Yöntem makalesi

Homojen zaman çözüldü Förster rezonans enerji transferi tabanlı tahlil insülin salgılanması algılanması için

8.4K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/57531

⸱

10 Mayıs 2018

 ,  , 
1Department of Psychiatry, University of Pittsburgh, 2Department of Cell Biology, University of Pittsburgh

Bu makalede

Özet

Burada, homojen mevcut zaman hücrelerden salgılanan insülin hızlı algılama için etkili bir yöntem olarak FRET (HTRF) çözüldü.

Özet

İnsülin salgılanması tespiti düzenlenmiş salgılanmasını de çalışmalar olduğu gibi metabolizma elucidating mekanizmaları için önemlidir. Çok sayıda insülin deneyleri yıllardır varmışsın, homojen zaman çözüldü Förster rezonans enerji transferi (HTRF) teknolojisi son gelişiyle önemli ölçüde bu ölçümler basitleştirdi. Bu hızlı, uygun maliyetli, tekrarlanabilir ve güçlü optik tahlil zaman çözüldü Förster enerji rezonans Transfer kolaylaştırır uzun süreli emisyon ile parlak fluorophores için Birleşik antikorları üzerine bağımlı olduğunu. Ayrıca, HTRF insülin algılama yüksek üretilen iş tarama testleri geliştirme için mükellef olduğunu. Burada HTRF insülin salgılanması INS-1E hücrelerde, bir sıçan insülinoma türetilmiş hücre kültürünü algılamak için kullanır. Bu bize Bazal düzeyde insülin ve glikoz stimülasyon cevaben yaptıkları değişiklikleri tahmin etmek izin verir. Buna ek olarak, bu insülin algılama sistemi dopamin rol glikoz uyarılmış insülin salgılanması (GSIS) negatif bir düzenleyici olarak onaylamak için kullanın. Benzer bir şekilde, diğer dopamin D2-reseptör agonistleri, quinpirole ve bromokriptin, GSIS bir konsantrasyon bağımlı şekilde azaltmak gibi. Sonuçlarımız HTRF insülin tahlil biçiminin GSIS ve farmakolojik kendi profilleri çok sayıda uyuşturucu rolünü belirlemede yardımcı programı vurgulayın.

Giriş

Enerji metabolizmasının büyük bir anabolik hormon tarafından insülin ince ayar. İnsülin sentezlenmiş ve yanıt olarak artan hücre dışı şekeri pankreas beta hücreleri tarafından yayımlanan. Yayımlanan insülin glukoz alımını insülin duyarlı dokular1,2tarafından tetikler. Fizyolojik açıdan, bu glikoz konsantrasyonu glukoz alımını düzenleyen insülin salgılanmasını tarafından takip bir yemekten sonra yükselmesine bağlı olduğu. İnsülin direnci ile sonuçlanan metabolik bozukluklar glikoz homeostazı bozuklukları neden olabiliyor ve sonuçta, tip 2 diyabet2,3,4başlangıcı.

