Yöntem makalesi

Polysome LEISHMANIA, insan hücreleri ve fare Testis profil oluşturma

DOI:

10.3791/57600

⸱

8 Nisan 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cell Biology and Biochemistry, Texas Tech University Health Sciences Center, 2Department of Biological Sciences, Texas Tech University, 3CISER (Center for the Integration of STEM Education & Research), Texas Tech University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Polysome profil çıkarma tekniği genel amacı, protein sentezi sırasında translasyonel etkinlik bireysel mRNA'ların veya transcriptome mRNA'ların analizidir. Protein sentezi yönetmelik, çeviri harekete geçirmek ve baskı sağlık ve birden çok insan hastalıkları için önemli bir yöntemdir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uygun protein ifade doğru zamanda ve doğru miktarda normal hücre işlevi ve hızla değişen bir ortamda hayatta kalma temeli budur. Uzun süre, gen ifade çalışmalar araştırma transkripsiyon düzeyde hakim. Ancak, mRNA'ların kararlı durum düzeyleri de protein üretimi ile ilişkilendirmek değil ve mRNA'ların translatability büyük ölçüde koşullarına göre değişiklik gösterebilir. LEISHMANIA, parazit gibi bazı organizmalarda protein ifade çoğunlukla translasyonel düzeyinde düzenlenmiştir. Son çalışmalar bu protein çeviri bozukluk kanser, metabolik, nörodejeneratif ve diğer insan hastalıkları ile ilişkili olduğunu gösterdi. Polysome profil oluşturma protein çeviri düzenleme eğitim için güçlü bir yöntemdir. Bu çeviri bir genom geniş ölçekte incelemek veya bireysel mRNA'ların translasyonel durumunu ölçmek için sağlar. Bu teknik polizomlar, ribozom, onların alt birimleri ve ücretsiz mRNA'ların sırasında Santrifüjü bir sitoplazmik, sukroz degrade lysate ayrılması temelidir. Burada, üç farklı modellerde - kullanılan bir evrensel polysome profil oluşturma iletişim kuralı parazit LEISHMANIA büyük, kültürlü insan hücreleri ve hayvan dokuları mevcut. LEISHMANIA hücrelerin serbestçe süspansiyon büyümesine ve fare testis bir hayvan doku örneği temsil ederken kültürlü insan hücreleri yapisan monolayer içinde büyür. Böylece, bu kaynakların tümüne adapte bir tekniktir. Protokolü polysomal kesirler analizi için algılama düzeylerinin bireysel mRNA tarafından RT-qPCR, proteinler tarafından Western blot ve Elektroforez tarafından ribozomal RNA'ların analizini içerir. Yöntemi daha da derin RNA-seq tarafından transcriptome düzeyde bir ribozom mRNA'ların ilişkilendirmesiyle incelenmesi ve analiz ribozom ilişkili proteinlerin tarafından kesirler kütle spektroskopisi tarafından uzatılabilir. Yöntem diğer biyolojik modelleri kolaylıkla ayarlanabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücrelerde gen ifadesinin düzenlenmesi transkripsiyon, posttranscriptional ve ardından mekanizmaları tarafından kontrol edilir. Derin RNA sıralama gelişmeler genom geniş ölçekli bir benzeri görülmemiş düzeyde kararlı durum mRNA düzeylerinin çalışma izin. Ancak son bulgular kararlı durum mRNA düzeyi her zaman protein üretim1,2ile ilişkilendirmek değil ortaya. Bireysel bir transkript kaderi çok karmaşıktır ve iç/dış uyaranlara, stres, vbgibi birçok faktöre bağlıdır. Protein sentezi sırasında gen ifade Yönetmeliği ifade kontrol değişen koşullarına hızlı bir yanıt için gerekli bir başka bir katmanı sağlar. Polysome (ya da "polyribosome") profil oluşturma, ayrılık ve görselleştirme aktif ribozomlar, çeviri tür protein sentezi ile çalışmak için güçlü bir yöntemdir. Rağmen ilk deneysel uygulamaları 1960'larda3' te çıktı, polysome profil oluşturma şu anda en önemli teknikler protein çeviri çalışmaları4biridir. Tek mRNA'ların bir polysome oluşumu için önde gelen birden fazla ribozom tarafından tercüme edilebilir. Transkript ribozomlara sikloheksimit5 üzerinde durdu ve mRNA'ların polizomlar farklı numaralar içeren polysome ayırma sürecinde Sükroz degrade ultrasantrifüj6,7 tarafından ayrılabilir , 8 , 9. polysomal kesirler RNA analiz sonra genom geniş ölçekte ve farklı fizyolojik şartlarda4,7, sırasında değişiklik translasyonel bireysel mRNA'ların durumlarında ölçüm sağlar 10. yöntem da kullanılmıştır 5' UTR ve 3' UTR serilerinde mRNA translatability11kontrolünü rollerini ortaya çıkarmak, miRNAs translasyonel baskı12rolünü incelemek, ribozom biyongenezi13 kusurları ortaya çıkarmak için ve ribozom ilişkili proteinler ile insan hastalıkları14,15rolünü anlamak. Son on yılda, büyüyen bir rol için çeviri sırasında gen ifade Yönetmeliği insan hastalıkları önemini gösteren ortaya çıkmıştır. Kanser, metabolik translasyonel denetiminde ve nörodejeneratif hastalıklar için kanıt ezici15,16,17,18' dir. Örneğin, bozukluk eIF4E bağımlı translasyonel denetiminin katkıda otizm ile ilgili açıkları15 ve FMRP, ribozom mRNA'ların otizm14' e bağlı üzerinde durdurduklarını ilgilenmektedir. Böylece, polysomal profil oluşturma birden çok insan hastalıkları translasyonel yönetmelikte hataları incelemek için çok önemli bir araçtır.

