Yöntem makalesi

5-Aminolevulinik asit-aracılı Fotodinamik Tedavi etkisi Staphylococcus aureus biyofilm çalışmaya bir In Vitro modeli

7.2K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/57604

⸱

16 Nisan 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery, Eye & ENT Hospital, Shanghai Key Clinical Disciplines of otorhinolaryngology, Fudan University, 2Key Laboratory of Medical Molecular Virology of Ministries of Education and Health, Department of Medical Microbiology and Parasitology, School of Basic Medical Science, Shanghai Medical College of Fudan University, 3Department of Dermatology, Huashan Hospital, Fudan University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Bu el yazması antimikrobiyal etkisi 5-Aminolevulinik asit-aracılı Fotodinamik Tedavi (ALA-PDT) Staphylococcus aureus biyofilm çalışmaya protokolünü açıklar. Bu iletişim kuralı bakteriyel biyofilmler PDT ile tedavisinde gelecekte çalışmaya bir vitro model geliştirmek için kullanılabilir.

Özet

Staphylococcus aureus Piyojenik ve sistemik enfeksiyonlar neden olan ortak bir insan patojen (S. aureus) olduğunu. S. aureus enfeksiyonları sadece antibiyotik dirençli suşların ortaya çıkması değil, aynı zamanda formu biyofilmler kabiliyeti nedeniyle ortadan kaldırmak zordur. Son zamanlarda, Fotodinamik Tedavi (PDT) biyofilm enfeksiyonları kontrol etmek için potansiyel tedavilerden biri olarak bildirilen. Ancak, çalışmalar daha fazla bakteri biyofilmler yanı sıra temel mekanizmaları üzerindeki etkisi ile ilgili bilgilerimizi artırmak için gerekir. Bu el yazması PDT ile 5-Aminolevulinik asit (5-ALA), gerçek photosensitizer, protoporfirin IX (PpIX) bir habercisi bir içinde vitro modeli açıklar. Kısaca, S. aureus olgun biyofilmler ALA ile inkübe ve ışığa maruz. Daha sonra antibakteriyel etkisi ALA-PDT S. aureus biyofilm birimleri (CFUs) oluşturan colony hesaplayarak sayılabilir ve floresan mikroskobu (CLSM) tarama confocal lazer ile boyama canlılık tarafından görüntülenmiştir. Temsilcisi sonuçları ALA-PDT S. aureus biyofilmler üzerinde güçlü bir antibakteriyel etkisi gösterdi. Bu iletişim kuralı basit ve S. aureus biyofilmler ALA-PDT ile tedavisinde çalışmaya bir vitro model geliştirmek için kullanılabilir. Gelecekte, bu da diğer dezenfeksiyon minimal ayarlamaları ile farklı bakteri suşları için kullanan PDT çalışmalarda baþvurulabilir.

Giriş

S. aureus deri ve Mukoza insan ana colonizes önemli bir gram-pozitif patojen var. Form biyofilmler kabiliyetini onun Patogenez1önemli bir yönü olarak kabul edilir. Bakteriyel biyofilmler bakterilerin polisakkarit, DNA ve protein de dahil olmak üzere hücre dışı polimer maddelerden oluşan kendi ürettiği dizey içinde gömülü bir topluluğuz. Bu matris bakteriyel enfeksiyonlar, insan bağışıklık sistemi ve geçerli anti-mikrobiyal terapileri2direnci yüksek düzeyde katkıda bulunmak ve önemli bir rol oynar. Antibiyotik etkisi biyofilmler sınırlı olmakla birlikte antibiyotikler hala biyofilm enfeksiyonlar, büyük tedavisi vardır. Daha önce biyofilmler hücrelerde 10 - 1000 kat daha fazla onların planktonik karşıtları3' e göre antibiyotiklere dayanıklıdır gösterilmiştir. Böylece, alternatif stratejileri bu sorun fethetmek için ihtiyaç vardır.

PDT, bakteriyel enfeksiyonlar için alternatif bir tedavi dezenfeksiyon etkinleştirmek için uygun bir dalga boyunda ışık kullanır. Bu Reaktif oksijen türleri (ROS), hücre duvarı engellemeden, enzimler ihracı ve DNA4zarar hedef hücreler için ölümcül olan üretim yol açar. Bu çoklu hedef özelliği bakteri PDT tedaviye karşı direnç geliştirmeye güçleştirir.