Her ne kadar insülin salgılanması kapsamlı eğitimi aldı, onun düzenleyici mekanizmaları kötü anlaşılır kalır. Soruşturmanın kritik bir alan kimliği roman modülatörler insülin salgılanması beta hücreleri5,6,7,8tarafından olmuştur. Bu çalışmalar glikoz stimülasyon ve insülin salgılanması kaplin ilişkisi daha iyi anlaşılmasını gerektirir. Bu nedenle, doğru bir şekilde izlemek ve glikoz uyarılmış insülin salgılanması (GSIS) düzeylerini ölçmek için yetenek gerekli olmuştur. Bugüne kadar ancak, sınırlı sayıda yöntemleri GSIS insülin salgılayan hücre satırları ve/veya pankreas adacıkları kullanarak miktar izin vermek mevcut idi. Radioimmunoassay (RIA), hangi Radyoizotop öğesini insülin ve antikorlar biridir. Bu yaklaşımın ana sınırlamaları nedeniyle işleme ve bertaraf radyoaktif malzemelerin güvenlik sorunları içerir. Ayrıca, bu emek yoğun, birden çok uzun çamaşır ve kuluçka adımları içeren bir yöntemdir. Enzim bağlı immunosorbent assay (ELISA) insülin algılama için antikorlar kullanan başka bir pahalı ve emek yoğun bir yaklaşımdır. Varyasyon antikor benzeşim ve insülin tanıma verimliliğini faktörler bu yöntemin sınırlama var ve tekrarlanabilirlik sonuçları etkileyebilir. Ne ELISA ne de RIA yüksek üretilen iş deneyler için tasarlanmıştır. AlphaScreen algılama ve insülin salgılanması düzeylerini ölçmek için kullanılan homojen bir tahlil olduğunu. AlphaScreen teknoloji ortam oksijen dönüşüm Kemiluminesan üretimi kaynaklanan chemiluminescent türleri ile tepki verebilir bir heyecanlı oksijen singlet durumuna dayanır. Tahlil homojen olduğundan, RIA ve ELISA ile ilgili çamaşır adımlardan ortadan kalkar. Ancak, sinyal tepki doğası gereği istikrarsızlık tahlil okuma etkileyebilecek bir sınırlayıcı faktördür. (TR-KISKAÇ, Heyduk ve meslektaşları9tarafından geliştirilen başka bir homojen insülin molekül üzerinde farklı epitopları için iki ayrı antikorların bağlama göre insülin ölçüm yaklaşımdır. Antikorlar her kimyasal olarak bağlantılı çift telli DNA'sı ile kısa tamamlayıcı tek iplikçikli DNA çıkıntılar vardır. İnsülin antikorları bağlama onları bir araya getirir ve bir çift telli DNA dubleks için yol açar. Her antikor da ilgili bir donör veya alıcısı fluorophore ile ilişkilidir ve DNA çift yönlü Derneği Förster rezonans enerji transferi (FRET) oluşturmak için bu fluorophores buluşturuyor. TR-KISKAÇ, bir potansiyel sınırlama ancak, perde ile aittir. Arka plan Floresans FRET reaksiyon sırasında hızla dağılmaya yetersizlik arka plan Floresans nispeten yüksek düzeyde ve düşük sinyal gürültü oranı tahlil içinde neden olabilir. Bu nedenle, bir ihtiyaç GSIS bir yüksek-den geçerek şekilde miktarının için güvenilir, sağlam ve uygun maliyetli bir tahlil için devam eder.

Biyofizik son gelişmeler bir homojen zaman çözüldü floresan enerji rezonans transferi (HTRF) dayalı tahlil gelişiminde sonuçlandı. Enerji aktarım içinde özellikle, tahlil daha doğru bir şekilde donör ve alıcısı arasındaki enerji transferi ışınımsal olmayan ışıma enerji rezonans transferi (LRET)10 HTRF dayanan FRET dayalı olarak açıklanan olabilir tür11,12,13. Bu ayrım bir floresan zamanlama beri önemli, ya da perdeleme aynı türleri FRET ve LRET için kullanılan temel perde etkileşim Şoklama LRET için daha çok farklı olsa da. Ayrıca, nadir toprak lanthanide cryptate kullanımı Evropyum gibi maddeler ve birleşimler veya uzun floresan yarı-hayat12,14HTRF terbium cryptate üretir. Bu belirli bir gecikme süresiyle (µsn) donör uyarma ve alıcısı (Yani, zaman çözüldü tahlil) emisyon ölçümü arasında giriş benzersiz avantajı sunuyor. Bu gecikme süresini alıcısı emisyon Floresans ölçüm önce dağılımı arka plan floresan için yeterli zaman sağlar. Sonuç olarak, okuma non-spesifik Floresans ücretsiz ve böylece, bir yüksek sinyal gürültü oranı elde edilir mi (şekil 1). Ayrıca, HTRF homojen doğası çok tahlil yapmak ilişkisiz türler ELISA veya RIA tabanlı yöntemleri daha daha fazla hızlı yıkama adımları yıkamak için gereksinimini ortadan kaldırır.