Protein analizi farklı fizyolojik koşullar altında polysomal kesirler çeviri sırasında ribozomlar ile ilişkili faktörler fonksiyonunun olduğu inceliyor. Maya, memeli hücreleri, bitkiler ve tek hücreli10,19,20,21de dahil olmak üzere birçok canlı türünün polysome profil çıkarma tekniği kullanılmıştır. Protozoon parazitler Trypanosoma ve LEISHMANIA gibi gen ekspresyonu sınırlı transkripsiyon kontrolü sergi. Onların genleri organizatörü düzenlenir transkripsiyon22eksikliği polycistronic gen kümeler halinde düzenlenir. Bunun yerine, gelişimsel gen ekspresyonu ağırlıklı olarak protein çeviri ve mRNA istikrar trypanosomatid türler23,24düzeyinde kontrol edilir. Bu nedenle, transkripsiyon yönetmelik yokluğunda translasyonel kontrol anlayışı bu organizmalar için özellikle önemlidir. Polysomal profil oluşturma posttranscriptional düzenleme LEISHMANIA25,26,27,28gen ifadesinde, eğitim için güçlü bir araçtır.

Bireysel mRNA'ların düzeyleri gerçek tarafından algılanması son sürüyor kantitatif PCR (RT-qPCR) ve yeni nesil sıralama yanı sıra proteomik teknolojileri tarafından tam transcriptome zaman, çözünürlük ve polysomal yeni bir seviyeye profil oluşturma avantajlarını getiriyor. Bu yöntemlerin kullanımı daha da derin RNA sıralama hücreleri bir genom geniş ölçekte translasyonel durumunu izlemek için proteomik analizi ile birlikte bireysel polysomal kesirler analizi ile genişletilebilir. Bu çeviri farklı fizyolojik ve patolojik şartlar altında düzenleyen yeni moleküler oyuncular tanımlamasını sağlar. Burada, üç farklı modellerde kullanılan iletişim kuralı profil oluşturma bir evrensel polysome mevcut: parazit LEISHMANIA büyük, kültürlü insan hücreleri ve hayvan dokuları. Biz mevcut tavsiye farklı organizmalar, degrade koşullardan optimizasyonu, seçim RNase inhibitörleri ve RT-qPCR, Western blot ve RNA Elektroforez polysome kesirler bu çalışmada analiz etmek için uygulama üzerinden cep lysates hazırlanması.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm hayvan tedaviler ve işleme dokuların çalışmada elde edilen Kurumsal hayvan bakım ve Texas Tech Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi Ulusal Enstitüleri uygun olarak kullanım Komitesi tarafından onaylanmış protokolleri göre yapıldı Sağlık hayvan refahı kuralları, protokol numarası 96005. Lütfen omurgalı hayvanlar kurban ve kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi doku yönergelere göre hazırlayın. Böyle bir komite eksik, lütfen Ulusal Sağlık Enstitüleri hayvan refahı yönergelere bakın. Yetişkin (> 60 gün eski) C57BL/6 fareler kullanılmıştır. Tüm hayvanlar ve doku kurumsal hayvan bakım ve Texas Tech Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi Ulusal Sağlık Enstitüleri hayvan refahı yönergelere uygun olarak kullanım Komitesi tarafından onaylanmış protokolleri göre elde edilmiştir. Ötenazi için tek bir fare küçük bir odaya yerleştirildi ve hava yavaş yavaş ile yaklaşık % 30 yerinden karbondioksit anestezi ve hayvan kırılmasını en aza indirmek için. Nefes kesilmesi ölüm hayvan dokuları hasat önce onaylamak için servikal çıkığı kullandık.

Dikkat: Tüm iş ile canlı LEISHMANIA ve kültürlü insan hücreleri Biyogüvenlik BSL-2 sertifikalı dolap yapıldı.

1. hazırlanması sitoplazmik Lysates LEISHMANIA büyük , kültürlü insan hücreleri ve fare dokular

Not: Farklı kaynak malzemelerden lysate müstahzarları çeşitli farklar vardır. Sükroz degrade hazırlık ve polysomal ayırma da dahil olmak üzere diğer adımlar aynıdır ve örnek kaynağında bağlı değildir.