Antimikrobiyal etkisi PDT toluidin mavi gibi birden fazla dezenfeksiyon ile bakteri ve mantar biyofilmler, malakit yeşil, metilen mavisi, klor e6 ve porfirinler, önceki raporlar5,6'eğitim gördü, 7,8,9,10,11,12,13. 5-ALA, gerçek photosensitizer, PpIX, prodrug, küçük molekül ağırlıklı ve hızlı geçiş izni12,14ile karakterizedir. Bu avantajları ALA-PDT büyük potansiyel terapötik bir uygulama olarak vermek. ALA-PDT planktonik bakteriler üzerindeki etkisi birçok gruplar12tarafından çalışılmıştır rağmen bakteriyel biyofilmler ALA-PDT antimikrobiyal etkisi henüz aydınlatılmamıştır değil. Bu arada, önceki çalışmalar arasında karşılaştırılması zordur. Nedenlerinden biri farklı protokoller farklı gruplar tarafından kullanılır. Böylece, bu protokol üzerinde bizim önceki çalışma15dayalı bir ALA-PDT sisteminin bir vitro modeli açıklar. Bu model etkisini CFU hesaplama ve CLSM ile boyama canlılık tarafından doğrulandı.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. biyofilm oluşumu

  1. 96-şey Mikroplaka biyofilm oluşumu
    1. S. aureus zorlanma USA300 ve-80 ° C'de depolanan 3 biyofilm oluşturmayan klinik suşları (C1 - C3) almak
      Not: Yetenek biyofilmler microtiter plaka tahlil tarafından belirlendi forma klinik suşların daha önce15açıklanan.
    2. 5 mL tryptone soya suyu (TSB) ortamda bakteri aşılamak ve 37 ° c durağan faz ile gecede sallayarak ile bir kuluçka yetiştirmek.
    3. 4000 x g 25 ° C'de 10 dakika için de gecede bakteri kültürü santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın. Fosfat tamponlu tuz (PBS) 2.0 x 10 son bir konsantrasyon için granül resuspend9 CFU/mL.
      Not: Bakteri konsantrasyonu optik yoğunluk ölçerek tahmini ve daha fazla plaka tarafından belirlenen 1.5 x 1016o 1 OD600 bulunan süspansiyon, ifşa, Sayın8 CFU/mL.
    4. 1: 200 için bakteriyel süspansiyon seyreltik (1.0 x 107 CFU/mL) % 0.5 glukoz içeren içinde TSB orta. 200 µL bakteriyel süspansiyon, bir hücre kültür tedavi polistren 96-şey Mikroplaka her kuyuya aşılamak.
    5. Mikroplaka statik olarak 37 ° C'de 24 saat altında bir de oksijenli ortamı için kuluçkaya.
      Not: Farklı bakteri suşları için olgun biyofilm oluşumu için kuluçka süresi değişebilir; PDT deneme önce15bu tespit edilmelidir.
    6. Kuyuları medyada atmak ve üç kez Mikroplaka wells PBS ile nazikçe yıkayın ve ardından süpernatant atın.
      Not: Adım çok yavaşça kurulan biyofilm rahatsız edici önlemek için yapılmalıdır.
  2. Biyofilm oluşumu yemekler
    1. S. aureus zorlanma USA300 TSB orta 5 mL aşılamak ve 37 ° c durağan faz ile gecede sallayarak ile bir kuluçka yetiştirmek.
    2. 4000 x g 25 ° C'de 10 dakika için de gecede bakteri kültürü santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın. Granül 2.0 x 10 son bir konsantrasyon için PBS içinde resuspend9 CFU/mL. Sonra 1: 200 için bakteriyel süspansiyon seyreltik (1.0 x 107 CFU/mL) % 0.5 glukoz içeren içinde TSB orta. Bakteriyel süspansiyon 2 mL bir 35 mm optik kalite cam alt hücre kültür tabak içine aşılamak ve statik olarak 37 ° C'de 24 h için kuluçkaya.
      Not: Bakteri konsantrasyonu optik yoğunluk ölçerek tahmin edilmiştir.
    3. Medya bir pipet ile Aspire edin ve sonra biyofilmler yavaşça PBS ile çanak içinde üç kez yıkayın ve ardından, süpernatant'ı dikkatle atın.
      Not: pipet ucu çanak dibine dokunmaktan kaçının. Adım 2.2 kurulan biyofilm kurutma önlemek için bu adımdan sonra hemen yapılmalıdır.

