Yöntem makalesi

A11-pozitif β-amiloid Oligomer hazırlama ve değerlendirme sistemini kullanarak Dot Blot Analizi

11.3K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/57592

⸱

22 Mayıs 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Ningbo Key Laboratory of Behavioral Neuroscience, Zhejiang Provincial Key Laboratory of Pathophysiology, School of Medicine, Ningbo University, 2Li Dak Sum Yip Yio Chin Kenneth Li Marine Biopharmaceutical Research Center, Ningbo University, 3School of Materials Science and Chemical Engineering, Ningbo University

Bu makalede

Özet

Bu iletişim kuralı bir sentetik peptid vitro üzerinden Aβ reaksiyonlar hazırlamak için ve göreli Aβ oligomer miktarda analiz kurutma bir nokta tarafından değerlendirmek için açıklar.

Özet

Β-amiloid (Aβ) kendi kendine toplamları birleştirmek için içsel bir eğilim ile hidrofobik bir peptit var. Çeşitli toplamları arasında Aβ oligomer yaygın olarak Alzheimer hastalığı (Ah) devam eden önde gelen nörotoksin olarak kabul edilir ve reklam patogenezinde önemli olay olarak kabul edilir. Bu nedenle, Aβ oligomer inhibitörleri ateş önlemek ve hastalık değiştirme olarak geliştirilecek potansiyeline sahip reklam tedaviler. Ancak, farklı oluşumu protokollerin Aβ oligomer reaksiyonlar farklı özelliklere sahip yol açabilir. Ayrıca, etkili bir şekilde ekran Aβ1-42 oligomer inhibitörleri için pek çok yöntem değildir. A11 almışlarsa bir alt kümesiyle toksik Aβ1-42 oligomer Anti-paralel β-sayfa yapıları ile tepki verebilir. Bu protokol için biz nasıl bir sentetik Aβ1-42 peptid vitro bir A11-pozitif Aβ1-42 oligomer zengini örnekten hazırlamak için ve dot blot tarafından göreli A11-pozitif Aβ1-42 oligomer örneklerinde miktarda değerlendirmek için tarif analiz A11 ve Aβ1-42-belirli 6E10 antikorlar. Bu iletişim kuralını kullanan, A11-pozitif Aβ1-42 oligomer inhibitörleri de yarı kantitatif deneysel sonuçlar ekranlı.

Giriş

Alzheimer hastalığı (Ah) yaşlı insanlar dünya çapında1etkileyen en önemli nörodejeneratif hastalıklardan birisidir. β-amiloid (Aβ) anormal toplama reklam önde gelen patolojik etken olabilir yaygın olarak kabul edilir. Aβ toplamları Senil plakalar, bir reklam hastaların beyinlerinin biyolojik işaretleri ana bileşenleri vardır. Ayrıca, Aβ toplamları reaksiyonlar özellikle de dahil olmak üzere, reklam ilerledikçe nöronal ölüm sebebi olabilir güçlü nörotoksisite üretmek. Bu nedenle, Aβ oligomer oluşumu inhibisyonu ateş engelleyebilir ve Aβ oligomer inhibitörleri-var geliştirilen hastalığı olarak değiştirme AD tedaviler. Birçok çalışma sentetik Aβ peptid reaksiyonlar içinde vitroformu, türleri Morfoloji ve yapay Aβ reaksiyonlar yapıları keşfetmek ve vitro modelleri2,3 kullanarak Aβ oligomer inhibitörleri araştırmak için kullanılan , 4. ancak, farklı vitro oluşumu protokolleri Aβ oligomer oligomer farklı araştırma grupları arasında eşsiz sonuçlar neden olabilir farklı morfolojik özelliklere sahip yol açabilir. Bu nedenle, bir standart oluşumu protokol Aβ oligomer için acilen ihtiyacı vardı.

Şimdiye kadar çoğu yöntemleri doğrudan Aβ reaksiyonlar algılamak için rapor edilmiştir. İletim elektronik mikroskobu (TEM), Sigara denaturing Jel Elektroforez, enzim bağlı immunosorbent assay (ELISA) ve dot blot Analizi miktar ve/veya morfolojisi Aβ oligomer vitro5, incelemek için kullanılabilir 6. Örneğin, Morfoloji ve Aβ oligomer yapısını TEM içinde görülebilir. Göreli tutarları ve moleküler boyutu Aβ toplamalardan sigara denaturing jel elektroforez tarafından ölçülen. ELISA Aβ oligomer serum, plazma ve beyin dokusu özler belirlemek için kullanılabilir. Son olarak, dot blot analizi, algılamak için kullanılan bir teknik analiz ve proteinler, tanımlama Aβ oligomer farklı örneklerinde göreli yoğunlaşmasını oligomer ve Aβ özgü antikorlar yardımıyla değerlendirmek için kullanılabilir. Jel Elektroforez ve blotting yordamları jeller için gerekli değildir Ayrıca, tahlil kurutma bir nokta önemli zaman tasarrufu sunuyor. Bu nedenle, bu tahlil normalde ekran potansiyel Aβ oligomer inhibitörleri kullanılır. Bu iletişim kuralı genel amacı dot blot Analizi ve ekran Aβ oligomer Aβ1-42 oligomer miktarda çözümlenecek bir Aβ1-42 oligomer zengini örnek, hazırlamak için nispeten basit, güvenilir ve tekrarlanabilir bir yöntem tarif etmektir Yarı kantitatif deneysel sonuçlar kullanarak inhibitörleri.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. çözüm hazırlık

