Method Article

Kök Microbiome keşfetmek: toprak, rizosferde ve kök Endosphere bakteriyel topluluk verileri ayıklama

DOI:

10.3791/57561

⸱

May 2nd, 2018

 ,  ,  , 
1Department of Plant and Microbial Biology, University of California, Berkeley, 2Plant Gene Expression Center, USDA ARS

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, toprak, rizosferde ve kök endosphere microbiomes amplicon sıra verileri elde etmek için bir protokol açıklayın. Bu bilgiler kompozisyon ve çeşitlilik bitki ilişkili mikrobiyal toplulukların araştırmak için kullanılan ve bitki türlerinin geniş bir kullanım için uygundur.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bitki ana bilgisayar ile ilişkili mikroorganizmalar arasında samimi etkileşim bitki fitness belirlemede önemlidir ve geliştirilmiş dayanıklılık abiyotik gerilmeler ve hastalıklar için teşvik edebilirsiniz. Bitki microbiome olabilir gibi son derece karmaşık, düşük maliyetli, yüksek üretilen iş amplicon tabanlı sıralama 16S rRNA gen gibi sık sık onun mikrobiyal kompozisyon ve çeşitlilik karakterize için tercih edilen yöntemlerdir. Ancak, bu tür deneyler zaman uygun metodoloji yelpazesi analizi ve örnekleri ve çalışmaları arasında karşılaştırmalar zorlaştırabilir önyargıları azaltmak için önemlidir. Bu iletişim kuralı, toplama ve DNA ekstraksiyon toprak, rizosferde ve kök örnekleri için standart bir metodoloji ayrıntılı olarak anlatılmaktadır. Buna ek olarak, biz Bu örneklerdeki bakteri toplulukları bileşimi keşfi için izin veren bir iyi kurulmuş 16S rRNA amplicon sıralama boru hattı vurgulayın ve kolayca diğer marker gen için adapte edilebilir. Bu boru hattı bitki türleri, sorgum, Mısır, buğday, çilek ve agav, dahil olmak üzere çeşitli için doğrulandı ve bitki organelleri kirlenme ile ilgili sorunların üstesinden yardımcı olabilir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Microbiomes bitki ilişkili dinamik ve karmaşık mikrobiyal topluluklar bakteri, arkeler, virüsler, mantarlar ve diğer ökaryotik mikroorganizmaların oluşur. Bitki hastalık neden onların iyi okudu rol yanı sıra, bitki ilişkili mikroplar da olumlu bitki sağlığı biyotik ve abiyotik stres tolerans iyileştirilmesi, besin kullanılabilirliği teşvik ve bitki büyüme yoluyla artırılması etkileyebilir etki üretimi. Bu nedenle, özellikle bitki kök endospheres, rhizospheres ve çevresindeki toprak ile ilişkilendirmek takson karakterize bulunmaktadır. Bazı mikroplar izolasyon laboratuvar oluşturulan medya kültürlü olabilir, birçok kısmen diğer mikroplar ile simbiyotik ilişkiler üzerine güveniyor olabilir çünkü çok yavaş büyümek değil veya bir laboratuar ortamında yinelenemez koşulları gerektirir. Serisi tabanlı filogenetik çevre ve ana bilgisayar ilişkili mikrobiyal örnekleri profil oluşturma ekimi ihtiyacını kaçınmanızı sağlar ve nispeten ucuz ve yüksek üretilen iş çünkü, mikrobiyal topluluk raporlaması için tercih edilen bir yöntem haline gelmiştir kompozisyon.

Yeni nesil (NGS) platformları1 sıralama çeşitli tarafından sağlanan uygun sıralama teknolojileri seçimi önemli faktörler de dahil olmak üzere kullanıcıların gereksinimlerini üzerinde bağlıdır: istediğiniz kapsamı, amplicon uzunluğu, beklenen toplum çeşitlilik, hem de hata oranı, okuma-uzunluk ve maliyet-başına-Çalıştır/megabase sıralama. Amplicon tabanlı sıralama deneylerinde dikkate alınması gereken başka bir ne gen AMPLİFİKATÖRLÜ olacaktır ve ne astar kullanılacak olan değişkendir. Tasarlarken veya astar seçimi yaparken, araştırmacılar genellikle bileşimleri amplifikasyon evrensellik ve taksonomik çözünürlük arasında ortaya çıkan amplicons üzerinden ulaşılabilir yapmak zorunda kalıyor. Bu nedenle, bu tür çalışmalar kez astar ve seçmeli olarak microbiome belirli alt kümeleri hedef işaretleyiciler açmadı. Bakteriyel topluluklar kompozisyonu değerlendirmek genellikle bir veya daha fazla bakteri 16S rRNA gen2,3hypervariable bölgelerin sıralama tarafından gerçekleştirilir. Bu çalışmada, biz dayalı bir amplicon tarif sıralama iletişim kuralı bu hedefleri 500 bp V3 V4 bölge için yeterli değişkenlik de sağlarken geniş amplifikasyon bakteriyel özellikleri sağlar bakteriyel 16S rRNA gen NGS platformu için geliştirilen farklı özellikleri arasında ayrım. Ayrıca, bu iletişim kuralı kolayca diğer astar kümelerini, mantar ITS2 işaretçisi veya Ökaryotlar 18S rRNA altbirim hedefleme ile kullanmak için adapte edilebilir.

