Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Farelerde Resiniferatoksin ve Ağrı Testleri ile İntracerebroventriküler Tedavi

8.3K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/57570

⸱

2 Eylül 2020

 ,  , 
1Laboratory of Clinical Pharmacy and Pharmacology, Musashino University, 2Research Institute of Pharmaceutical Sciences, Musashino University

Bu makalede

Özet

Supraspinal bölgede geçici reseptör potansiyel vanilloid tip 1 (TRPV1) beyin fonksiyonubazı roller oynamak için önerilmiştir. Burada açıklanan farelerde supraspinal TRPV1 duyarsızlaştırma için resiniferatoxin intracerebroventriküler enjeksiyon için bir protokoldür. Bazı ağrı testleri için prosedürler de sunulmaktadır.

Özet

Geçici reseptör potansiyel vanilloid tip 1 (TRPV1), bir termosensit katyon kanalı, periferik sinirlerde ağrı tetiklediği bilinmektedir. Periferik işlevine ek olarak, beyin fonksiyonlarında katılımı da önerilmiştir. Ultragüçlü bir TRPV1 agonisti olan Resiniferatoksinin (RTX), TRPV1'in uzun süreli duyarsızlaşmasına neden olduğu bilinmektedir ve bu duyarsızlaştırma, TRPV1 ifade eden hücrelerin fizyolojik önemini araştırmak için alternatif bir yaklaşım olmuştur. Burada farelerde RTX ile intracerebroventricular (i.c.v.) tedavisi için bir protokol açıklıyoruz. Periferik TRPV1 stimülasyonu (RTX testi) ve mekanik stimülasyon (kuyruk basınç testi) sonra takip nosiception test etmek için prosedürler açıklanmıştır. RTX i.c.v. uygulanan farelerin nosiseptif yanıtları kontrol gruplarınınkilerle karşılaştırılabilir olmasına rağmen, RTX-i.c.v.-uygulanan fareler asetaminofenin analjezik etkisine duyarsız dı, bu da i.c.v. RTX tedavisinin supraspinal-selektif TRPV1 duyarsızlaşmasına neden olabileceğini düşündürmektedir. Bu fare modeli beyin / supraspinal fonksiyon TRPV1 rolünü incelemek için uygun bir deneysel sistem olarak kullanılabilir. Bu teknikler diğer ilaçların merkezi eylemlerinin çalışmalarına da uygulanabilir.

Giriş

Hayvanlar çevre sinirlerindeki sensörler aracılığıyla çevrelerinden çeşitli fiziksel ve kimyasal uyaranlar alırlar. Geçici reseptör potansiyel vanilloid tip 1 (TRPV1) ısı sensörleri1,,2olarak hareket eden termoduyar, selektif olmayan katyon kanallarından biridir ve TRPV1'in aktivasyonu ve/veya modülasyonunun hem normal hem de inflamatuar bağlamlarda nosisepsiyon için önemli bir adım olduğu bilinmektedir3. Genel ifade deseni tartışmalı olmasına rağmen, TRPV1 ekspresyonu da supraspinal bölgelerde önerilmiştir, çeşitli beyin aktivitelerine dahil olmak (nosiceptiondahil 4, termoregülasyon5, anksiyete6, dikkat eksikliği hiperaktivite bozukluğu7, ve epilepsi8). Ayrıca, son zamanlarda asetaminofen, yaygın olarak kullanılan ağrı kesici, merkezi TRPV1 aktivasyonu aracılık onun analjezik eylem ortaya çıkarmak için ileri sürülmüştür9,10.

Kapsaisin ve resiniferatoksin (RTX) dahil olmak üzere aşırı TRPV1 agonist uygulanması TRPV1-pozitif nöronların ölümüne ve TRPV1 agonistleri için uzun süreli duyarsızlaştırma11yol açar,12. Lokal uygulama ile birlikte (intrathecal13,14, intrasisternal15,16,17, ve intraganglional18), Bu kimyasal ablasyon yaklaşımı TRPV1 fizyolojik fonksiyonlarını araştırmak için alternatif bir yol sağlamıştır. Yakın zamanda RTX intracerebroventricular (i.c.v.) enjeksiyonunun farelerde asetaminofenin analjezik etkisini inhibe ettiğini, supraspinal-selektif TRPV1 duyarsızlaştırmayı önerdiğini bildirdik19. Bu yazıda i.c.v. enjeksiyonu ve sonraki ağrı testleri için kesin protokolü satıyoruz.

