 5H2O | YAKURI | 09605 | |
| D-miyo-inositol | MP biyomedikaller | 102052 | |
| Pantotenat | YAKURI | 26003 | |
| Nikotinik Asit | Sigma-Aldrich | N4126-500G | |
| (NH < altı > 4 < / sub>) 2 < / sub>SO4< / sub> nbsp; | Sigma-Aldrich | A4418-100G | |
| Agaroz | Biyobazik | D0012 | |
| G418, genetik | LPS | G41805 | |
| 2. Enzim reaksiyonları | |||
| PfuUltra II Füzyon HS DNA Polimeraz | Aglient | 600380 | Bölgeye yönelik mutajenez |
| için GeneMorphII Rastgele mutajenez Kiti | Aglient | 200500 | Hataya meyilli PCR |
| Phusion için Yüksek Sadakatli DNA Polimeraz | Thermo Fisher | F-530L | Füzyon PCR |
| Ex Tak Genel | PCR | Takara | RR001b |
| BamH1 | New England BioLabs | R0136S | |
| Xho1 | New England BioLabs | R0146S | |
| Dpn1 | New England BioLabs | R0176S | |
| 3. Ekipman< / güçlü > | |||
| Kadife kare, siyah | VWR | 89033-116 | Çoğaltma |
| Çoğaltma kaplama aracı | VWR | 25395-380 | Çoğaltma |
| MicroPulser Elektroporatör | Biorad | 1652100 için | Fisyon mayası dönüşümü için |
| Elektroporasyon Küvetleri, 0,2 cm boşluk | Biorad | 1652086 | Fisyon mayası dönüşümü için |
| Termal Döngüleyici | Bioer | BYQ6078 | Füzyon PCR rampa reaksiyonu için |
Kaynaklar
- Pritchard, L., Corne, D., Kell, D., Rowland, J., Winson, M. A general model of error-prone PCR. J Theor Biol. 234 (4), 497-509 (2005).
- Pfeifer, G. P., You, Y. H., Besaratinia, A. Mutations induced by ultraviolet light. Mutat Res. 571 (1-2), 19-31 (2005).
- Moreno, S., Klar, A., Nurse, P.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
