Burada vivo içinde kalp gen rekombinant Adeno-Associated virüs (rAAV) kullanarak farelerde düzenleme taşımak için detaylı bir protokol sağlamak-CRISPR teslimini aracılı. Bu iletişim kuralı distrofik kardiyomiyopati Duchenne kas distrofisi tedavisinde umut verici bir tedavi stratejisi teklifler ve kardiyak özgü nakavt postnatal farelerde oluşturmak için kullanılabilir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Virüs-aracılı teslim CRISPR kardiyak Gene farelerde düzenleme için Adeno ilişkili
Bu makalede
Özet
Özet
Kümelenmiş, düzenli olarak interspaced, kısa, palindromik tekrar (CRISPR) sistemi büyük ölçüde kültürlü hücrelerinde ve canlıların çeşitli türlerin genom mühendislik kolaylaştırdı. CRISPR teknoloji aynı zamanda insan hastalıkların bir dizi roman therapeutics olarak keşfedilmeyi. Kanıtı-of-concept veri tarafından fizibilite ve gen düzenleme tabanlı tedavi yaklaşımı Duchenne kas distrofisi (DMD) bir fare modeli kullanarak için etkinliği gösteren çalışmalar olarak son derece cesaret verici. Özellikle, rekombinant adeno ilişkili virüs (rAAV) serotip rh.74 (rAAVrh.74) intravenöz ve mayi enjeksiyon Staphylococcus aureus CRISPR ilişkili protein 9 verimli bir şekilde kalp teslim (SaCas9) ve iki sağladı exon 23 fare Dmd gen mutasyona uğramış bir kodon ile genomik bir bölgeyi silmek için (gRNA) RNA'ların yol. Bu aynı yaklaşım gen-in-faiz vurmak ve ne zaman gRNA gen Kodlayıcı bölge hedeflemek için tasarlanmıştır kendi kardiyak fonksiyon postnatal farelerde çalışma için kullanılabilir. Bu protokol için rAAVrh.74-CRISPR vektör mühendis ve yüksek verimli kardiyak teslim yenidoğan farelerde elde ayrıntılı olarak gösterir.
Giriş
Kümelenmiş, düzenli olarak interspaced, kısa palindromik tekrar (CRISPR) teknolojisi en son ilerleme genom Mühendisliği temsil eder ve mevcut uygulama hücrelerinde ve organizmaların genetik devrim yarattı. Genom CRISPR tabanlı düzenleme kullanır CRISPR ilişkili bir endonükleaz CRISPR ilişkili protein 9 (Cas9) gibi yönlendirmek için tek bir rehber RNA (gRNA) ve Cpf1 protospacer için sırayla tamamlayıcı bir genomik DNA hedef için kodlanmış ile gRNA tarafından bir belirli protospacer bitişik motifi (PAM)1,2. PAM Cas9 veya Cpf1 geni bakteriyel türler bağlı olarak değişir. Streptococcus pyogenes (SpCas9) e....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Bu protokol için kullanılan hayvanlar Ohio Devlet Üniversitesi laboratuvar hayvan kaynakları hayvan kullanım kılavuzlarınıza uygun olarak muhafaza. Tüm hayvan çalışmaları kurumsal hayvan bakım, kullanım ve Ohio State Üniversitesi İnceleme Komitesi tarafından yetkili.
1. tasarım ve gRNAs CRISPR vektör içine klonlama
- 2 gRNAs dystrophin intron 20 ve intron 23 (i20 ve i23) SaCas9 için hedefleme seçin: i20: 5'-GGGCGTTGAAATTCTCATTAC CAGAGT ve i23: (PAM sıra altı çizili ve italik) 5'-CACCGATGAGAGGGAAAGGTC CTGAAT .
Not: Hedef için i20 ve i23 hakkında 23 kilo baz çifti (kbp) uzak sitelerdir. Kodlama bir gen bozmaya, Sa....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Hedef genomik DNA bölgenin silinmesi ikna etmek için gRNAs etkinliği hücre kültürlerinde ambalaj içinde vivo çalışmalar için rAAV içine önce değerlendirilmelidir. Bu amaçla, gRNAs ve SaCas9 ifade yapıları electroporated C2C12 hücre içine ve genomik DNA PCR tarafından hedef siteleri (Şekil 1) kanat astar ile analiz edildi. ~ 500 kan basıncı kontrol hücreleri genomik DNA'ın büyük boyutları nedeniyle bir grup verir iken gen düzenleme sonucu hedef genomik DNA'ın .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu protokol için biz vivo içinde kalp gen rAAVrh.74-aracılı teslim SaCas9 ve iki gRNAs kullanma Doğum sonrası farelerde düzenleme elde etmek için gerekli tüm adımları ayrıntılı olarak. Yukarıda belirtildiği, bu yaklaşım bizim iş27' açıklandığı gibi dystrophin ifade distrofik farelerde geri yüklemek için kullanılabilir, ancak Ayrıca hızlı ters genetik çalışmalar uzun süreci olmadan farelerde kalp ile ilgili genlerin sağlayabilirsiniz geleneksel nakavt yaklaşım oluşturmak ve nakavt fare mod.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Hiçbir çıkar çatışması bulunmaktadır.