2. hafif ışınlama

  1. 5-ALA 4 ° C buzdolabında saklayın. Deneme önce 5-ALA 10 mM için PBS ile sulandırmak.
    Not: 5-ALA çözüm deneme önce taze hazırlanmalıdır.
  2. Deney grubunda, her şey Mikroplaka veya kültür çanak 2 mL 10 mm ALA 200 µL ekleyin. Alüminyum folyo ile plaka/çanak kapağı ve 1 h için kuluçkaya. Sonra bir ışık yayan diyot (LED) ile plaka/çanak için 360 J/cm2 633 ± 10 nm17büyük bir dalga boyu de hafif bir doz elde etmek 1 h 100 mW/cm2 ışık şiddeti ile ışınlatayım.
    Not: etkin bir şekilde ve eşit olarak tüm kuyu/yemekler biyofilm teslim ışık enerjisi izin için ışık kaynağı zirvesine iyi/çanak 6,0 cm mesafe düzeltmek ve deneysel Bölge Merkezi ışınlama alanına (10 cm x 8 sınırı cm). sonuçları tekrarlanabilir, deneyler-meli var olmak kılınmak aynı oda sıcaklığında emin olmak için.
    LED ışınlama adım doğrudan maruz güneş ışığı, Oda aydınlatma veya lamba ışığında, gibi diğer ışık kaynaklarının plaka önlemek için LED plaka/çanak ışınlama alanına geçmeden önce açıldı ve işlemi bitirmek için parlak bir ışık vardı.
  3. (Üç kontrol grubu deneyimimizi ayarlanan) kontrol grubu ayarlayın.
    1. İlk denetim için Grup (ALA - LED-), her şey Mikroplaka veya kültür çanak 2 mL için PBS 200 µL ekleyin. Alüminyum folyo ile plaka/çanak kapağı ve 2 h için kuluçkaya.
    2. İkinci kontrol grubu için (ALA + LED-), her şey Mikroplaka veya kültür çanak 2 mL 10 mm ALA 200 µL ekleyin. Alüminyum folyo ile plaka/çanak kapağı ve 2 h için kuluçkaya.
    3. Üçüncü kontrol grubu için (ALA-LED +), her şey Mikroplaka veya kültür çanak 2 mL PBS 200 µL ekleyin. Alüminyum folyo ile plaka/çanak kapağı ve 1 h için kuluçkaya. 360 J/cm2 ışık ışınlama büyük bir dalga boyu, 633 ± 10 nm17LED plakasına sunarsınız.
      Not: LED ışınlama adım doğrudan maruz güneş ışığı, Oda aydınlatma veya lamba ışığında gibi diğer ışık kaynaklarının plaka kaçının.

3. pst tedavinin etkinliğini tespiti

Not: ALA-PDT etkisi S. aureus biyofilmler onaylamak için hücreleri ile veya olmadan ALA-PDT canlılığı CFU sayma yanı sıra canlılık boyama tarafından değerlendirilmiştir.

  1. Kalan canlı bakteri hücreleri belirlenmesi
    1. ALA-PDT tedavi sonra medya Wells atmak ve tüm sigara yapışık hücreleri için hem de deneysel kaldırmak ve grupları denetlemek için üç kez wells PBS ile yıkayın.
      Not: Bu adım çok yavaşça yapılmalıdır.
    2. Yapisan bakteri hücreleri iyice pipet ucu kuyulardan scrape ve konik tüpler hücrelerde toplamak.
    3. 4000 x g 4 ° C'de 10 dakika için de bakteriyel süspansiyon santrifüj kapasitesi sonra süpernatant atmak.
    4. 1 mL % 0.25 Pankreatin enzim PBS içinde yer alan bakteriler resuspend ve 1,5 saat için 37 ° C'de kuluçkaya.
    5. 4000 x g 10 dk de santrifüj kapasitesi; süpernatant atmak, sonra Pelet PBS 200 µL içinde resuspend.
    6. 1:10 PBS ile hücre çözümün seri dilutions yapmak; daha sonra tryptone soya agar (TSA) plaka üzerine her seri seyreltme örneğinin 5 µL ekleyin. TSA plaka 16 h için 37 ° C'de kuluçkaya; o zaman, (çıplak gözle) bakteri kolonileri (CFU/mL) saymak.
  2. S. aureus biyofilmler CLSM tarafından gözlenmesi
    1. Işık ışınlama sonra PBS ile Kültür bulaşık biyofilmler üç kez yıkayın.
      Not: Bu adım çok yavaşça yapılmalıdır.
    2. 1 mL 1 µM yeşil-floresan nükleer ve prokaryotik hücre zarlarında (örneğin, SYTO9) ve 1 mL 1 µM propidium iyodür (PI) biyofilm gibi ölü hücreleri leke için 20 dakika için geçirgen kromozom leke ekleyin.
    3. Hücrelerin gözlemlemek (yeşil Floresan, Ex / Em 485 nm/530 nm) ve ölü hücreleri (kırmızı Floresans, Ex / Em 485 nm/630nm) altında bir CLSM 63 X 1.4-NA petrol-daldırma objektif lens ile.
    4. Mikroskopi yazılımını kullanarak görüntüler oluşturmak.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Biyofilmler bakterilerde canlılık kontrollere göre zaman ALA-PDT tedaviden sonra azalmıştır (ALA - LED-, ALA + LED - ve ALA-LED +) USA300 ve üç klinik suşları (şekil 1).