Beynin ventriküllerine doğrudan ilaç enjeksiyonu, herhangi bir çevresel etkiyi en aza iken onların merkezi etkilerini incelemeyi mümkün kılar. Burada sunulan i.c.v. enjeksiyon prosedürü Haley ve McCormick20tarafından bildirilen yöntemin bir değişikliktir. Bu yöntem koronal sütür yoluyla lateral ventriküliçine bir enjeksiyon iğnesi takılması içeren basit ve kanülasyon için herhangi bir özel ekipman veya cerrahi prosedürler gerektirmez.

TRPV1 agonistlerin periferik lokal uygulama yanma ağrı hissi ve nörojenik inflamasyon çağrıştırıyor. RTX ve TRPV1-KO fareler ile sistemsel olarak tedavi edilen fareler, bu uyarıma duyarsızdır13. RTX-i.c.v'de periferik TRPV1'in korunmasını doğrulamak için rtx (RTX testi) intraplantar enjeksiyonu yaptık. Fare. Bu yöntem konvansiyonel formalin testi21bir değişikliktir.

Bu fareler sistematik RTX ve TRPV1-KO fareler ile tedavi mekanik uyaranlara normal bir eşik göstermek bildirilmiştir11,13,22. Burada asetaminofen in analjezik etkisi değişiklikleri test etmek için kuyruk basınç testi için bir prosedür salıyoruz.

Tüm bu prosedürler ortodoks ve çok yönlüdür ve diğer ilaçların çalışmalarına uygulanabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Burada kullanılan tüm deneysel protokoller Musashino Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır. Erkek ddY fareler (SLC, Shizuoka, Japonya) su ve gıda reklam libitum ile deneyler önce 12-h ışık / karanlık döngüsü altında en az 7 gün tutuldu. Deneylerde 5 veya 6 haftalık fareler kullanıldı.

1. İlaçLarın Hazırlanması

  1. Rtx
    NOT: Alkollü RTX çözeltisi ciddi cilt yanıkları ve göz hasarına neden olabilir. Kullanım sırasında koruma için lastik eldiven ve gözlük kullandığınızdan emin olun. Bu stok çözeltisi 6 ay boyunca kullanılabilir.
    1. 1 mg RTX'e 500 μL etanol ekleyin.
    2. Yukarıdaki çözeltiye 500 μL polioksietilen (20) sorbitan monooleat ekleyin ve girdap iyi.
    3. Karışıma ve girdaba 4 mL fizyolojik tuz ekleyin.
    4. Aliquot 40 μL çözelti1,5 mL vidalı kapak tüpleri içine ve -40 °C'de saklayın.
  2. Asetaminofen
    1. 30 mg/mL konsantrasyonda asetaminofen %20 w/v propilenglikol çözeltisi ekleyin ve bir sonicator ile çözün. Asetaminofen çözünmeden birkaç saat sonra oda sıcaklığında çökeltme olabilir, kullanımdan hemen önce hazırlamak veya kullanıma kadar solüsyonu sıcak tutun.