Av tüfeği metagenomics, metatranscriptomics ve tek hücreli sıralama, çözümlenmiş mikrobiyal genleri ve topluluk işlevi daha doğrudan ölçümü de dahil olmak üzere diğer avantajlar sunuyor gibi diğer yaklaşımlar, bu tekniklerin genellikle daha fazla iken Burada açıklanan4pahalı ve filogenetik profil oluşturma daha yoğun hesaplama. Ayrıca, performans üzerinde kök örnekleri av tüfeği metagenomics ve metatranscriptomics okuma için ana bitki genom ait büyük bir yüzdesi görüntüler ve bu sınırlamayı aşmak için yöntemleri hala gelişmiş5,6davranıyorsun.

Herhangi bir deneysel platformunda olduğu gibi amplicon tabanlı profil oluşturma deneysel tasarım ve veri çözümleme sırasında dikkate alınması gereken potansiyel önyargıları bir dizi neden olabilir. Bu örnek koleksiyonu, DNA ekstraksiyon, PCR astar yelpazesi ve Kütüphane hazırlık nasıl gerçekleştirildiğini yöntemleri içerir. Farklı yöntem oluşturulan kullanılabilir veri miktarını önemli ölçüde etkileyebilir ve ayrıca çabaları çalışmalar arasında karşılaştırılması için engel olabilir. Örneğin, rizosferde bakteri7 ve farklı çıkarma teknikleri veya seçim DNA ekstraksiyon kitleri8,9 kaldırma yöntemi gösterilmiştir aşağı akım analizi, yol açan önemli ölçüde etkisi farklı sonuçlar ile ilgili mikroplar hediye ve onların göreceli zenginliği olan. Amplicon tabanlı profil oluşturma özelleştirilmiş beri çalışmalar arasında karşılaştırmalar yapmak zor olabilir. Earth Microbiome projesi bitki ilişkili microbiome gibi karmaşık sistemleri eğitim araştırmacılar standart protokoller geliştirme uygulama tarafından neden olduğu değişkenlik en aza indirme aracı olarak yararlanacak önerdi farklı yöntemleri arasında çalışmalar10,11. Burada, biz Yukarıdaki konuların pek çok tartışmak ve en iyi uygulamalar olarak nereye teklif öneriler uygun.

Protokol sorgum bicolor ve köklü bir DNA izolasyon kit11kullanarak açılan DNA toplama toprak, rizosferde ve kök örnekleri sürecini gösterir. Ayrıca, bizim iletişim kuralı bir detaylı amplicon sıralama iş akışı, bakteriyel topluluklar12,13,14yapısını belirlemek için yaygın olarak kullanılan bir NGS platformu kullanarak içerir. Bu iletişim kuralı kullanmak üzere çok çeşitli bitki kökleri, rizosferde ve ilişkili-toprak sorgum bicolor, Zea mays ve Triticum soğanı15de dahil olmak üzere 18 monocot tür yayınlanan bir çalışmada konaklarda doğrulandı. Bu yöntem aynı zamanda diğer marker gen kullanılmak üzere mantar ITS2 marker gen çalışmaları agav microbiome16,17 ve çilek microbiome eğitim için başarılı uygulama tarafından gösterildiği gibi doğrulandı 18.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. toplama ve ayırma kök Endosphere, rizosferde ve toprak örnekleri