  1. LEISHMANIA büyük sitoplazmik lysate hazırlık
    1. LEISHMANIA büyük (FV1 zorlanma) hücrelerin % 10 Fetal sığır Serum (FBS) ve penisilin/streptomisin karışımı içeren 1 x M199 orta29 30 ml aşılamak (100 adet ve 100 μg/mL buna bağlı olarak), 1 x 105 hücre/mL yoğunluğu .
      Not: LEISHMANIA büyük hücreleri içeren tüm adımları bir biyogüvenlik kabini yürütülmelidir.
    2. Hücreleri da kuluçka makinesine koyun ve onları büyümek 27 ° C'de logaritmik faz kadar (5 x 106 hücre/mL günlük karşılık gelir). Genellikle büyümeye yaklaşık iki gün sürer.
    3. Sikloheksimit LEISHMANIA büyük kültür 100 μg/mL çevrilmiş mRNA'ların üzerinde ribozom tutuklamak için son bir konsantrasyon için ekleyin. Kuluçka makinesi 27 ° C'de 10 dakika geri hücreleri yerleştirmek
    4. Sikloheksimit tedavi tamamlandıktan sonra hücre 50 mL konik tüp aktarmak ve onları 1800 x g ve 8 dk. atma süpernatant için 4 ° C, spin.
    5. Dulbecco'nın fosfat tamponlu tuz (DPBS) 30 mL hücrelerle yıkayın. 8 dk santrifüj 1800 x g ve 4 ° C.
    6. Süpernatant atmak. 1 mL DPBS hücrelerde resuspend.
    7. Bir aliquot hücre alıp % 3,5 formaldehit çözüm ile karıştırın.
    8. Hemasitometre tarafından hücreleri saymak ve onların konsantrasyonu belirlemek. Hücreler için istediğiniz sayıyı microfuge tüp içine aktarın. Lysate 0.5x108-2 x 108 hücre/mL hazırlanmış bir Sükroz degrade yükleme için yeterli olur.
    9. Hücreleri 1800 x g de spin ve 4 ° C 8 dakika süreyle süpernatant atın.
    10. Hücre Pelet lizis arabellek proteaz inhibitörleri ve RNase inhibitörü (20 mM HEPES-KOH, pH 7.4, 100 mM KCl, 10 mM MgCl2, 2 mM DTT, %1 NP-40, 1 x proteaz inhibitörü kokteyl (EDTA içermeyen), 200 adet/mL RNase inhibitörü) içeren 1 ml buzda resuspend.
    11. Lysate 23'lik iğne ile üç kez geçmek. Lysate iğne geçitten sonra şeffaf hale gelmelidir.
    12. Santrifüj 11,200 x g ve 4 ° C lysate açıklamak için 10 dakika için. Açıklanan transfer lysate için yeni bir tüp ve sukroz degrade ultrasantrifüj kadar buz üzerinde tutun.
    13. Toplamak, lysate (daha sonra analiz etmek için) giriş olarak 400-500 μL hemen gelecekteki protein analizi için sıvı azot Dondur veya RNA analizi için buz gibi önce RNA arıtma reaktif ekleyin.
  2. Kültürlü insan HeLa hücreleri sitoplazmik lysate hazırlık
    1. HeLa hücreleri bölme ve onları 20 mL % 10 FBS ve penisilin/streptomisin karışımı içeren DMEM orta tohum (100 adet ve 100 μg/mL buna bağlı olarak) hücre ile 2 x 105 hücre/mL bir 15 cm tabak içinde saymak.
    2. 37 ° c, % 5 CO2 20-24 h. gerçekleştir plazmid DNA transfection göre üreticinin iletişim kuralları için HeLa hücreleri büyümek.
    3. Transfection 37 ° c, % 5 CO2sonra hücreler 24 h için yaymak.
    4. Sikloheksimit 100 μg/mL çevrilmiş mRNA'ların üzerinde ribozom tutuklayın ve hücreler için 10 dk. 37 ° c, % 5 CO2kuluçkaya son konsantrasyonu için yetiştirilen HeLa hücreleri ekleyin. Orta Aspire edin. Buz soğuk DPBS iki kez hücrelerle yıkayın.
    5. Lizis arabelleği (20 mM HEPES-KOH pH 7.4, 100 mM KCl, 5 mM MgCl2, 1 mM DTT, %0,5 NP-40, 1 x proteaz inhibitörü kokteyl (EDTA-free), 200 adet/mL RNase inhibitörü veya 1 mg/mL heparin) 500 μL plakasına eklemek ve hücreleri üzerinde buz kazımak.
    6. Lysed hücre microfuge tüp aktarın. NP-40 konsantrasyonu % 0,5 ve MgCl2 ' ye göre örnek artan hacmi 5 mM için ayarlayın.
    7. Lysate 23'lik iğne ile 3 - 6 kez geçmek.
    8. 11,200 x g de ve 4 ° C lysate netleştirmek 8 min için spin. Santrifüjü sonra yeni bir tüp süpernatant aktarın. Bir Spektrofotometre hücre lizis etkinliğini değerlendirmek ve yükleme için örnek miktarına geçişin belirlemek için kullanın. 10 μL örnek %0,1 0.5 mL için eklemek Sodyum Lauryl Sülfat (SDS). % 0.1 SDS karşı boş. Ölçmek Absorbans 260 nm. Beklenen Absorbans değerdir etrafında 15-20 adet/mL.
    9. Tüm örnekleri ile lizis arabelleğe Sükroz degrade Santrifüjü önce aynı Absorbans değeri oranında seyreltin. Buz üzerinde örnekleri Sükroz degrade Santrifüjü kadar tutun.
  3. Fare testislerden sitoplazmik lysate hazırlık
    1. Fare testis incelemek. Küçük bir insizyon attım tunica albuginea yapmak ve testis seminifer tübüllerin toplamak ve 5 mL 0,1 mM phenylmethylsulfonyl florür (PMSF) ile birlikte DPBS de içeren bir 15 mL konik tüp aktarmak.
    2. Doku birkaç kez ters çevirme tarafından kuvvetle karıştırın. Doku birim ağırlık buz üzerinde 5 min için yerleşmek izin verir.
    3. Kaldırmak ve bağ hücre ve doku parçaları içeren bulutlu arabellek atın. Yordam 2-3 kez daha tekrarlayın. Kalan beyaz Pelet seminifer tübüllerin ve germ hücreleri için zenginleştirilmiştir.
    4. Seminifer tübül Pelet 2 mL microcentrifuge tüp aktarmak ve 500 x g 1 dk. spin süpernatant atın.
    5. Lizis arabelleği (20 mM Tris-HCl, pH 7.4, 100 mM KCl, 5 mM MgCl2, 1 mM DTT, %0,5 NP-40, 1 x proteaz inhibitörü kokteyl (EDTA içermeyen), 1 mg/mL heparin veya RNase inhibitörü 200 adet/mL) 500 µL tübüllerin için ekleyin. Doku triturate için bir pipet kullanın.
    6. Süspansiyon küçük ve aktarım (0.5-1.0 mL) Dounce homogenizer. Yedi ya da sekiz darbeleri cam havaneli ile doku bozabilir.
    7. Lysate 1.5 mL microcentrifuge tüp aktarın.
    8. Örneği 12.000 x g ve lysate temizlemek 8 dk 4 ° C'santrifüj kapasitesi. Süpernatant yeni tüp ve mağaza buza Sükroz degrade yükleme kadar aktarın.
    9. Lysate giriş örnek olarak, 50 μL toplamak, bu hemen gelecek protein analizi için-80 ° C'de dondurmak; veya RNA analizi için buz gibi önce RNA arıtma reaktif ekleyin.