2. RTX'in Subkutan veya İntracerebroventriküler Enjeksiyonu

  1. 1.1'de hazırlanan stoklanmış çözeltiyi eritin. yukarıda ve 20 μg /mL tuzlu veya yapay beyin omurilik sıvısı (ACSF) oluşan seyreltmek (mM): 119 NaCl, 2.5 KCl, 1 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 11 glikoz, 1.3 MgSO4, 2.5 CaCl2% 95 O2 ve% 5 CO2 (pH 7.2) ile dengelenmiştir.
  2. Pentobarbital sodyum tuzu (60 mg/kg, intraperitoneal) ile fareleranestezi ve sağ refleks kaybı olup olmadığını kontrol edin.
  3. S.c. tedavisi için, 0,1 mL/10 g vücut ağırlığı hacminde boyun arkasına RTX (20 μg/mL) enjekte edin. Kontrol grubu için araca (%10 etanol, %10 polioksietilen (20) sorbitan monooleat ve %80 tuzlu) enjekte edin.
  4. I.c.v. tedavisi için sağ lateral ventriküle 5 μL RTX (20 g/mL) enjekte edin. Kontrol grubu için araca (%10 etanol, %10 polioksietilen (20) sorbitan monoolelat ve %80 ACSF enjekte edin.
    1. İğnenin 3,0-3,5 mm ucunu ortaya çıkarmak için tek kullanımlık 27-G iğneyi metal bir tüpten (0,8 mm I.D.) geçirin(Şekil 1A).
    2. Fare nin başını %70 alkolle dezenfekte edin ve farenin squamosal kemiklerini parmaklarla sıkıca tutun(Şekil 1B).
      NOT: Bu çıkıntılar enjeksiyon için dönüm noktası olarak hizmet edecektir, çünkü skuatür çıkıntıların pozisyonlarına dikkat edin.
    3. İğneyi kafa derisiüzerinde yanal olarak hareket ettirin ve iğne ucu dikişüzerine bağlı olduğu için sagittal sütür bulun.
    4. Ucu yaklaşık 1 mm sağa taşıyın, sonra ucu rostrally taşıyın ve 2.4.3 ile koronal sütür bulun. (Şekil 1B).
    5. İğneyi yavaşça ve dikey olarak takın, RTX çözeltisini yaklaşık 10 saniye içinde enjekte edin ve yaklaşık 10 saniye tutun.
    6. İğneyi yavaşça çekin ve fareyi kafesine geri getirin. Kanama genellikle minimal veya yok. Büyük kanama oluşursa, başka bir fare kullanımı düşünülmelidir.
  5. Önceden işlenmiş fareleri RTX testi veya kuyruk basıncı testi için özne olarak atayın (Sırasıyla Adım 3 ve 4).

3. RTX Testi

NOT: Test 10:00 ile 17:00 arasında yapılır. Test odası 200 lux ve 24-26 °C'de muhafaza edilir.

  1. RTX (Step 2.) ile yapılan ön işlemlerden bir hafta sonra, fareleri teste başlamadan en az 60 dakika önce test odasına aktarın.
  2. Her fareyi tek tek pleksiglas bir kafese (29,5 × 17,5 × 13,5 cm3 yükseklik) en az 30 dk önce teste başlamadan önce yerleştirin ve çevreye alışmasını sağlamak için.
    NOT: Testlerin sırası tedavi öncesi gruplar arasında dengelenmelidir.
  3. Testten 20 dk önce fareye intraperitoneal 20 dk asetaminofen (300 mg/kg) uygulayın.
  4. Fareyi küçük bir bez torbada gevşek bir şekilde tutun ve sağ arka pençenin topuğunun içine 30 kalibrelik bir iğne yerleştirin. İğneyi subkutan olarak yürüyüş pedlerine doğru ilerletin ve 20 μL RTX çözeltisi (0,05 μg/mL) enjekte edin.
  5. Her 5-dk bloketkilenen pençe theglabrous bölgede yalama / ısırma davranışı süresini ölçün.

4. Kuyruk Basınç Testi

NOT: Akut mekanik nosisepsiyon eşiğini değerlendirmek için Randall-Selitto tipi basınç ölçer kullanılır. Test 10:00 ile 17:00 arasında yapılır. Test odası 200 lux ve 24-26 °C'de muhafaza edilir.

  1. RTX (Step 2.) ile yapılan ön işlemlerden bir hafta sonra fareleri test odasına aktarın ve her fareyi ayrı ayrı pleksiglas bir kafese takın ve yerleştirin.
  2. Kuyruk tabanından 1,5 ve 2,5 cm lekeleri işaretleyin.
  3. Fareyi küçük bir bez torbada gevşek tutun ve künt bir sondayla noktalara basınç uygulayın.
    NOT: Doku hasarını önlemek için 250 g kesme basıncı uygulanır.
  4. Kaçış davranışı (kuyruk çırpma, büküm ve gıcırdama) ortaya çıkarmak için gereken basıncı belirleyin ve iki noktada belirlenen basıncın ortalamasını alarak nosiseptif eşiği hesaplayın.
  5. Adımları 4.3'te yineleyin. 4.4'e kadar. her 15 dakika.
  6. Taban çizgisini aldıktan sonra, asetaminofen (300 mg/kg) fareye intraperitoneal olarak uygulayın. Yönetimden sonra, adımları 4.3'te tekrarlayın. ve 4.4 her 15 dk.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

I.c.v.-tedavi edilen farelerde görünümleri, spontan aktiviteleri, vücut ağırlığı19 ve çekirdek vücut ısılarında belirgin bir anormallik görülmez (Araçla tedavi edilen grup, 38.4 ± 0.3 °C, n = 6; RTX ile işlenmiş grup, 38.7 ± 0.2 °C, n = 6).