  1. Sterilize etmek için alan, otoklav ultrasaf su (suyu örnek başına en az 90 mL) girmeden önce. Epiphyte kaldırma arabellek (en az 25 mL örnek başına) KH2PO46.75 g, K2HPO48,75 g ve Triton X-100, 1 mL 1 litre steril su ekleyerek hazırlayın. 0.2 µm gözenek boyutu ile vakum filtre kullanarak arabellek sterilize.
    1. Adımlar 1.2-1.5, aşınma temiz eldiven etanol ile hiç sterilize kez ve eldiven kontaminasyonu önlemek için her örnek arasında değiştirin. Tüm ekipman % 70 etanol ile sterilize ve örnekler arasındaki tüm cihazları silin. Örnekleme önce denemeniz için en uygun örnekleme derinliği belirlemek ve tüm toprak ve kök koleksiyonları ile tutarlı.
  2. Toplu toprak örnekleri toplamak için bir etanol sterilize toprak çekirdek toplayıcı bir çekirdek toplayarak bitki köklerinin ücretsizdir toprak elde etmek için kullanın bitkinin tabanından yaklaşık 23-30 cm.
  3. Toprak bir plastik torba aktarmak, toprak yumuşak sallayarak homojenize ve bir aliquot bir 2 mL tüp doldurmak için toprak örneği (yaklaşık 600 mg) aktarın. Hemen 2 mL tüp kuru Buza koyun ya flaş dondurma tüp sıvı N2 kadar DNA ekstraksiyon (Adım 2) ile devam etmek için hazır.
    1. Bazı ortamlarda, çevresindeki toprak bitki malzeme içerebilir. Bu durumda, bir steril 2 mm elek plastik torbaya koyarak önce topraktan bitki enkaz ayırmak için kullanın.
  4. Kök ve rizosferde toplamak için bitki kök mümkün olduğunca daha fazla elde etmek için dikkat çekici, kazıp bir etanol sterilize küreği kullanın. Derinlik bitki bağlıdır. Buğday gibi küçük bitkiler-ebilmek var olmak çıkarmak birkaç santimetre kazma tarafından iken, sorgum gibi daha büyük bitkiler 30 cm veya daha fazlasını gerektirebilir. Yaklaşık 2 mm kök yüzeye kalarak toprak olana aşırı topraktan kökleri kapalı yavaşça salla.
    Not: küçük bitkiler, kırılgan kökleri ile veya içerik topraklarda kuru, yüksek-kil ile çalışırken dikkat et. İdeal olarak, yalnızca köklerine sallayarak sonra kalan toprak ince bir tabaka olmalıdır. Toprak büyük toplamları kalırsa, bir lastik tokmak toprak ateş tabanı hafifçe vurarak çıkarmak için kullanılabilir. Toprak bu işleminden sonra kalan miktarı aşıyor veya 2 mm kısa düşüyor, yaklaşık kalınlığı olması gerekmektedir.
  5. Büyük bitkiler için temsili bir alt bölümüne köklerin keser ve 500 mg kök dokusunun en az 50 mL konik şişe yerleştirir için steril makas ve/veya makası kullanın. Daha küçük otlar için tüm kök sistemi şişeyi yerleştirin. Kökleri kapak sonra hemen örnek kuru buza yer için yeterli epiphyte kaldırma arabellek ekleyebilir veya flaş dondurma sıvı N2örnek.
    Not: 50 mL konik şişe bantlayın değil olarak adım yıkama zor yapacak dikkat. Öyle ki epiphyte arabellek altına akışı, şişeyi boyunca kökler çevreleyen ve üst kapak yeterli boş alan olmalıdır. Bazı otlar 50 mL konik şişe sığmayacak kadar çok daha fazla kök biyokütle olduğundan, alt bölümüne köklerin toplanmalıdır. Ancak, bu unutulmamalıdır kökleri kesme rizosferde kesir yıkandıktan endophytic bakteri neden olabilir, bu yüzden kökleri kırma indirilmelidir. Örnekleri hemen laboratuara döndükten sonra işlenmez, onlar-80 ° C'de saklanabilir
  6. Rizosferde kökleri ayırmak için kök örnek buz çözme sonra kök örnekleri için 160 W 30 10 min darbeleri ile 4 ° C'de solüsyon içeren temizleyicide s, ayrılmış 30 s. havalesi ile kökleri bir soğutulmuş (4 ° C), 50 mL tüp steril forseps kullanarak temiz. Tampon ve toprak, rizosferde kesir (şekil 1) ile orijinal tüp ateþe atmayýn.
  7. Arabellek içeren tüp santrifüj kapasitesi ve rizosferde 10 dk 4 ° c, 4.000 x g. Decant süpernatant, flash için sıvı N2rizosferde kesir içeren tüp donma ve DNA ile devam etmek için hazır kadar rizosferde kesir-80 ° C'de depolayın ayıklama (Adım 2).
  8. Kökleri yıkamak için kök kesir için yaklaşık 20 mL soğuk (4 ° C) steril su ekleyin. Kök şiddetle (tarafından el ya da Mikser, 15-30 s) sallayarak yıkama ve su tahliye.
  9. Hiçbir toprak kök yüzeyde kalır kadar en az iki kez, bu adımı yineleyin. DNA ekstraksiyon (Adım 2) hemen gerçekleştirilmez, kökleri steril alüminyum folyo sarma, flaş dondurma sıvı N2ve mağaza-80 ° c kadar örnekleri DNA ekstraksiyon ile devam etmek için hazır kökleri.

2. DNA ekstraksiyon

Not: her zaman 2 ve 3 numaralı adımları etanol ile sterilize temiz eldiven giyilmelidir ve tüm iş-meli var olmak kılınmak etanol ile sterilize bir yüzey üzerinde.

  1. DNA toprak ve rizosferde örneklerinden ayıklayın.
    1. Hızlı bir şekilde toprak ve rizosferde 250 mg birkaç adım mesafede 1.3 ve 1.7 ayrı toplanması tüpler içine aktarmak için steril bir spatula bir ticari DNA izolasyon kiti verilen kullanım toprak çıkarılması için tasarlanmış, daha sonra DNA izolasyon kiti tedarikçi kullanarak ilerlemek iletişim kuralı.
    2. DNA izolasyon kit tarafından sağlanan elüsyon arabelleği DNA'da eluting sonra adım 3 ile devam etmek için hazır kadar DNA-20 ° C'de depolayın.
  2. DNA kök örneklerinden ayıklayın.
    1. Steril harç ve sıvı N2kullanarak havaneli chill. 600-700 mg kökü doku ölçmek ve doku harç yerleştirin. Dikkatle, kökleri kapsayacak yeterli sıvı N2 ekleyin.
    2. Kökleri küçük parçalar halinde eziyet. Sıvı N2 ekleme ve öğütme işlemi devam (en az iki kez, örnekleri arasında tutarlı olması), kökleri ince bir toz olana. Kök doku bu adımı sırasında çözülme değil emin olun.
      Uyarı: uygun kişisel koruyucu ekipman (laboratuvar önlüğü, koruyucu gözlük ve kriyojenik eldiven) kullandığınızda çalışma ile sıvı N2.
      Not: düşük kaliteli DNA ekstraksiyon için toz haline aşırı kökleri eziyet ve toz-80 ° C'de depolamak faydalı olabilir
    3. Hızlı bir şekilde, önce kök tozu çözülme, başlar kök tozu önceden ağırlığını 1.5 mL tüpler içine buzda aktarmak için steril bir spatula kullanın. Kayıt ağırlığı tüp ve toz. Genellikle, 300-400 mg tozu transfer edilir.
    4. Kullanımı hızlı bir şekilde bir ticari DNA izolasyon Seti'nde sağlanan koleksiyon Tube kökü tozu 150 mg aktarmak için steril bir spatula çıkarma topraktan için tasarlanmış, daha sonra DNA izolasyon kiti tedarikçi firmanın iletişim kuralını kullanarak ilerlemek.
      Not: bazı kök örnekleri için olabilir DNA amplifikasyon PCR, özellikle farklı bir DNA ekstraksiyon protokol zaman sırasında engeller DNA Pelet kalan organik yüksek yoğunlukta (örn., CTAB ayıklama) kullanılır. Gerekirse, DNA çevre DNA temizlik Seti'nde sağlanan yönergeleri izleyerek temiz.
  3. Bir yüksek-duyarlı benchtop yer kullanarak tüm DNA örnekleri konsantrasyonu ölçmek.
    1. 1-20 µL her eluted DNA örneğinin dsDNA yüksek-duyarlı tahlil Seti'nde sağlanan tüpler içine ekleyin. Yer çalışma çözümü (1: 200 boya: arabellek) 200 µL kadar ekleyin.
    2. DNA çift 1 (0 ng/µL DNA) veya 10 µL Standart 2 (100 ng/µL) 10 µL içeren iki ek tüp hazırlayın ve her standart olarak yer çalışma çözüm 190 µL ekleyin.
    3. Standartları ve her örnek konsantrasyon ölçmek. Otomatik olarak yapılmazsa DNA toplama Absorbans çıkışta iki standardı tarafından bir doğrusal regresyon hesaplar.