2. Sükroz degrade hazırlık ve ultrasantrifüj

  1. % 10 Sükroz veya % 50 Sükroz içeren iki Sükroz degrade Çözümleri (20 mM HEPES-KOH, pH 7.4, 100 mM KCl, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT, 1 x proteaz inhibitörü kokteyl), hazır olun. (Tris-HCl, pH 7.4, HEPES yerine kullanılabilir). 200 adet/mL RNase inhibitörü veya 1 mg/mL heparin deneysel tasarım göre ekleyin. Bir ultracentrifuge tüp SW 41 rotor için işaretleyici bloğu içine yerleştirin ve blok üst düzey çizgi çizin. Tüp istikrarlı bir raf aktarın.
  2. Bir 10 mL şırınga bağlı katman aygıtı ile almak ve % 10 Sükroz çözüm (yukarıdaki gibi hazırlanmış) ile şırıngaya doldur. Yavaşça işareti tüp ulaşana kadar ultracentrifuge tüp alt kısmında bõrakõn.
  3. % 50 Sükroz çözüm ile başka bir şırıngaya doldur ve dikkatle tüpün dibine % 10 Sükroz katmanı yoluyla onun katmanlama aygıtını takın. Yavaşça işareti tüp ulaşana kadar Alttan başlayarak Sükroz çözüm serbest bırakın. Sağlanan kapaklı tüp kapatın.
  4. Sükroz degrade hazırlamak için degrade makinesi aygıtı ONaçın. Yukarı veya aşağı düğmelerini kullanarak plaka seviye ve DONEtuşuna basın. Tesviye geçişin doğrusallık için önemlidir.
  5. Plaka tesviye sonra GRAD degrade menüsünü açmak için tuşuna basın. Degrade menüsünden liste gidin ve SW 41 Ti rotor seçin. Sonra istenen Sükroz degrade yukarı ve aşağı düğmelerini kullanarak menü listesinden seçin. Basın kullanın.
  6. Degrade boru tutucu degrade makinesi tabağa yerleştirin. Tüp tutucu aktarın. Aynı anda en fazla 6 degradeler hazırlanabilir. Basın çalıştırmak. Degrade makinesi programlanmış hızlı ve doğrusal gradyan oluşturan açıları tüpler döner. Degrade hazırlamak için sadece birkaç dakika sürer.
  7. İşlem tamamlandığında, tüpler bir rafa yerleştirin. Kapaklar çıkar. Aynı birim numune hacmi olarak ultracentrifuge tüpler tepesinden kaldırın.
  8. Dikkatle lysate 15-20 A260 adet polizomlar üst içeren 400-500 μL yükleyin. Tüpler rotor kovaları getirin ve onları dengesi.
  9. Santrifüj 260.000 x g ve 4 ° C 2 h SW 41 rotor kullanarak için.

3. polysome ayırma ve örnek koleksiyonu

Not: lysate hazırlıklar kaynağına bağlı olarak bazı farklar varken, degrade hazırlık ve polysome ayırma iletişim kuralları her türlü lysates aynıdır.

  1. Ultrasantrifüj tamamlanmasından sonra rotor kova tüpler ile Buza koyun. Kesir toplayıcı ve degrade fractionator ONaçmak. İnceden inceye gözden geçirmek fractionator menüsünde'i tıklatın. Bir raf 24 koleksiyonu tüpler kesir toplayıcı koymak.
  2. Yan tarafında fractionator deiyonize su ile durulama su deposu doldurmak. 10 için DURULAMA tuşuna basın s fractionator üzerinde pompa durulayın. Pistonu kalibrasyon için su ile dolu şırınga ile durulama adaptörü takın.
  3. Fractionator yazılım bilgisayar açın. Basın kalibre. Varsayılan ayarları kullanın ve OKtuşuna basın. Şırıngadan suyu enjekte etmeye hazır ol.
  4. Kalibrasyon yapmak için Tamam tuşuna basın. Hemen sonraki 5 için su enjekte başlatmak s. Bu süre içinde su UV dedektörü akışı cep akacaktır ve enstrüman kalibre. İşareti Sıfır Kalibrasyon tamamlandı görünür. Araç ayırma için hazırdır.
  5. Durulama adaptör şırınga ile kaldırın. Bir ipucu fractionator piston için ekleyin.
  6. Pirinç hava Vana ve basın hava anahtarı 10 için aç s kuru boru ve akış hücre. Hava vanayı kapat.
  7. Yavaşça rotor kova degrade tüpü çıkarması ve rafa yerleştirin. Boru tutucu kap tüp uygulamak ve dikkatle tüp tüp yuvasına taşımak ve konumda kilit.
  8. Yer tutucu fractionator piston altında. Çoğu zaman, polysomal bantları gözle görülebilir. Kesir sayıları ve birim için istenen ayarları tanıtmak (500 μL/kısmını 24 kesirler genellikle yeterlidir). Dosyayı uygun şekilde adlandırın. Tamam, sonra Gitmek için grafik düğmesini tuşuna basın. Bir sonraki pencerede Başlat taramatuşuna basın. Ayarları görünür, Tamam'ıtıklatın. Toplayıcı ilk kesir için cilt payı hareket edecek ve piston tüpün içine taşınır. Piston üst geçişin ulaştığında seçili hızını yavaşlatır ve kesirler toplanacaktır. Rapor tamamlandığında, piston degrade tüp dışına taşır.
  9. Pirinç hava Vana ve basın hava anahtar son kesir almak için fractionator üzerinde açın.
  10. Tüpler raf buz üzerinde hareket ettirin.
  11. 2 cilt RNA arıtma reaktif her kesir ve flash için sıvı azot RNA arıtma kadar dondurmak ekleyin. Alternatif olarak, protein çözümlenmesi gerekiyorsa, onları Western Blot (bkz. Bölüm 8) konsantre için % 10 son konsantrasyon trichloroacetic asit ekleyin.