Not: Tablo malzemeleri reaktif kaynakları için bakın.

  1. %5 Sığır serum albumin (BSA) çözüm BSA 5 g çift distile su 100 mL için eklemek suretiyle hazırlamak. Onları tamamen vortexing tarafından mix onları. Çözüm 4 ° c ilâ 1 ay için saklayın.
  2. Bir anti-oligomer antikor A11 çözümü (1:1, 000) 10 mL % 5 BSA çözeltisi için antikor hisse senedi çözüm 10 µL ekleyerek hazırlayın. Onları tamamen vortexing tarafından mix onları. Çözüm 4 ° c ilâ 1 ay için saklayın.
  3. Bir anti-Aβ antikor 6E10 çözümü (1:1, 000) 10 mL % 5 BSA çözeltisi için antikor hisse senedi çözüm 10 µL ekleyerek hazırlayın. Tamamen vortexing tarafından mix onları. Çözüm 4 ° c ilâ 1 ay için saklayın.
  4. Bir anti-fibriler oligomer antikor OC çözümü (1:1, 000) 10 mL % 5 BSA çözeltisi için antikor hisse senedi çözüm 10 µL ekleyerek hazırlayın. Tamamen vortexing tarafından mix onları. Çözüm 4 ° c ilâ 1 ay için saklayın.
  5. Bir Tris arabelleğe alınmış serum fizyolojik (TBS) hisse senedi çözüm 24 g Tris tabanının ve 88 gr NaCl 1000 mL için çift distile su ekleyerek hazırlayın. PH 7.4 için ayarlayın. Çözüm 4 ° C'de 3 aya kadar saklayın.
  6. Tris arabelleğe alınmış serum ve ara-20 (TBST) çözüm ara-20 1 mL 100 mL TBS ekleyerek hisse senedi çözüm ve 900 mL çift distile su hazırlamak.
  7. Bir ikincil antikor çözüm horseradish ekleyerek 10 µL tarafından peroksidaz (HRP) keçi Anti-tavşan IgG (H + L) 10 mL TBST çözeltisi için hazır olun. Onları tamamen vortexing tarafından mix onları. Çözüm 4 ° c ilâ 1 ay için saklayın.
  8. Curcumin dimetil sülfoksit (10 mM curcumin hisse senedi çözüm oluşturmak için DMSO) 1 ml 3.68 g geçiyoruz.
  9. Sentetik Aβ1-42 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (2.5-mg/mL Aβ monomer çözüm oluşturmak için HFIP) 2 ml 5 mg geçiyoruz. 20 dk. yapmak 100 µL aliquots için oda sıcaklığında (25 ° C) yerleştirin ve 6 aya kadar-20 ° C'de depolayın.
    Not: Bu yordam kısa sürede çalıştırılması gerekir. Pipet ipuçları doğru pipetting emin olmak için kesilmiş.
  10. Electrochemiluminescence (ECL) sıvı hacim oranı 1:1 ECL sıvı A ve B karıştırarak hazırlayın. Bu çözüm sadece kullanmadan önce hazırlanmalıdır.

2. numune hazırlama

Not: 2 gün önce analiz kurutma nokta numune hazırlama gerçekleştirin.