3. Amplicon Kütüphane hazırlanması ve sunulması

  1. Malzemeler amplifikasyon reaksiyon için ayarlayın.
    1. DNA örnekleri 4 ° C'de erimek ve adım 3 boyunca buzda tut. DNA örnekleri önyargı PCR plaka (Tablo 2.) üzerindeki konumları nedeniyle en aza indirmek amacıyla rastgele
    2. 96-şey PCR plaka DNA moleküler düzeyde su her örnekten bir 20 µL. Ekle 20 µL dört köşe wells için moleküler düzeyde su hacmi 5 ng/µL için amplifikasyon (boş olanlar) (Tablo 2) için negatif denetimleri olarak sulandırmak.
    3. Öyle ki bir çok kanallı pipet (Şekil 2) ile eklenebilir barkodlu astar (10 µM) PCR şerit tüpler veya bir 96-şey tabak içinde düzenleyin.
    4. Her DNA örneği nüsha olarak yükseltmek için yeterli PCR ana karışımını hazırlayın. Hazırlamak 1,5 µL BSA (20 mg/mL), önceden yapılmış 2 ana mix (PCR arabellek, MgCl2, dNTPs ve Taq DNA polimeraz oluşan) x 37,5 µL, kloroplast PNA 0,57 µL (100 µM), mitokondrial Filistin 0,57 µL (100 µM) ve moleküler sınıf su 25.86 µL.
    5. Ana karışımı bir steril 25 mL çok kanallı pipet rezervuar içine dökün ve bir çok kanallı pipet kullanarak yeni bir 96-şey PCR plaka her kuyuya ana karışımı 66 µL dağıtın.
      Not: Ana karışımı için reaktif birimleri hesaplanırken, plaka başına 4 boş kuyu da eklemeyi unutmayın.
    6. Bir çok kanallı pipet kullanarak 5 ng/µL DNA'dan (normalleştirilmiş DNA plaka) ana mix tabak 6 µL ekleyin. Farklı bir ileri barkod ve her satır farklı ters barkod (Şekil 2) vardır öyle ki astar ters 1,5 µL 10 µM, her sütun vardır öyle ki 10 µM ileri astar ana plaka 1.5 µL ekleyin.
      Not: astar eklemeden önce randomize tabakalar ve ana karışımı farklı astar eklediyseniz Its veya ITS2 mantar genler yükseltmek için kullanılabilir. Bu durumda ise, benzer bir astar tasarım kullanılabilir.
    7. Spin aşağı plaka kısaca 3000 x g. karışımı yavaşça, sonra 25 µL tepki karışımı ile üç tabak içine bölmek için bir çok kanallı pipet kullanın.
      Not: üç çoğaltır kesinlikle gerekli olmasa da, bu teknik değişkenlik etkisini azaltır.
  2. Aşağıdaki koşullar bir thermocycler kullanarak her plaka DNA'da yükseltmek: 180 s 98 ° C'de 30 döngüleri: 98 ° C 45 için s 10 78 ° C (denaturing), s (PNA tavlama), 60 55 ° C (astar tavlama) s ve 72 ° C için 90 s (uzantısı) , sonra 600 s 4 ° C tarafından takip 72 ° C'de adım tutun. Amplifikasyon sonra üç Çoğalt tabak bir tek 96-şey plaka havuz.
  3. 96-şey plaka okuyucu içinde yüksek-duyarlı yer reaktifler kullanarak DNA ölçmek.
    1. 2 µL PCR ürünleri yer çalışma çözümü (1: 200 boya: arabellek) 98 µL birlikte bir 96-şey Mikroplaka ekleyin. Standart olarak 4 kuyu içerir: 5 µL (0 ng/µL DNA), DNA çift 1 1 µL Standart 2 (10 ng/µL), 2 µL Standart 2 (20 ng/µL) ve standart 2 (50 ng/µL) 5 µL. Daha sonra 100 µL son hacmi için yer çalışma çözüm ekleyin.
      Not: Her örnek bir plaka okuyucu yoksa 2.3 adımda anlatıldığı gibi bir benchtop yer kullanılarak ölçülebilir.
    2. DNA toplama Absorbans çıktısından dört standartları tarafından bir doğrusal regresyon hesaplar.
    3. Başarıyla yükseltilmiş barkodlu ürün (Bu bir konsantrasyon 15 ng/µL büyük olan), havuz 100 ng her örneğinin içine bir tek 1,5 mL tüp (Tablo 2).
    4. Havuza bir elektronik tablo programında =AVERAGE() işlevi kullanılarak eklenen örnekleri ortalama hacmi hesaplamak. "Boş" PCR ürünleri hacmi için havuza alınan örnekleri ekleyin.
      Not: "boş" PCR ürünleri kendi benzersiz barkod kombinasyonları beri onlar için herhangi bir laboratuvar kirletici maddeleri kontrol etmek için sıralı.
  4. Adım 2.3 ve almak 600 ng DNA bölümünde açıklandığı gibi bir benchtop yer kullanarak havuza alınan ürün konsantrasyon ölçmek ve moleküler düzeyde su 1,5 mL tüp içinde 100 µL son hacmiyle oranında seyreltin. Kalan havuza alınan ürün-20 ° C'de depolayın
  5. 600 ng DNA aliquot paramagnetic arıtma boncuk birkaç istisna dışında bir 96-şey biçiminde kurulan PCR arıtma işlemine takip ederek yıkayın.
    1. Taze bir 600 µL % 70 etanol aliquot olun. Altına yerleşmek boncuk yeniden askıya almak için manyetik boncuklar şişe sallamak.