4. mRNA'ların seviyeleri sırasında RT-qPCR veri analizi normalleştirme için sentetik RNA In Vitro hazırlanması

Not: E. coli OmpA mRNA normalleştirme için bu protokol için kullanılır. MRNA'ların okudu organizmanın ile kapsamlı kimlik yok diğer RNA (memeli veya LEISHMANIA) kullanılabilir.

  1. Standart bir PCR reaksiyon gelen OmpA gene30içeren bir plazmid tarafından SP6 organizatörü içeren OmpA DNA parçası hazırlamak.
  2. 100 µL karışımı hazırlayın: 80 mM HEPES-KOH, pH 7.5, 16 mM MgCl2, 2 mM Spermidine, 10 mM DTT, 3 mM ATP, 3 mM CTP, 3 mM UTP, 3 mM GTP, 0.5 U/μL RNase inhibitörü, 1 μg OmpA PCR DNA, 3 μL SP6 RNA polimeraz , 0.005 U/μL pyrophosphatase.
  3. 2 h için 40 ° C'de kuluçkaya.
  4. RNA, RNA arıtma paketi tarafından arındırmak.
  5. Konsantrasyon Spektrofotometre tarafından ölçmek ve özel Jel Elektroforez tarafından inceleyin.

5. RNA izolasyonu degrade kesirler ve cDNA hazırlık

Not: bir RNase inhibitörü ribonükleaz inhibitör kullandıysanız doğrudan bu iletişim kuralı için RNA arıtma ile devam edin. Ancak, ribonükleaz inhibitör kullanıldığında, heparin transkriptaz cDNA hazırlanmasında kullanılan yapılmasını engeller. Bu nedenle, heparin lizis tampon ve degrade kullanıldıysa RNA'ın ek arıtma gerekli olacaktır. Bkz. Bölüm 6 heparin kullandıysanız RNA cDNA sentezi için hazırlamak için.

  1. RNA arıtma reaktif içeren örnekleri çözülme, 20 eklemek ng RT-qPCR sonuçları normalleştirme için iç kontrol olarak sentetik RNA'ın. Bir değişiklik dışında üreticinin protokolüne göre RNA hazırlık ile devam edin. RNA sınıf glikojen (20 µg) önceki isopropanol bulutlu 1 µL ekleyin. 20-25 µL RNase free su RNA granül geçiyoruz.
    Not: Glikojen bir taşıyıcı olarak hizmet vermektedir ve kayıpları önlemek ve arıtma sırasında RNA Pelet görselleştirmek için yardımcı olur. OmpA mRNA daha fazla normalleştirme RT-qPCR reaksiyonlarda kullanılır.
  2. RNA konsantrasyonu yeterli verim sağlamak için Spektrofotometre kullanarak ölçmek. 40'lı, 60'ların ve monosomes prepolysomes olarak içeren RNA kesirler eşit miktarda birleştirin. 2-4 ribozomlara içeren kesirleri ışık polizomlar birleştirmek ve 5-8 ribozomlar olan kesirleri ağır polizomlar birleştirir.
  3. 5-10 µL RNA kombine kesirler üzerinden bir seti kullanarak ve üreticinin önerilerini takip cDNAs hazırlamak için kullanın.
  4. Nükleaz boş su 80 µL cDNA 20 µL için ekleyin. CDNA örnekleri-20 ° C'de dondurmak

6. RNA arıtma Heparin kontaminasyonu üzerinden

Not: Heparin nükleik asit enzimler transkriptaz gibi işleme engeller. Heparin lizis arabellek ve/veya Degrade kullanıldığında bu nedenle, bu ek arıtma iletişim kuralını kullanın.

  1. LiCl 1 M son konsantrasyonu arıtılmış RNA örnekleri için ekleyin.
  2. Örnekleri mix ve 1 h için buz üzerinde kuluçkaya.
  3. 16.000 x g ve 4 ° C'de 15 dakika örnekleri spin.
  4. Süpernatant mümkün olduğu bir pipet kullanarak tamamlanmış olarak kaldırın.
  5. Yaklaşık 5 dakika için granül kuruması.
  6. Granül RNase free su ilk hacmi yeniden askıya alma.
  7. 260 spektrofotometrik ölçüm gerçekleştirmek nm RNA konsantrasyonu belirlemek için. Genellikle, örnek kaybı en az düzeydedir.