Şekil 2A-B, RTX'in intraplantar enjeksiyonuna s.c.- veya i.c.v.-tedavi edilen farelerin duyarlılığını gösterir. Araç ted...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu deneylerdeki en kritik adım i.c.v. enjeksiyonunun başarısıdır. Burada kullanılan i.c.v. enjeksiyon tekniği oldukça basittir ancak bazı pratik ler gerektirir. Deneylerden önce boyalarla pratik yapmak (örn. tuzluda %0,5 trypan mavisi) önerilir. Enjeksiyon doğru yapılırsa, koronal sütür üzerinde bir iğne izi belirgin olmalı ve enjekte edilen boya kontralateral ventrikül ve üçüncü ventrikül de bulunmalıdır. Ayrıca enjeksiyon sırasında zorla takılmaktan kaçınılmalıdır. İğne ucu koronal sütür üzerine doğru bir şekilde yerle...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar beyan etmek için çıkar çatışması var

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
S.c./i.c.v. ön işlemler ve RTX testi için kullanılanResiniferatoksinLKT LaboratuvarlarıR1774
AsetaminofenIWAKI SEIYAKUIWAKI SEIYAKU'dan hediye edildi
Anestezi için kullanılanPentobarbital sodyum tuzuTokyo Kimya EndüstrisiP0776
Etanol (99.5)Wako Pure Chemical Industries057-00456RTX'i çözmek için kullanılır
Polioksietilen(20) Sorbitan MonooleateWako Saf Kimya Endüstrileri161-21621
# 956'yı çözmek için kullanılır; ICVenjeksiyonu için kullanılanHamilton1702LT
100 & # 956; Plantar enjeksiyon için kullanılan L mikroşırıngaHamilton1710LT
26 gauge tek kullanımlık iğneICV enjeksiyonu için kullanılanTERUMONN-2613S
Plantar içi enjeksiyon için kullanılan30 gauge tek kullanımlık iğneNIPRO01134
basıncı testi için kullanılanbasınç ölçerUgo BasileAnaljezi Ölçer Tip 7200
, , RTX 25 & L mikroşırınga Kuyruk