  1. Çift distile su 900 µL Aβ1-42 monomer çözüm bir tüp için ekleyin; Aβ1-42 konsantrasyonu 0.25 mg/mL olacaktır. 20 dakika oda sıcaklığında karışımı yerleştirin.
  2. Hacmi yaklaşık 850 µL olana yüksek saflıkta azot gazı ile çözüm buharlaşır. Aβ1-42 çözüm konsantrasyonu 0.29 mg/mL hakkında olacak.
    Not: Çözüm zaman zaman HFIP tamamen buharlaşıp emin olmak için sarsılmış. Normalde, buharlaşma, 30 dk sonra kalan çözüm yaklaşık 850 µL birimdir.
  3. Curcumin hisse senedi çözüm curcumin çalışan bir çözüm (0.2 ve 2 µM) çift distile suyla seyreltik. Aβ1-42çözüm ve çözüm 1:1 bir hacim oranı ile çalışma curcumin karıştırın. Curcumin son konsantrasyonları 0,1 ve 1 µM.
    Not: Potansiyel oligomer inhibitörleri Aβ1-42 çözüm gerekirse herhangi bir oranda ile karışabilir.
  4. Çözüm, sürekli olarak bir manyetik karıştırıcı sallamak ( Tablo malzemelerigörmek).
    1. Manyetik karıştırıcı bir plastik ayırıcı kutusuna düzeltmek. Place 2 manyetik barlar kutusunun 2 köşesine heyecan ve örnek tüpler kutusunun ortasına yerleştirin.
    2. Kutusu, oda sıcaklığında (25 ° C) 48 h için salla.
      Not: Manyetik karıştırıcı hızını yaklaşık 60 rpm olduğunu.
  5. 4 ° C'de 15 dakika tüpler santrifüj kapasitesi ve 18.000 x g. süpernatant toplamak.

3. dot blot Analizi

Not: Tüm incubations üzerinde yatay bir shaker gerçekleştirilir.

  1. Nitroselüloz membran 1 cm genişliğinde şeritler halinde kesin.
    Not: Nitroselüloz membran genişliğini deneysel ihtiyaçlarına göre ayarlanabilir.
  2. 2-µL örnekleri eşit 2 şeritler (şerit 1 ve 2) 0.5 cm her noktası Aralık ile yerleştirin.
  3. Damlacık grup üzerinde kuru olana, oda sıcaklığında 5 min için şeritler yerleştirin.
  4. Şeritler, oda sıcaklığında 30 dk için %5 BSA çözüm ile kuluçkaya.
  5. Şeritler ile bir TBST çözüm 5 min için oda sıcaklığında durulayın.
  6. TBST çözüm Aspire edin. 1 h, oda sıcaklığında için şerit bir anti-oligomer antikor A11 çözüm 1 kuluçkaya ve 2 anti-Aβ antikor 6E10 çözümünü ile şerit.
  7. Şeritler bir TBST çözüm ile üç kez, her zaman oda sıcaklığında 5 min için durulayın.
  8. TBST çözüm Aspire edin. Şeritler, oda sıcaklığında 40 min için bir ikincil antikor çözüm ile kuluçkaya.
  9. Şeritler bir TBST çözüm ile üç kez, her zaman oda sıcaklığında 5 min için durulayın.
  10. Eşit karma ECL sıvı şeritler yüzey için geçerlidir. Şeritler görüntüleme sistemi bir otomatik Kemiluminesan maruz ( Tablo malzemelerigörmek).
    Not: Normalde, ECL sıvı 300 µL bir membran yeter. Membran pozlama sırasında nemli tutulmalıdır. Pozlama süresi görüntüleme sistem tarafından otomatik olarak hesaplanır.
  11. Yarı kantitatif sonuçları elde etmek için ImageJ (Ulusal Sağlık Enstitüleri) veya başka bir görüntü işleme yazılımı kullanarak bir gri tonlamalı analizi yapmak.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Aβ1-42 monomer hazırlık sonra bir Aβ1-42 oligomer oluşturmak olup olmadığını araştırmak için TEM analizi kullanıldı. Hiçbir görünür toplamları HFIP çözünmüş Aβ1-42 monomer örnek (Şekil 1A) tespit edildi. Ayrıca, esas olarak küresel toplamları çapında 10-80 nm gözlendi Aβ1-42 örnekte sallayarak, 48 saat sonra Aβ1-42 reaksiyonlar hazırlık (Şekil 1B