7. RT-qPCR ve mRNA dağıtım veri analizi

  1. Birleştirmek su, 20 μL SYBR yeşil, gen belirli astar (2,5 μM kümesi) 4,8 μL 10.2 μL, cDNA 5 μL, iyice karıştırın ve triplicates bir kuyu başına 10 μL 384-şey plaka yüklemek.
  2. Levha yapıştırıcı film ile sıkı bir şekilde kapak ve 1800 x g 5 min için plaka santrifüj kapasitesi.
  3. Bir gerçek zamanlı PCR enstrüman kullanarak qPCR reaksiyon Tablo 1' de gösterilen şartlar altında ayarlayın.
  4. Döngüsü eşik (CT) kullanarak değerleri ve karşılaştırmalı CT (ΔΔCT) yöntemi31 yüzdesi (%) olarak açıklanan32 bir değişiklik ile prepolysomes, hafif ve ağır polizomlar mRNA dağılımının hesaplama. Sentetik RNA (burada OmpA) veri normalleştirme RT-qPCR veri analizi için kullanın. Sentetik RNA göreli mRNA'ların düzeylerini hesaplama ve karşılaştırmak onları bir degrade farklı kesirler görüntüleyen bir normalleştirme denetimi sağlar.

8. analiz Western Blot tarafından Polysomal kesirler proteinlerin

  1. %100 (w/v) stoktan seçilen kesirler (500 μL) son konsantrasyonu % 10, trichloroacetic asit (TCA) eklemek almak için en az 15 dk, bir microfuge santrifüje 5 min için buz üstünde, süpernatant atmak, iki kez buz gibi soğuk aseton ile yıkayın ve S 25 μL içinde erimesi DS-sayfa örnek yükleme arabellek Elektroforez için.
  2. SDS-sayfa yükleme ve PVDF membran için aşağıdaki transferi ile standart Elektroforez kuralları. Western Blot33için devam edin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmada, biz üç farklı kaynaklardan polysomal profil çıkarma tekniği uygulamaya tarif: parazit LEISHMANIA büyük, kültürlü insan hücreleri ve fare testis. Süspansiyon içinde sıvı ortamda serbestçe LEISHMANIA hücrelerin büyümesine, kültürlü insan hücreleri yapisan monolayer Tabaklarda büyümek ve fare testis doku örneği temsil eder. Yöntem, süspansiyon, farklı dokuların veya başka bir organizmadan ve kültürlü hücrelerinin farklı türleri serbestçe yetişkin hücrelerinde ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Polysome ayırma Sükroz degrade tarafından RNA ile kombine ve kesirler protein analizi bireysel mRNA'ların veya tüm translatome translasyonel durumunu yanı sıra translasyonel düzenleyen protein etkenler rolleri analiz etmek için güçlü bir yöntemdir makine normal fizyolojik veya hastalık durumu sırasında. Polysomal profil oluşturma nerede transkripsiyon kontrolü büyük ölçüde yoktur ve gen ifade düzenlemesi çoğunlukla oluşur LEISHMANIA de dahil olmak üzere trypanosomatids gibi organizmalar translasyonel yönetmelikt...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar Ching Lee ses kaydı ile yardım için teşekkür. Araştırma Texas Tech Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi Start-up fonlarından desteklenen bir durumdu ve Center of Excellence translasyonel Neuroscience ve tedavi (CTNT) tarafından PN-CTNT 2017-05 AKHRJDHW A.L.K. için vermek; NIH grant tarafından kısmen K.Z. James C. Huffman ve Kristen R. Baca R01AI099380 CISER (kök Tümleştirme eğitim ve Araştırma Merkezi) bilim adamları vardı ve program tarafından desteklenen edildi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
< güçlü > Aletler: < / güçlü >
Gradyan ustasıBiocomp Instruments Inc.108
Pistonlu Gradyan FraksiyonlayıcıBiocomp Instruments Inc.152
Kesir koleksiyoncusuGilson, Inc.FC203B
NanoDrop BirThermo ScientificNanoDrop Bir
Nikon ters mikroskopNikonECLIPSE Ts2-FL/Ts2
2720 TermalDöngüleyici Life Technologies tarafından Uygulamalı Biyosistemler4359659
CO2 inkübatörüPanasonic Healthcare Co.MCO-170A1CUV
HERATHERM kuluçka makinesiThermo Scientific51028063