figure-introduction-1
Şekil 1: HTRF insülin algılama için mekanizmasının şematik. İki bağımsız olarak oluşturulan monoklonal antikorlar özellikle tanımak ve insülin ayrı sitelerde bağlayın. Bu antikorlar Evropyum cryptate donör veya XL665 alıcısı için Birleşik. Uyarma 337 nm sonuçlara emisyon 620, içinde bağış nm. Elde edilen enerji transferi bir daha uzun dalga boyu, 665 yayılmasını sağlamak XL665 neden olan nm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Burada, detaylı bir protokol sağlar GSIS INS-1E hücrelerden düzeylerini belirlemek için HTRF dayalı bir yaklaşım kullanmak için insülinoma hücre satır15sıçan bir iyi kurulmuş insülin salgılayan beta hücre kaynaklı. Buna ek olarak, bu tahlil insülin salgılanması moleküler düzenleyiciler farmakolojik profili tanımlamak için kullanılabilir. Dopamin D2incelemek için bu HTRF tabanlı insülin testin uyguladığımız-reseptör düzenleme GSIS, hangi tarihlerde. Artan çalışmalar nörotransmitter dopamin GSIS8,16,17,18,19,20, önemli bir düzenleyicisidir indirdik 21 , 22. dopamin bir negatif otokrin/parakrin şekilde dopamin D2eylemler yoluyla GSIS etkiler-tarihlerde beta pankreas hücreleri8 yüzeyde ifade reseptörleri (D2, D3, D4 reseptörleri) , 16 , 19. bu tahlil kullanarak, biz GSIS olumsuz bir düzenleyici olarak dopamin'ın rolü onaylamak ve gösteren dopamin D2-reseptör agonistleri bromokriptin ve quinpirole da GSIS azaltmak gibi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. INS-1E hücreleri: bakım ve kaplama

  1. INS-1E hücreleri oksijen 37 ˚C/5% CO2 kuluçka ve kültürlü RPMI 1640 orta ile %5 (v/v) ısı inaktive fetal sığır serum ile 2 mM L-glutamin, 10 mM HEPES, 1 mM sodyum pyruvate, 100 U/mL penisilin/streptomisin takıma korumak çözüm, 50 µM β-mercaptoethanol. 10 mL tam RPMI 1640 orta (plaka), başına hücrelerde kültür % 80-90 izdiham ulaşana kadar ne zaman onlar trypsinized ve pasajlı veya insülin salgısı tahlil için kullanılan.
  2. 1. gün: Medya Aspire edin ve hücreleri bir kez 5 mL de önceden ısıtılmış PBS ile yıkayın. Tripsin (% 0,025) 0.5 mL 1:1 0.5 ml hücreleri trypsinize ve 3-4 dk 37 ˚C az için kuluçkaya için PBS seyreltilmiş ekleyin. Tripsin 15 mL santrifüj tüpü 9 mL tam medya ve transfer hücreleri ekleyerek pipetting tarafından devre dışı bırakın.
  3. Hücreleri tarafından Santrifüjü cips ve hücre Pelet yaklaşık 5 mL taze medyada yeniden askıya alma.




figure-protocol-1

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Biz bizim insülin HTRF tahlil önceden tanımlanmış konsantrasyonları (Şekil 2) saf insan insülin Standartlar kullanılarak bir insülin standart eğri üreterek geçerliliği. Üretimi ratiometric floresan okuma ulaşmak için bize izin verilen standart eğri ve bu nedenle ilaç tedavileri (Şekil 2) yanıt olarak salgılanan insülin düzeylerini belirlemek. Intraplate değişim eğrisi montaj için en az (R2 0.99996 ± 5.0 x 10