    2. 1 x (100 µL) hacmi boncuk çözüm DNA 600 ng aliquot için ekleyin. 10 kez pipetting tarafından iyice karıştırın. Oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya.
    3. Tüp manyetik stand 2 min için (veya kadar çözüm açıktır) üzerine yerleştirin boncuk eriyik--dan ayırmak için. Tüp hala manyetik tribünde olmakla birlikte, açık süpernatant dikkatle manyetik boncuklar dokunmadan Aspire edin ve açık süpernatant atın.
      Not: Bu noktada, amplicon ürünleri için manyetik boncuklar bağlıdır. Rahatsız ya da kayıp sırasında aspirasyon vardır herhangi bir boncuk DNA kaybolmasına neden olacaktır.
    4. Tüp manyetik tribünde bırakın ve 300 µL % 70 etanol tüp ekleyin; oda sıcaklığında 30 s. aspiratı etanol ve atma için kuluçkaya. Bu adımları tekrarlayın ve sonra ikinci yıkama tüm etanol kaldırın. Manyetik standından tüpü çıkarması ve 5 min için Kuru hava.
    5. Moleküler düzeyde su 30 µL kurutulmuş boncuk ve 10 kez pipetting karıştırın. 2 dk. 1 dk. için manyetik stand tüp dönmek için oda sıcaklığında boncuk eriyik--dan ayırmak için kuluçkaya. Eluate için yeni bir tüp aktarın.
      Not: Manyetik boncuklar akış yönündeki tepkiler etkilemez.
  6. Son konsantrasyonu temizlenmiş, havuza alınan DNA benchtop yer 2.3. adımda açıklandığı gibi kullanarak ölçmek. Bir aliquot 10 seyreltik nM son hacim 30 µL veya konsantrasyonu ve sıralama aracı tarafından tercih edilen birim.
  7. 2 x 300 bp eşleştirilmiş uç sıralama bir NGS platformda DNA sıralamak için sıralama tesis hizmetlerini kullanan.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Önerilen bir protokoldür yapmak neden, her örnek için eşleşen ve ya bir bakteriyel atanan dizin oluşturulmuş eşleştirilmiş uç okuma veri kümesinde operasyonel taksonomik birimleri (OTU) veya tam sırası varyant (ESV amplicon da, sıra varyant (ASV) ve sub-operational taksonomik birimi (sOTU)), aşağı akım analizine bağlı olarak. Yüksek kaliteli dizi verilerini elde etmek için örnek arasında tutarlılık sağlamak ve olası herhangi bir önyargı giriş örnek işleme veya kütüphane hazırlık sırasında...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu iletişim kuralı kök endosphere, rizosferde ve toprak mikrobiyal topluluk kompozisyonlar, örnek işleme ve aşağı akım sıralama alanı örnekleme keşfetmek için kurulan bir boru hattı gösterir. Eğitim microbiomes kök ilişkili benzersiz sorunlar, kusura bakma ama kısmen örnekleme doğal zorluklar için topraktan sunar. Toprak son derece değişken fiziksel ve kimyasal özellikleri açısından vardır ve farklı toprak koşullarına kadar az birkaç milimetre28,29tarafından ayrı...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu eser USDA-ARS (CRIS 2030-21430-008-00D) tarafından finanse edildi. TS NSF yüksek lisans araştırma bursu programı tarafından desteklenmektedir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.1-10 / 20 ve mikro; L filtreli mikropipet uçlarıUSA Scientific1120-3810Diğer tedarikçilerin eşdeğeri ile ikame edilebilir.
1,5 mL mikrosantrifüj tüpleriUSA Scientific1615-5510Diğer tedarikçilerden eşdeğeri ile ikame edilebilir.
10 ve mikro; L çok kanallı pipetEppendorf3122000027Diğer tedarikçilerin eşdeğeri ile ikame edilebilir.
10 ve mikro; L, 100 ve mikro; L ve 1000 &mikro; L mikropipetlerEppendorf3120000909Diğer tedarikçilerin eşdeğeri ile ikame edilebilir.
100 ve mikro; L çok kanallı pipetEppendorf3122000043Diğer tedarikçilerin eşdeğeri ile ikame edilebilir.
1000 ve mikro; L filtreli mikropipet uçlarıUSA Scientific1122-1830Diğer tedarikçilerin eşdeğeri ile ikame edilebilir.
2 mL mikrosantrifüj tüpleriUSA Scientific1620-2700Diğer tedarikçilerden eşdeğeri ile ikame edilebilir.
2 mm toprak elekOrmancılık Tedarikçileri60141009Diğer tedarikçilerin eşdeğeri ile ikame edilebilir.
200 ve mikro; L filtreli mikropipet uçlarıUSA Scientific1120-8810Diğer tedarikçilerin eşdeğeri ile ikame edilebilir.