Biyolojik Güvenlik Kabini, sınıf II, tip A2NuAire Inc.NU-543-400
Revco dondurucuRevco TechnologiesULT1386-5-D35
Beckman L8-M UltracentifugeBeckman CoulterL8M-70
SantrifüjEppendorf5810R
SantrifüjEppendorf5424
Ultrasantrifüj Rotor SW41Beckman Coulter331362
Döner kova rotoruEppendorfA-4-62
Sabit açılı rotorEppendorfF-45-30-11
Quant Studio 12K Flex Real-Time PCR makinesi 285880228Yaşam teknolojilerine göre Uygulamalı Biyosistemler4470661
TC20 Otomatik hücre sayacıBio-Rad145-0102
HematitometreHausser Scientific02-671-51B
Yazılım 
Triax yazılımı Biocomp Instruments Inc.
< güçlü > Malzemeler: < / güçlü >
sayma slaytları, hücre sayacı için çift bölmeliBio-Rad145-0011
1.5 mL mikrosantrifüj tüpüUSA Scientific1615-5500
Üstü açık policlear santrifüj tüpleri, (14 mm x 89 mm)Seton Scientific7030
Şırınga, 5 mLBD
BD Şırınga 3 mL23 Ölçer 1 İnç İğneBD10020439
Nunclon Delta Yüzey plakası, 14 cmThermo Scientific168381
Nunclon Delta Yüzey plakası, 9 cmThermo Scientific172931
Nalgene hızlı akışlı 90 mm filtre ünitesi, 500 mL, 0,2 aPESThermo Scientific569-0020
BioLite 75 cm3 şişeleriThermo Scientific130193
Nunc 50 mL konik santrifüj tüpleriThermo Scientific339653
Kimyasallar: < / güçlü >
Trizol LSAmbion by Yaşam Teknolojileri10296028
HEPESFisher ScientificBP310-500
Trizma bazSigmaT1378-5KG
Dulbecco'nun Modifiye Eagle'ın Orta-yüksek glikozu (DMEM)SigmaD6429-500ML
Fetal Sığır Serumu (FBS)SigmaF0926-50ML
Penisilin-Streptomisin (P / S)SigmaP0781-100ML
Lipofektamin 2000Invitrogen11668-019
Dulbecco'nun fosfat tamponlu salin ( DPBS)SigmaD8537-500ML
Magnezyum klorür hekzahidrat (MgCl2x6H2O)Acros OrganicsAC413415000
Potasyum Klorür (KCl)SigmaP9541-500G
Nonidet P 40 (NP-40)Fluka (Sigma-Aldrich)74385
Rekombinant Rnasin Ribonükleaz İnhibitörüPromegaN2511
Heparin sodyum tuzuSigmaH3993-1MU
cOmplete Mini EDTA içermeyen proteaz inhibitörleriRoche Diagnostics11836170001
GlikojenThermo ScientificR0551
SuSigmaW4502-1L
SikloheksimidSigmaC7698-1G
KloroformFisher Scientific194002
Ditiyokreitol (DTT)Fisher ScientificBP172-5
Etidyum BromürFisher ScientificBP-1302-10
Etilendiamintetraasetik asit disodyum dehidrat (EDTA)Fisher ScientificS316-212
OptimemYaşam Teknolojileri22600050
Puromisin dihidroklorürSigmaP8833-100MG
SükrozFisher ScientificS5-3KG
Tripsin-EDTA çözeltisiSigmaT4049-100ML
Hgh Kapasite cDNA Ters Transkriptaz Kiti4368814ile Uygulamalı Biyosistemler
SYBR Green PCR Master MixYaşam teknolojileri ile Uygulamalı Biyosistemler4367659
HClFisher ScientificA144SI-212
İzopropanolFisher ScientificBP26324
Potasyum Hidroksit (KOH)Sigma221473-500G
Anti-RPL11 antikoruAbcamab79352
Ribozomal protein S6 (C-8) antikoruSanta Cruz Biyoteknoloji A.Ş.sc-74459
1xM199SigmaM0393-10X1L
Lityum kloridSigmaL-9650
Dimetil sülfoksit (DMSO)Fisher ScientificD128-500
Jel Yükleme Tamponu IIThermo ScientificAM8546G
UltraPure AgarozThermo Scientific16500-100
Triklorasetik asit (TCA)Fisher ScientificA322-100
SuperSignal West Pico PLUS kemilüminesan substratThermo Scientific34580
FormaldehitFisher ScientificBP531-500
Sodyum Dodesil Sülfat (SDS)SigmaL5750-1KG
Fenilmetilsülfonil florür (PMSF)SigmaP7626-5G
RNeasy Mini kitiQiagen74104
Adenozin 5 asal, -trifosfat disodyum tuzu hidrat (ATP)SigmaA1852-1VL
Sitozin 5'-trifosfat disodyum tuzu hidrat (CTP)SigmaC1506-250MG
Üridin 5'-trifosfat trisodyum tuzu hidrat (UTP)SigmaU6625-100MG
Guanozin 5'-trifosfat sodyum tuzu hidrat (GTP)SigmaG8877-250MG
SP6 RNA PolimerazNEBM0207S
PirofosfatazSigmaI1643-500UN
SpermidinSigmaS0266-1G
309646 Yaşam Teknolojileri Power