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Burada açıklanan HTRF insülin tahlil insülin salgılanması kültürlü hücre tabanlı sistemden ölçmek için hızlı, verimli bir sistem sunmaktadır. En önemli avantajları arasında bu tahlil yüksek sinyal gürültü oranı nedeniyle düşük arka plan sinyal sunmaktadır. Buna ek olarak, biz HTRF sinyal uzun bir süre için kararlı olduğunu doğruladı (> 24 h)7. Yine de, insülin bağlama monoklonal antikorlar, hızlı bir şekilde tahlil için ek sonra bağlama doygunluk ulaşmak beri Kinetik antikor bağlama ortam sıcaklığ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Biz Nicolas Pierre (Cisbio BİYOANALİZLER) için faydalı tavsiyeler ve Dr. Pierre Maechler (Cenevre Üniversitesi) cömertçe INS-1E hücreleri verdiğiniz için teşekkür ederiz. Bu eser Savunma Bakanlığı (grant PR141292 Z.F. için) ve John F. ve Nancy A. Emmerling Fonu (için Z.F.) Pittsburgh Vakfın fon tarafından desteklenmiştir.

Teşekkürler

Yazarlar ifşa gerek yok.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
96 oyuklu beyaz yarım alan plakasıGreiner Bio-One82050-042
384 oyuklu beyaz düşük hacimli, yuvarlak tabanlı plakaCorning15100157
İnsülin Yüksek Menzilli KitiCisbio Biyotahliller62IN1PEH 10.000 test HTRF bazlı insülin test kiti
PHERAstar FSX plaka okuyucuBMG LabtechFSXHTRF tabanlı tahlil okumaları için uyarlanmış plaka
okuyucu Plaka kapatıcılarFisher ScientificDY992Antikorlar inkübe edilirken plakayı mühürlemek için
HemositometreHausser Scientific 3100
RPMI Orta 1640 (1x)Gibco 11875-093[+] L-glutamin
Tripsin% 0.05 & nbsp;Corning25-052-CI0.53 mM EDTA, (-) sodyum bikarbonat
DPBS (Dulbecco'nun fosfat tamponlu tuzlu suyu)Corning21-031-CVKalsiyum ve magnezyum olmadan
Fetal Sığır SerumuCorning35-010-CV
HEPESGibco 156-30-080
Sodyum piruvatGibco 
Penisilin / Streptomisin çözeltisi 100xCorning30-002 CT
2-merkaptoetanolSigmaM1348
Tripan Mavi Leke (% 0.4)Gibco 15250-061
Dopamin hidroklorürSigma8502
Bromokriptin mesilatTocris427
(-) -Quinpirole hidroklorürTocris1061
Sığır Serum AlbüminiCalbiochem12659
Poli-L-LizinSigmaP4832
GlikozSigmaG7021
DMSO (Dimetil sülfoksit)Sigma276855
11360070