Teşekkürler
R.H. ABD Ulusal Sağlık hibe (R01HL116546 ve R01 AR064241) Enstitüleri tarafından desteklenir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Alexa Fluor 555 keçi tavşan önleyici IgG | Thermo Fisher Scientific | A-21428 | |
| Benzonaz Nükleaz | Sigma-Aldrich | E1014 | |
| Biyo Güvenlik Dolapları | Thermo Fisher Scientific | 1347 | 1300 Serisi A2 Sınıf II, Tip A2 |
| BsaI | New England BioLabs Inc | RO535S | |
| Yetkili hücreler | Agilent Teknolojileri | ||
| Hücre kültürü kapları, 150mm | Nest Scientific USA | 715001 | |
| Kriyostat | Leica Biosystems | Leica CM3050S | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | MT10017CV | Corning cellgro |
| Distrofin antikoru | Spring Bioscience | E2660 | |
| Hızlı İyon Midi Plazmbi Kitleri | IBI Bilimsel | IB47111 | |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | 26-140-079 | |
| Filtre Ünitesi, 0.45μ m | Thermo Fisher Scientific | 166-0045 | |
| GoTaq Master Karışımları | Promega | M7122 | |
| Yüksek hızlı plazmid mini kiti | IBI Scientific | IB47102 | |
| At serumu | Abcam | ab139501 | |
| Isotemp 2239 Su Banyosu | Thermo Fisher Scientific | 15-460-11Q | |
| Isotemp Isı Bloğu | Thermo Fisher Scientific | 11-718 | |
| Ters konfokal mikroskop | Carl Zeiss Mikroskopi, LLC | LSM 780 | |
| LightCycler 480 cihazı | Roche | 5015243001 | LightCycler 480 Enstrüman II |
| Büyük Kapasiteli Santrifüj | Thermo Fisher Scientific | 46-910 | Thermo Scientific Sorvall RC 6 Plus |
| Mikrosantrifüj | Thermo Fisher Scientific | 75002445 | Sorvall Legend Micro 21R |
| Nanodrop spektrofotometreleri | Thermo Scientific | ND2000CLAPTOP | NanoDrop™ i20-F Entegre DNA Teknolojileri için 2000/2000c |
| Oligolar | Entegre DNA Teknolojileri | için CACCgGGCGT TGAAATTCTCATTAC | |
| Oligos | AAAC GTAATGAGAATTTCAACGCCc; | ||
| i23-F | Entegre DNA Teknolojileri | CACCgCACCGATGAGAGGG AAAGGTC | |
| i23-R | Entegre DNA Teknolojileri | GACCTTTCCCTCTCATCGGTGc | |
| Oligos | Entegre DNA Teknolojileri | ||
| OptiPrep Yoğunluk Gradyan Ortamı | Sigma-Aldrich | D1556-250ML | |
| OptiMEM | Thermo Fisher Scientific | ||
| PEG8000 | Sigma-Aldrich | 89510-1kg-F | |
| Polietilenimin | Polysciences | 23966 | |
| Proteinaz K | Sigma-Aldrich | P2308 | |
| Hızlı Mühürlü santrifüj tüpü | Beckman Coulter Inc | 342414 | |
| QIAquick Jel Ekstraksiyon kiti | Qiagen | 28704 | |
| Radyant SYBR Yeşil Hi-ROX qPCR Kitleri | Alkali Scientific | QS2005 | |
| RevertAid RT Ters Transkripsiyon Kiti | Thermo Fisher Scientific | K1691 | |
| Rotor | Beckman Coulter Inc | 337922 | Tip 70Ti |
| T4 DNA ligaz | New England BioLabs Inc | M0202S | |
| Termal Döngüleyici | Bio-rad | 1861096 | |
| TRIzol Reaktif | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | |
| Ultrasantrifüj | Beckman Coulter Inc | 8043-30-1192 | Optima le-80k |
| Ultra santrifüj filtre ünitesi | MilliporeSigma | UFC510096 | |
| Vector Laboratories, Inc | H-1200 | ile VECTASHIELD Montaj Ortamı |
Kaynaklar
- Makarova, K. S., Koonin, E. V. Annotation and Classification of CRISPR-Cas Systems. Methods Mol Biol. 1311, 47-75 (2015).
- Zetsche, B., et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell. 163, 759-771 (2015).
- Cong, L.,....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