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Schwanhausser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).
  2. Capewell, P., et al. Regulation of Trypanosoma brucei Total and Polysomal mRNA during Development within Its Mammalian Host. PLoS One. 8 (6), e67069(2013).
  3. Warner, J. R., Knopf, P. M., Rich, A. A multiple ribosomal structure in protein synthesis. Proceedings of the National Academy of Science, USA. 49, 122-129 (1963).
  4. Piccirillo, C. A., Bjur, E., Topisirovic, I., Sonenberg, N., Larsson, O. Translational control of immune responses: from transcripts to translatomes. Nature Immunology. 15 (6), 503-511 (2014).
  5. Ennis, H. L., Lubin, M. Cycloheximide: Aspects of Inhibition of Protein Synthesis in Mammalian Cells. Science. 146 (3650), 1474-1476 (1964).
  6. Masek, T., Valasek, L., Pospisek, M. Polysome analysis and RNA purification from sucrose gradients. Methods in Molecular Biology. 703, 293-309 (2011).
  7. Gandin, V., et al. Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale. Journal of Visualized Experiments. (87), (2014).
  8. Zuccotti, P., Modelska, A. Studying the Translatome with Polysome Profiling. Methods in Molecular Biology. 1358, 59-69 (2016).
  9. Chasse, H., Boulben, S., Costache, V., Cormier, P., Morales, J. Analysis of translation using polysome profiling. Nucleic Acids Research. 45 (3), e15(2017).
  10. Arava, Y., et al. Genome-wide analysis of mRNA translation profiles in Saccharomyces cerevisiae. Proceedings of the National Academy of Science, USA. 100 (7), 3889-3894 (2003).
  11. Gandin, V., et al. nanoCAGE reveals 5' UTR features that define specific modes of translation of functionally related MTOR-sensitive mRNAs. Genome Research. 26 (5), 636-648 (2016).
  12. Bazzini, A. A., Lee, M. T., Giraldez, A. J. Ribosome profiling shows that miR-430 reduces translation before causing mRNA decay in zebrafish. Science. 336 (6078), 233-237 (2012).
  13. Zanchin, N. I., Goldfarb, D. S. Nip7p interacts with Nop8p, an essential nucleolar protein required for 60S ribosome biogenesis, and the exosome subunit Rrp43p. Molecular Cell Biology. 19 (2), 1518-1525 (1999).
  14. Darnell, J. C., et al. FMRP stalls ribosomal translocation on mRNAs linked to synaptic function and autism. Cell. 146 (2), 247-261 (2011).
  15. Gkogkas, C. G., et al. Autism-related deficits via dysregulated eIF4E-dependent translational control. Nature. 493 (7432), 371-377 (2013).
  16. Robichaud, N., Sonenberg, N. Translational control and the cancer cell response to stress. Curr Opin Cell Biol. 45, 102-109 (2017).
  17. Gordon, B. S., Kelleher, A. R., Kimball, S. R. Regulation of muscle protein synthesis and the effects of catabolic states. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 45 (10), 2147-2157 (2013).
  18. Ishimura, R., et al. RNA function. Ribosome stalling induced by mutation of a CNS-specific tRNA causes neurodegeneration. Science. 345 (6195), 455-459 (2014).
  19. Petersen, C. P., Bordeleau, M. E., Pelletier, J., Sharp, P. A. Short RNAs repress translation after initiation in mammalian cells. Molecular Cell. 21 (4), 533-542 (2006).
  20. Juntawong, P., Girke, T., Bazin, J., Bailey-Serres, J. Translational dynamics revealed by genome-wide profiling of ribosome footprints in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Science, USA. 111 (1), E203-E212 (2014).
  21. Bunnik, E. M., et al. Polysome profiling reveals translational control of gene expression in the human malaria parasite Plasmodium falciparum. Genome Biology. 14 (11), R128(2013).
  22. De Gaudenzi, J. G., Noe, G., Campo, V. A., Frasch, A. C., Cassola, A. Gene expression regulation in trypanosomatids. Essays in Biochemistry. 51, 31-46 (2011).
  23. Alves, L. R., Goldenberg, S. RNA-binding proteins related to stress response and differentiation in protozoa. World Journal of Biological Chemistry. 7 (1), 78-87 (2016).
  24. De Pablos, L. M., Ferreira, T. R., Walrad, P. B. Developmental differentiation in Leishmania lifecycle progression: post-transcriptional control conducts the orchestra. Current Opinions in Microbiology. 34, 82-89 (2016).
  25. Soto, M., et al. Cell-cycle-dependent translation of histone mRNAs is the key control point for regulation of histone biosynthesis in Leishmania infantum. Biochemical Journal. 379, 617-625 (2004).
  26. McNicoll, F., et al. Distinct 3 '-untranslated region elements regulate stage-specific mRNA accumulation and translation in Leishmania. Journal of Biological Chemistry. 280 (42), 35238-35246 (2005).
  27. Folgueira, C., et al. The translational efficiencies of the two Leishmania infantum HSP70 mRNAs, differing in their 3 '-untranslated regions, are affected by shifts in the temperature of growth through different mechanisms. Journal of Biological Chemistry. 280 (42), 35172-35183 (2005).
  28. Dumas, C., Chow, C., Muller, M., Papadopoulou, B. A novel class of developmentally regulated noncoding RNAs in Leishmania. Eukaryotic Cell. 5 (12), 2033-2046 (2006).
  29. Kapler, G. M., Coburn, C. M., Beverley, S. M. Stable transfection of the human parasite Leishmania major delineates a 30-kilobase region sufficient for extrachromosomal replication and expression. Molecular Cell Biology. 10 (3), 1084-1094 (1990).
  30. Karamyshev, A. L., Johnson, A. E. Selective SecA association with signal sequences in ribosome-bound nascent chains: a potential role for SecA in ribosome targeting to the bacterial membrane. Journal of Biological Chemistry. 280 (45), 37930-37940 (2005).
  31. Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).
  32. Panda, A. C., Martindale, J. L., Gorospe, M. Polysome Fractionation to Analyze mRNA Distribution Profiles. Bio Protocols. 7 (3), (2017).
  33. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular Cloning. A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).
  34. Patrick, A. E., Karamyshev, A. L., Millen, L., Thomas, P. J. Alteration of CFTR transmembrane span integration by disease-causing mutations. Molecular Biology of the Cell. 22 (23), 4461-4471 (2011).
  35. Kleizen, B., van Vlijmen, T., de Jonge, H. R., Braakman, I. Folding of CFTR is predominantly cotranslational. Molecular Cell. 20 (2), 277-287 (2005).
  36. van den Elzen, A. M., Schuller, A., Green, R., Seraphin, B. Dom34-Hbs1 mediated dissociation of inactive 80S ribosomes promotes restart of translation after stress. EMBO Journal. 33 (3), 265-276 (2014).
  37. Morita, M., et al. mTOR Controls Mitochondrial Dynamics and Cell Survival via MTFP1. Molecular Cell. 67 (6), 922-935 (2017).
  38. Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

S kroz GradyanUltrasantrif jasyonLizat Haz rlamaFraksiyon ToplamaRNA AnaliziWestern BlotRibozom li kisiTranslasyon Reg lasyonuModel Organizmalar

İlgili makaleler