25 mL rezervuarlarVWR International LLC89094-664Diğer tedarikçilerin eşdeğeri ile ikame edilebilir.
50 mL konik şişelerThermo Fisher Scientific352098Diğer tedarikçilerden eşdeğeri ile ikame edilebilir.
500 mL vakum filtreleri (0.2 & mikro; m gözenek boyutu)VWR International LLC156-4020
96 oyuklu mikroplakalarUSA Scientific655900
96 oyuklu PCR plakalarıBioRadHSP9631
Agencourt AMPure XP boncuklarıThermo Fisher ScientificNC9933872Kullanım talimatları:
https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/ajax/downloadDocument/B37419AA.pdf?autonomyId=TP_DOC_150180
&documentName=B37419AA.pdf
Alüminyum folyoBoardwalk7124Diğer tedarikçilerden eşdeğeri ile ikame edilebilir.
0,001 g çözünürlüğe sahip analitik teraziOhaus PioneerPA323Diğer tedarikçilerin eşdeğeri ile ikame edilebilir.
Bioruptor Plus ultrasonicatorDiagenodeB01020001
Sığır Serum Albümini (BSA) 20 mg / mLNew England BiolabsB9000S
SantrifüjEppendorf581100090850 mL ve 96 oyuklu plaka kova adaptörleri dahil
Kriyojenik eldivenlerMillipore SigmaZ183490Diğer tedarikçilerden eşdeğeri ile ikame edilebilir.
DNeasy PowerClean kiti (isteğe bağlı)Qiagen Inc.12877-50Önceden MoBio
DNeasy PowerSoil kitiQiagen Inc.12888-100Önceden MoBio
Kuru buzHerhangi birNA
DynaMag-2 mıknatısThermo Fisher Scientific12321D
EtanolVWR International LLC89125-188Diğer tedarikçilerin eşdeğeri ile ikame edilebilir.
Galon boyutlu dondurucu poşetleriZiplocNA, diğer tedarikçilerden eşdeğeri ile ikame edilebilir.
Gemini EM Mikroplaka OkuyucuMoleküler CihazlarEM96 oyuklu plakaları üstten okuyan başka bir florometre kullanabilir.
K2HPO4Sigma-AldrichP3786
KH2PO4Sigma-AldrichP5655
Laboratuvar önlüğüWorkriteJ1367Diğer tedarikçilerin eşdeğeri ile ikame edilebilir.
Sıvı N2Herhangi birNA, diğer tedarikçilerin eşdeğeri ile ikame edebilir.
Sıvı N2 dewarThermo Fisher Scientific4150-9000Diğer tedarikçilerin eşdeğeri ile ikame edilebilir.
Milli-Q ultra saf su arıtma sistemiMillipore SigmaSYNS0R0WW
Mini-santrifüjEppendorf5404000014
Moleküler dereceli suThermo Fisher Scientific4387937Diğer tedarikçilerden eşdeğeri ile ikame edilebilir.
HarçlarVWR International LLC89038-150Diğer tedarikçilerin eşdeğeri ile ikame edilebilir.
Nitril eldivenlerThermo Fisher Scientific19167032BDiğer tedarikçilerin eşdeğeri ile ikame edilebilir.
Kağıt havlularVWR International LLCBWK6212Diğer tedarikçilerden eşdeğeri ile ikame edilebilir.
PCR plaka sızdırmazlık filmiThermo Fisher ScientificNC9684493
PCR şerit tüpleriUSA Scientific1402-2700
PestlesVWR International LLC89038-166Diğer tedarikçilerden eşdeğeri ile ikame edilebilir.
Plastik spatulaLevGo, Inc.17211
Platin Sıcak Başlangıç PCR Master Mix (2x)Thermo Fisher Scientific13000014
PNA'lar - kloroplast ve mitokondriyalPNA BioNASırayı biyoinformatik olarak doğruladığınızdan emin olun
Koruyucu gözlükMillipore SigmaZ759015Diğer tedarikçilerin eşdeğeri ile ikame edilebilir.
Qubit 3.0 FlorometreThermo Fisher ScientificQ33216
Qubit dsDNA HS test kitiThermo Fisher ScientificQ32854
Lastik tokmak (isteğe bağlı)Ace Donanım2258622Diğer tedarikçilerin eşdeğeri ile değiştirilebilir.
Makas veya makasVWR International LLC89259-936Diğer tedarikçilerin eşdeğeri ile ikame edilebilir.
KürekEv Deposu2597400Diğer tedarikçilerin eşdeğeri ile ikame edilebilir.
Toprak karot toplayıcı (küçük çaplı: < 1 inç)Ben Meadows221700Diğer tedarikçilerin eşdeğeri ile ikame edilebilir.
Sprey şişeleriSanta Cruz Biotechnologysc-395278Diğer tedarikçilerin eşdeğeri ile ikame edilebilir.
Standart tuzdan arındırılmış barkodlu astarlar (10 & mikro; M) (Tablo 1)Standarttuzdan arındırma ile IDT NA 4 nmol Ultramer DNA Oligo. NGS adaptörü ve sıralama astarı (Tablo 1), v3 kimyası kullanılarak Illumina MiSeq ile kullanılmak üzere tasarlanmıştır.
ThermocyclerThermo Fisher ScientificE950040015Diğer tedarikçilerin eşdeğeri ile ikame edilebilir.
Triton X-100Sigma-AldrichX100Diğer tedarikçilerin eşdeğeri ile ikame edilebilir.
Tekneleri tartınSpektrum KimyasallarıB6001WDiğer tedarikçilerin eşdeğeri ile ikame edilebilir.
yerine kullanmayın