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu protokol için bir yöntem Aβ1-42 oligomer içeren numune hazırlama ve analiz kurutma bir nokta tarafından A11-pozitif Aβ1-42 oligomer miktarda çözümlemek için bildirdin. Bizim yöntemleri Aβ1-42 oligomer zengini örnekleri hazırlanması için oldukça basit, güvenilir ve tekrarlanabilir olmakla birlikte, hala fark gereken bazı noktalar vardır. İlk olarak, HFIP sentetik Aβ1-42 peptid dağıtmak için kullanılır. Bir araya getirilmiş Aβ1-42 peptid monomer HFIP çözüm içine sök...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Bu eser Ulusal Doğal Bilim Vakfı, Çin'den (U1503223, 81673407, 21475131), kar amacı gütmeyen teknoloji Zhejiang Eyaleti (2016 C 37110), Ningbo uluslararası bilim ve teknoloji üzerinde uygulamalı araştırma projesi hibe tarafından desteklenmiştir İşbirliği projesi (2014D 10019), yaşam bilimleri ve sağlık (2015C 110026), Ningbo bilim ve teknoloji proje yaygın zenginlik (2017C 50042), Li Dak toplamı Yip Yio çene Kenneth Li Marine biyofarmasotik Kalkınma Fonu için Ningbo Belediye yenilik ekibinin, ve Ningbo Üniversitesi'nde K. C. Wong Magna fonu.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
A11 (ab126892 Rb pAb ila Amiloid Oligomerleri)AbcamGR91739-58
6E10 (beta-Amiloid Tavşan Ab)Hücre  Sinyalizasyon Teknolojisi2454S
OC (Anti-Amiloid Fibriller OC Antikoru)MilliporeAB2286
Yaban Turpu Peroksidaz (HRP) İşaretleyici Keçi anti tavşan IgG (H + L)  BeyotimeA0208
A ve beta; 1-42< / sub>GL Biochem52487
1,1,1,3,3,3-Hexafiuoro-2-propanolAladdinI1523078
CurcuminSigmaC1386
Albümin Sığır VSolarbioA8020
Sodyum klorürSangon BiotechD920BA0003
Sodyum dodesil sülfatSCR30166428
TRISSolarbioT8060
GlisinSolarbioG8200
  Dimetil sülfoksitSolarbioD8370
5 kez; denatüre olmayan jel PAGE Protein MarkerBeyotimeP0016
Genshare CFAS anyKD PAGEGenshareJC-PE022
Saf Nitroselüloz Blotting MembranPall CorporationT50189
MetanolSCR10014118
EtanolSCR10009218
Süper düşük aralık  protein MarkerSolarbioPR1300
Transfer MembranlarıImmobilon-PSQISEQ00010
BeyoECL StarBeyotimeP0018A
Commassie Blue Hızlı boyama çözümüBeyotimeP0017
Hepsi otomatik kemilüminesans görüntüleme sistemiTanonTanon 5200
Image JNational Sağlık
Görüntü işleme yazılımıAdobePhotoshop CS6
Manyetik karıştırıcıŞangay Huxi
Enstitüleri

Kaynaklar

  1. Lauren, J. Cellular prion protein as a therapeutic target in Alzheimer's disease. Journal of Alzheimer's Disease. 38 (2), 227-244 (2014).
  2. De Maio, A., Rivera, I., Cauvi, D. M., Arispe, N. Modulation of amyloid peptide oligomerization and toxicity by extracellular Hsp70. Biophysical Journal. 112 (3), 444(2017).
  3. Di Scala, C., Chahinian, H., Yahi, N., Garmy, N., Fantini, J. Interaction of Alzheimer's beta-amyloid peptides with cholesterol: mechanistic insights into amyloid pore formation. Biochemistry. 53 (28), 4489-4502 (2014).
  4. Xiang, S. Y., et al. Fucoxanthin inhibits beta-amyloid assembly and attenuates beta-amyloid oligomer-induced cognitive impairments. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 65 (20), 4092-4102 (2017).
  5. Chang, L., et al. Protection against beta-amyloid-induced synaptic and memory impairments via altering beta-amyloid assembly by bis(heptyl)-cognitin. Scientific Reports. 5, 10256(2015).
  6. Yam, G. H. F., et al. In vitro amyloid aggregate forming ability of TGFBI mutants that cause corneal dystrophies. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (9), 5890-5898 (2012).
  7. Tomaselli, S., et al. The alpha-to-beta conformational transition of Alzheimer's A beta-(1-42) peptide in aqueous media is reversible: A step by step conformational analysis suggests the location of beta conformation seeding. ChemBioChem. 7 (2), 257-267 (2006).
  8. Shigemitsu, Y., et al. Nuclear magnetic resonance evidence for the dimer formation of beta amyloid peptide 1-42 in 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol. Analytical Biochemistry. 498, 59-67 (2016).
  9. Khan, M. V., Rabbani, G., Ahmad, E., Khan, R. H. Fluoroalcohols-induced modulation and amyloid formation in conalbumin. International Journal of Biological Macromolecules. 70, 606-614 (2014).
  10. Fang, F., et al. 5-hydroxycyclopenicillone, a new beta-amyloid fibrillization inhibitor from a sponge-derived fungus trichoderma sp HPQJ-34. Marine Drugs. 15 (8), 260(2017).
  11. Shiao, Y. J., Su, M. H., Lin, H. C., Wu, C. R. Echinacoside ameliorates the memory impairment and cholinergic deficit induced by amyloid beta peptides via the inhibition of amyloid deposition and toxicology. Food & Function. 8 (6), 2283-2294 (2017).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Amiloid Beta OligomeriA11 AntikoruBeta amiloid Haz rlamaKurkumin nhibisyonuTEM G r nt lemeKemil minesans TespitSekonder AntikorTBST Y kamaNitroksel loz Membran

İlgili makaleler