Kaynaklar

  1. Taniguchi, C. M., Emanuelli, B., Kahn, C. R. Critical nodes in signalling pathways: Insights into insulin action. Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (2), 85-96 (2006).
  2. Vetere, A., Choudhary, A., Burns, S. M., Wagner, B. K. Targeting the pancreatic beta-cell to treat diabetes. Nat Rev Drug Discov. 13 (4), 278-289 (2014).
  3. Despres, J. P., Lemieux, I. Abdominal obesity and metabolic syndrome. Nature. 444 (7121), 881-887 (2006).
  4. Kahn, S. E., Hull, R. L., Utzschneider, K. M. Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes. Nature. 444 (7121), 840-846 (2006).
  5. Barg, S. Mechanisms of exocytosis in insulin-secreting B-cells and glucagon-secreting A-cells. Pharmacol Toxicol. 92 (1), 3-13 (2003).
  6. Braun, M., Ramracheya, R., Rorsman, P. Autocrine regulation of insulin secretion. Diabetes Obes Metab. 14 Suppl 3, 143-151 (2012).
  7. Farino, Z. J., et al. Development of a rapid insulin assay by homogenous time-resolved fluorescence. PLoS One. 11 (2), e0148684(2016).
  8. Simpson, N., et al. Dopamine-mediated autocrine inhibitory circuit regulating human insulin secretion in vitro. Mol Endocrinol. 26 (10), 1757-1772 (2012).
  9. Heyduk, E., Moxley, M. M., Salvatori, A., Corbett, J. A., Heyduk, T. Homogeneous insulin and C-Peptide sensors for rapid assessment of insulin and C-peptide secretion by the islets. Diabetes. 59 (10), 2360-2365 (2010).
  10. Heyduk, T. Measuring protein conformational changes by FRET/LRET. Curr Opin Biotechnol. 13 (4), 292-296 (2002).
  11. Degorce, F. HTRF((R)): Pioneering technology for high-throughput screening. Expert Opin Drug Discov. 1 (7), 753-764 (2006).
  12. Degorce, F., et al. HTRF: A technology tailored for drug discovery - a review of theoretical aspects and recent applications. Curr Chem Genomics. 3, 22-32 (2009).
  13. Mathis, G. HTRF(R) Technology. J Biomol Screen. 4 (6), 309-314 (1999).
  14. Daijo, J. E., Sportsman, J. R. A time-resolved fluorescence immunoassay for insulin in rodent plasma. J Pharm Biomed Anal. 19 (3-4), 335-342 (1999).
  15. Merglen, A., et al. Glucose sensitivity and metabolism-secretion coupling studied during two-year continuous culture in INS-1E insulinoma cells. Endocrinology. 145 (2), 667-678 (2004).
  16. Ustione, A., Piston, D. W. Dopamine synthesis and D3 receptor activation in pancreatic beta-cells regulates insulin secretion and intracellular [Ca(2+)] oscillations. Mol Endocrinol. 26 (11), 1928-1940 (2012).
  17. Ustione, A., Piston, D. W. A simple introduction to multiphoton microscopy. J Microsc. 243 (3), 221-226 (2011).
  18. Ustione, A., Piston, D. W., Harris, P. E. Minireview: Dopaminergic regulation of insulin secretion from the pancreatic islet. Mol Endocrinol. 27 (8), 1198-1207 (2013).
  19. Rubi, B., et al. Dopamine D2-like receptors are expressed in pancreatic beta cells and mediate inhibition of insulin secretion. J Biol Chem. 280 (44), 36824-36832 (2005).
  20. Garcia-Tornadu, I., et al. Disruption of the dopamine d2 receptor impairs insulin secretion and causes glucose intolerance. Endocrinology. 151 (4), 1441-1450 (2010).
  21. Garcia-Tornadu, I., et al. New insights into the endocrine and metabolic roles of dopamine D2 receptors gained from the Drd2 mouse. Neuroendocrinology. 92 (4), 207-214 (2010).
  22. Lopez Vicchi, F., et al. Dopaminergic drugs in type 2 diabetes and glucose homeostasis. Pharmacol Res. 109, 74-80 (2016).
  23. Kalra, S., Kalra, B., Agrawal, N., Kumar, S. Dopamine: The forgotten felon in type 2 diabetes. Recent Pat Endocr Metab Immune Drug Discov. 5 (1), 61-65 (2011).
  24. Mahajan, R. Bromocriptine mesylate: FDA-approved novel treatment for type-2 diabetes. Indian J Pharmacol. 41 (4), 197-198 (2009).
  25. Caicedo, A. Paracrine and autocrine interactions in the human islet: more than meets the eye. Semin Cell Dev Biol. 24 (1), 11-21 (2013).
  26. Ballon, J. S., Pajvani, U., Freyberg, Z., Leibel, R. L., Lieberman, J. A. Molecular pathophysiology of metabolic effects of antipsychotic medications. Trends Endocrinol Metab. , (2014).
  27. Freyberg, Z., Aslanoglou, D., Shah, R., Ballon, J. S. Intrinsic and antipsychotic drug-induced metabolic dysfunction in schizophrenia. Front Neurosci. 11, 432(2017).
  28. de Leeuw van Weenen, E. J., et al. The dopamine receptor D2 agonist bromocriptine inhibits glucose-stimulated insulin secretion by direct activation of the alpha2-adrenergic receptors in beta cells. Biochem Pharmacol. 79 (12), 1827-1836 (2010).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

HTRF AnaliziGlikoz Stim lasyonuDopamin Reg lasyonuINS 1E H creleriZaman z n rl kl FRETAntikor Tabanl TespitY ksek Kapasiteli TaramaGlikoz Stim leli ns lin Sal n mla Etkileri

İlgili makaleler