CFU sonuçlarından tahlil ve antibakteriyel gözlemlemek onaylamak için S. aureus biyofilm in situ, USA300 biyofilmler ALA-PDT etkisi görselleştirildiği CLSM tarafından canlılığı boyama ile. Canlı ve ölü hücreleri il...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Daha 100 yıl önce icat edilmiştir beri PDT kanseri tedavisi için iyi çalışılmış bir terapi oldu18. Son on yılda PDT antimikrobiyal bir strateji olarak uygulanmış ve bazı antibiyotik dirençli Patojen bakteriler12karşı etkinliğini göstermiştir. Planktonik durumuna göre bakteriyel biyofilmler biyofilmler ALA-PDT etkisi tam olarak henüz araştırmış değil iken antibiyotik tedavisi3' e, daha dayanıklı görünüyor.

Bu makalede, bir ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa yoktur

Teşekkürler

Bu eser genç akademisyenler (No. 81300810), Shanghai genç doktor eğitim programı (No. 20141057) ve Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı Çin (81671982, 81271791 ve 81571955) için Ulusal Doğa Bilim Vakfı Çin tarafından finanse edildi. LetPub (www.letpub.com) teşekkür için-mek şartıyla bu el yazması hazırlanması sırasında dile ait yardım ederim.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Tripton Soya Suyu (TSB)OXOIDCM0129B
Tripton Soya Agar (TSA)OXOID CM0131
SYTO9Thermo Fisher ScientificL7012CANLI/ÖLÜ BacLight Bakteriyel Canlılık Kitleri 
Propidium iyodür (PI)Thermo Fisher ScientificL7012CANLI/ÖLÜ BacLight Bakteriyel Canlılık Kitleri 
PankreatinSigma-AldrichP3292
5-aminolevulinik asit (ALA)Fudan Zhangjiang Bio-Pharm3.1
Staphylococcus aureus suşu USA300//ABD 300 referansının kaynağı " Tenover FC, Goering RV. J Antimikrob Kimya. 2009 Eylül; 64(3):441-6".
Staphylococcus aureus klinik suşları (C1-C3)//FudanÜniversitesi Göz ve KBB Hastanesi Kulak Burun Boğaz-Baş ve Boyun Cerrahisi Anabilim Dalı'nda kronik rinosinüzitli hastalardan tüm klinik suşlar izole edildi [Zhang QZ, Zhao KQ, Wu Y, et al. PLoS One. 2017 Mart; 12(3): e0174627].
96 kuyulu mikroplakaCorning Inc3599Şeffaf Düz Tabanlı Polistiren TC ile İşlem Görmüş Mikroplakalar, Ayrı Ayrı Sarılmış, Kapaklı, Steril
FlorodishNEST Biyoteknoloji801001Cam altlı, Pirojenik
Olmayan Eppendorf Güvenli Kilitli Tüpler, 1,5 mLEppendorf0030120086
Eppendorf mikrosantrifüj 5417EppendorfZ365998 |  SIGMA
İnkübatörThermo Fisher ScientificSHKE4000MaxQ 4000 Masaüstü Orbital Çalkalayıcılar
Işık yayan diyot (LED)Wuhan Yage Optik ve Elektronik Teknik COLED-IB
Leica TCS SP8 konfokal lazer taramalı mikroskopLeica Microsystems
Leica LAS AF yazılımıLeica Microsystems
IMARIS yazılımBitplane