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Goodwin, S., McPherson, J. D., McCombie, W. R. Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies. Nat Rev Genet. 17 (6), 333-351 (2016).
  2. Soergel, D. A. W., Dey, N., Knight, R., Brenner, S. E. Selection of primers for optimal taxonomic classification of environmental 16S rRNA gene sequences. ISME J. 6 (7), 1440-1444 (2012).
  3. Takahashi, S., Tomita, J., Nishioka, K., Hisada, T., Nishijima, M. Development of a Prokaryotic Universal Primer for Simultaneous Analysis of Bacteria and Archaea Using Next-Generation Sequencing. PLoS One. 9 (8), e105592(2014).
  4. Poretsky, R., Rodriguez-R, L. M., Luo, C., Tsementzi, D., Konstantinidis, K. T. Strengths and Limitations of 16S rRNA Gene Amplicon Sequencing in Revealing Temporal Microbial Community Dynamics. PLoS One. 9 (4), e93827(2014).
  5. Sharpton, T. J. An introduction to the analysis of shotgun metagenomic data. Front Plant Sci. 5, 209(2014).
  6. Jiao, J. -Y., Wang, H. -X., Zeng, Y., Shen, Y. -M. Enrichment for microbes living in association with plant tissues. J Appl Microbiol. 100 (4), 830-837 (2006).
  7. Richter-Heitmann, T., Eickhorst, T., Knauth, S., Friedrich, M. W., Schmidt, H. Evaluation of Strategies to Separate Root-Associated Microbial Communities: A Crucial Choice in Rhizobiome Research. Front Microbiol. 7, 773(2016).
  8. Mahmoudi, N., Slater, G. F., Fulthorpe, R. R., Mahmoudi, N., Slater, G. F., Fulthorpe, R. R. Comparison of commercial DNA extraction kits for isolation and purification of bacterial and eukaryotic DNA from PAH-contaminated soils. Can J Microbiol. 5709, 623-628 (2011).
  9. Vishnivetskaya, T. A., et al. Commercial DNA extraction kits impact observed microbial community composition in permafrost samples. FEMS Microbiol Ecol. 87 (1), 217-230 (2014).
  10. Busby, P. E., et al. Research priorities for harnessing plant microbiomes in sustainable agriculture. PLoS Biol. 15 (3), e2001793(2017).
  11. Thompson, L. R., et al. A communal catalogue reveals Earth's multiscale microbial diversity. Nature. , (2017).
  12. Caporaso, J. G., et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. ISME J. 6 (8), 1621-1624 (2012).
  13. Kozich, J. J., Westcott, S. L., Baxter, N. T., Highlander, S. K., Schloss, P. D. Development of a Dual-Index Sequencing Strategy and Curation Pipeline for Analyzing Amplicon Sequence Data on the MiSeq Illumina Sequencing Platform. Appl Environ Microb. 79 (17), 5112-5120 (2013).
  14. Degnan, P. H., Ochman, H. Illumina-based analysis of microbial community diversity. ISME J. 6 (1), 183-194 (2012).
  15. Naylor, D., DeGraaf, S., Purdom, E., Coleman-Derr, D. Drought and host selection influence bacterial community dynamics in the grass root microbiome. ISME J. , (2017).
  16. Desgarennes, D., Garrido, E., Torres-Gomez, M. J., Peña-Cabriales, J. J., Partida-Martinez, L. P. Diazotrophic potential among bacterial communities associated with wild and cultivated Agave species. FEMS Microbiol Ecol. 90 (3), 844-857 (2014).
  17. Coleman-Derr, D., et al. Plant compartment and biogeography affect microbiome composition in cultivated and native Agave species. New Phytol. 209 (2), 798-811 (2016).
  18. De Tender, C., et al. Dynamics in the Strawberry Rhizosphere Microbiome in Response to Biochar and Botrytis cinerea Leaf Infection. Front Microbiol. 7, 2062(2016).
  19. Kapp, J. R., et al. Variation in pre-PCR processing of FFPE samples leads to discrepancies in BRAF and EGFR mutation detection: a diagnostic RING trial. J Clin Pathol. 68 (2), 111-118 (2015).
  20. Simbolo, M., et al. DNA qualification workflow for next generation sequencing of histopathological samples. PLoS One. 8 (6), e62692(2013).
  21. O'Neill, M., McPartlin, J., Arthure, K., Riedel, S., McMillan, N. Comparison of the TLDA with the Nanodrop and the reference Qubit system. J Phys Conf Ser. 307 (1), 012047(2011).
  22. Callahan, B. J., McMurdie, P. J., Rosen, M. J., Han, A. W., Johnson, A. J. A., Holmes, S. P. DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data. Nat Methods. 13 (7), 581-583 (2016).