Kaynaklar

  1. Cavanaugh, D. J., Chesler, A. T., Braz, J. M., Shah, N. M., Julius, D., Basbaum, A. I. Restriction of transient receptor potential vanilloid-1 to the peptidergic subset of primary afferent neurons follows its developmental downregulation in nonpeptidergic neurons. J Neurosci. 31 (28), 10119-10127 (2011).
  2. Caterina, M. J., Schumacher, M. A., Tominaga, M., Rosen, T. A., Levine, J. D., Julius, D. The capsaicin receptor: a heat-activated ion channel in the pain pathway. Nature. 389 (6653), 816-824 (1997).
  3. Caterina, M. J., et al. Impaired nociception and pain sensation in mice lacking the capsaicin receptor. Science. 288 (5464), New York, N.Y. 306-313 (2000).
  4. Starowicz, K., et al. Tonic endovanilloid facilitation of glutamate release in brainstem descending antinociceptive pathways. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 27 (50), 13739-13749 (2007).
  5. Gavva, N. R., et al. The vanilloid receptor TRPV1 is tonically activated in vivo and involved in body temperature regulation. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 27 (13), 3366-3374 (2007).
  6. Marsch, R., et al. Reduced anxiety, conditioned fear, and hippocampal long-term potentiation in transient receptor potential vanilloid type 1 receptor-deficient mice. Journal of Neuroscience. 27 (4), 832-839 (2007).
  7. Tzavara, E. T., et al. Endocannabinoids activate transient receptor potential vanilloid 1 receptors to reduce hyperdopaminergia-related hyperactivity: Therapeutic implications. Biological Psychiatry. 59 (6), 508-515 (2006).
  8. Nazıroğlu, M., Övey, İS. Involvement of apoptosis and calcium accumulation through TRPV1 channels in neurobiology of epilepsy. Neuroscience. 293, 55-66 (2015).
  9. Mallet, C., et al. TRPV1 in brain is involved in acetaminophen-induced antinociception. PloS one. 5 (9), 1-11 (2010).
  10. Barrière, D. A., et al. Fatty acid amide hydrolase-dependent generation of antinociceptive drug metabolites acting on TRPV1 in the brain. PloS one. 8 (8), e70690(2013).
  11. Jancsó, G., Kiraly, E., Jancsó-Gábor, A. Pharmacologically induced selective degeneration of chemosensitive primary sensory neurones. Nature. 270 (5639), 741-743 (1977).
  12. Szallasi, A., Blumberg, P. M. Vanilloid receptor loss in rat sensory ganglia associated with long term desensitization to resiniferatoxin. Neuroscience Letters. 140 (1), 51-54 (1992).
  13. Cavanaugh, D. J., et al. Distinct subsets of unmyelinated primary sensory fibers mediate behavioral responses to noxious thermal and mechanical stimuli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (22), 9075-9080 (2009).
  14. Jeffry, J. A., Yu, S. Q., Sikand, P., Parihar, A., Evans, M. S., Premkumar, L. S. Selective targeting of TRPV1 expressing sensory nerve terminals in the spinal cord for long lasting analgesia. PLoS ONE. 4 (9), e7021(2009).
  15. Jancsó, G. Intracisternal capsaicin: selective degeneration of chemosensitive primary sensory afferents in the adult rat. Neuroscience letters. 27 (1), 41-45 (1981).
  16. Gamse, R., Saria, A., Lundberg, J. M., Theodorsson-Norheim, E. Behavioral and neurochemical changes after intracisternal capsaicin treatment of the guinea pig. Neuroscience Letters. 64 (3), 287-292 (1986).
  17. Neubert, J. K., et al. Characterization of mouse orofacial pain and the effects of lesioning TRPV1-expressing neurons on operant behavior. Molecular pain. 4, 43(2008).
  18. Karai, L., et al. Deletion of vanilloid receptor 1-expressing primary afferent neurons for pain control. The Journal of clinical investigation. 113 (9), 1344-1352 (2004).
  19. Fukushima, A., Mamada, K., Iimura, A., Ono, H. Supraspinal-selective TRPV1 desensitization induced by intracerebroventricular treatment with resiniferatoxin. Scientific reports. 7 (1), 12452(2017).
  20. Haley, T. J., McCormick, W. G. Pharmacological effects produced by intracerebral injection of drugs in the conscious mouse. British journal of pharmacology and chemotherapy. 12 (1), 12-15 (1957).
  21. Tjølsen, A., Berge, O. G., Hunskaar, S., Rosland, J. H., Hole, K. The formalin test: an evaluation of the method. Pain. 51 (1), 5-17 (1992).
  22. Ohsawa, M., Miyabe, Y., Katsu, H., Yamamoto, S., Ono, H. Identification of the sensory nerve fiber responsible for lysophosphatidic acid-induced allodynia in mice. Neuroscience. 247, 65-74 (2013).
  23. Tanabe, M., Tokuda, Y., Takasu, K., Ono, K., Honda, M., Ono, H. The synthetic TRH analogue taltirelin exerts modality-specific antinociceptive effects via distinct descending monoaminergic systems. British journal of pharmacology. 150 (4), 403-414 (2007).
  24. Ono, H., et al. Reduction in sympathetic nerve activity as a possible mechanism for the hypothermic effect of oseltamivir, an anti-influenza virus drug, in normal mice. Basic & clinical pharmacology & toxicology. 113 (1), 25-30 (2013).
  25. Kauer, J. A., Gibson, H. E. Hot flash: TRPV channels in the brain. Trends in neurosciences. 32 (4), 215-224 (2009).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

İntraserebroventriküler EnjeksiyonResiniferatoksin TedavisiTRPV1 DesensitizasyonuFarelerde Ağrı TestleriKuyruk Basınç TestiRTX Nosisepsiyon TestiAsetaminofen AnaljezisiSupraspinal SeçiciFare NörofarmakolojisiTRPV1 Agonisti
Farelerde Resiniferatoksin ve Ağrı Testleri ile İntracerebroventriküler Tedavi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.