  23. Amir, A., et al. Deblur Rapidly Resolves Single-Nucleotide Community Sequence Patterns. mSystems. 2 (2), e00191-e00116 (2017).
  24. Edgar, R. C. UNOISE2: improved error-correction for Illumina 16S and ITS amplicon sequencing. bioRxiv. , 081257(2016).
  25. Nguyen, N. -P., Warnow, T., Pop, M., White, B. A perspective on 16S rRNA operational taxonomic unit clustering using sequence similarity. NPJ Biofilms Microbiomes. 2, 16004(2016).
  26. Callahan, B. J., McMurdie, P. J., Holmes, S. P. Exact sequence variants should replace operational taxonomic units in marker-gene data analysis. ISME J. , (2017).
  27. Lundberg, D. S., Yourstone, S., Mieczkowski, P., Jones, C. D., Dangl, J. L. Practical innovations for high-throughput amplicon sequencing. Nat Methods. 10 (10), 999-1002 (2013).
  28. O'Brien, S. L., et al. Spatial scale drives patterns in soil bacterial diversity. Environ Microbiol. 18 (6), 2039-2051 (2016).
  29. Fierer, N., Lennon, J. T. The generation and maintenance of diversity in microbial communities. Am J Bot. 98 (3), 439-448 (2011).
  30. Fierer, N. Embracing the unknown: disentangling the complexities of the soil microbiome. Nat Rev Microbiol. 15 (10), 579-590 (2017).
  31. Buckley, D. H., Schmidt, T. M. Diversity and dynamics of microbial communities in soils from agro-ecosystems. Environ Microbiol. 5 (6), 441-452 (2003).
  32. Salter, S. J., et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biol. 12, 87(2014).
  33. Weiss, S., Amir, A., Hyde, E. R., Metcalf, J. L., Song, S. J., Knight, R. Tracking down the sources of experimental contamination in microbiome studies. Genome Biol. 15 (12), 564(2014).
  34. Sutlović, D., Definis Gojanović, M., Andelinović, S., Gugić, D., Primorac, D. Taq polymerase reverses inhibition of quantitative real time polymerase chain reaction by humic acid. Croat Med J. 46 (4), 556-562 (2005).
  35. Sutlovic, D., Gamulin, S., Definis-Gojanovic, M., Gugic, D., Andjelinovic, S. Interaction of humic acids with human DNA: proposed mechanisms and kinetics. Electrophoresis. 29 (7), 1467-1472 (2008).
  36. Aleklett, K., Leff, J. W., Fierer, N., Hart, M. Wild plant species growing closely connected in a subalpine meadow host distinct root-associated bacterial communities. PeerJ. 3, e804(2015).
  37. Bogas, A. C., et al. Endophytic bacterial diversity in the phyllosphere of Amazon Paullinia cupana associated with asymptomatic and symptomatic anthracnose. Springerplus. 4, 258(2015).
  38. Hiscox, J., Savoury, M., Müller, C. T., Lindahl, B. D., Rogers, H. J., Boddy, L. Priority effects during fungal community establishment in beech wood. ISME J. 9 (10), 2246-2260 (2015).
  39. Zhang, T., Yao, Y. -F. Endophytic Fungal Communities Associated with Vascular Plants in the High Arctic Zone Are Highly Diverse and Host-Plant Specific. PLoS One. 10 (6), e0130051(2015).
  40. Ghyselinck, J., Pfeiffer, S., Heylen, K., Sessitsch, A., De Vos, P. The effect of primer choice and short read sequences on the outcome of 16S rRNA gene based diversity studies. PLoS One. 8 (8), e71360(2013).
  41. Wintzingerode, F., Landt, O., Ehrlich, A., Göbel, U. B. Peptide nucleic acid-mediated PCR clamping as a useful supplement in the determination of microbial diversity. Appl Environ Microb. 66 (2), 549-557 (2000).
  42. Cruaud, P., Vigneron, A., Lucchetti-Miganeh, C., Ciron, P. E., Godfroy, A., Cambon-Bonavita, M. -A. Influence of DNA extraction method, 16S rRNA targeted hypervariable regions, and sample origin on microbial diversity detected by 454 pyrosequencing in marine chemosynthetic ecosystems. Appl Environ Microb. 80 (15), 4626-4639 (2014).
  43. Yang, B., Wang, Y., Qian, P. -Y. Sensitivity and correlation of hypervariable regions in 16S rRNA genes in phylogenetic analysis. BMC Bioinformatics. 17, 135(2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Root Microbiome16S rRNA SequencingSoil DNA ExtractionRhizosphere IsolationRoot EndosphereAmplicon Library PreparationPCR PurificationBacterial Community AnalysisPlant Microbiome ProfilingDNA Isolation Kit

Related Articles