Kaynaklar

  1. Lewis, K. Riddle of biofilm resistance. Antimicrob Agents Chemother. 45 (4), 999-1007 (2001).
  2. Rabin, N., et al. Biofilm formation mechanisms and targets for developing antibiofilm agents. Future Med Chem. 7 (4), 493-512 (2015).
  3. Mah, T. F., O'Toole, G. A. Mechanisms of biofilm resistance to antimicrobial agents. Trends Microbiol. 9 (1), 34-39 (2001).
  4. Sharma, M., et al. Toluidine blue-mediated photodynamic effects on staphylococcal biofilms. Antimicrob Agents Chemother. 52 (1), 299-305 (2008).
  5. Rosa, L. P., da Silva, F. C., Nader, S. A., Meira, G. A., Viana, M. S. In vitro effectiveness of antimicrobial photodynamic therapy (APDT) using a 660 nm laser and malachite green dye in Staphylococcus aureus biofilms arranged on compact and cancellous bone specimens. Lasers Med Sci. 29 (6), 1959-1965 (2014).
  6. Rosa, L. P., Silva, F. C., Nader, S. A., Meira, G. A., Viana, M. S. Effectiveness of antimicrobial photodynamic therapy using a 660 nm laser and methyline blue dye for inactivating Staphylococcus aureus biofilms in compact and cancellous bones: An in vitro study. Photodiagnosis Photodyn Ther. 12 (2), 276-281 (2015).
  7. Mai, B., et al. The antibacterial effect of sinoporphyrin sodium photodynamic therapy on Staphylococcus aureus planktonic and biofilm cultures. Lasers Surg Med. 48 (4), 400-408 (2016).
  8. Gandara, L., Mamone, L., Bohm, G. C., Buzzola, F., Casas, A. Enhancement of photodynamic inactivation of Staphylococcus aureus biofilms by disruptive strategies. Lasers Med Sci. 32 (8), 1757-1767 (2017).
  9. Baltazar, L. M., et al. Antimicrobial photodynamic therapy: an effective alternative approach to control fungal infections. Front Microbiol. 6, 202(2015).
  10. Fernandes, T., Bhavsar, C., Sawarkar, S., D'Souza, A. Current and novel approaches for control of dental biofilm. Int J Pharm. 536 (1), 199-210 (2017).
  11. De Sordi, L., et al. Development of Photodynamic Antimicrobial Chemotherapy (PACT) for Clostridium difficile. PLoS One. 10 (8), e0135039(2015).
  12. Harris, F., Pierpoint, L. Photodynamic therapy based on 5-aminolevulinic acid and its use as an antimicrobial agent. Med Res Rev. 32 (6), 1292-1327 (2012).
  13. Donnelly, R. F., McCarron, P. A., Tunney, M. M. Antifungal photodynamic therapy. Microbiol Res. 163 (1), 1-12 (2008).
  14. Shi, H., Li, J., Zhang, H., Zhang, J., Sun, H. Effect of 5-aminolevulinic acid photodynamic therapy on Candida albicans biofilms: An in vitro study. Photodiagnosis Photodyn Ther. 15, 40-45 (2016).
  15. Zhang, Q. Z., et al. 5-aminolevulinic acid-mediated photodynamic therapy and its strain-dependent combined effect with antibiotics on Staphylococcus aureus biofilm. PLoS One. 12 (3), 0174627(2017).
  16. Chang, Y. C., et al. Rapid single cell detection of Staphylococcus aureus by aptamer-conjugated gold nanoparticles. Sci Rep. 3, 1863(2013).
  17. Barra, F., et al. Photodynamic and Antibiotic Therapy in Combination to Fight Biofilms and Resistant Surface Bacterial Infections. Int J Mol Sci. 16 (9), 20417-20430 (2015).
  18. St Denis, T. G., et al. All you need is light: antimicrobial photoinactivation as an evolving and emerging discovery strategy against infectious disease. Virulence. 2 (6), 509-520 (2011).
  19. O'Neill, J. F., Hope, C. K., Wilson, M. Oral bacteria in multi-species biofilms can be killed by red light in the presence of toluidine blue. Lasers Surg Med. 31 (2), 86-90 (2002).
  20. Li, X., et al. Effects of 5-aminolevulinic acid-mediated photodynamic therapy on antibiotic-resistant staphylococcal biofilm: an in vitro study. J Surg Res. 184 (2), 1013-1021 (2013).
  21. Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious diseases. Nat Rev Microbiol. 2 (2), 95-108 (2004).
  22. Elias, S., Banin, E. Multi-species biofilms: living with friendly neighbors. FEMS Microbiol Rev. 36 (5), 990-1004 (2012).
  23. Wu, J., et al. Design and Proof of Programmed 5-Aminolevulinic Acid Prodrug Nanocarriers for Targeted Photodynamic Cancer Therapy. ACS Appl Mater Interfaces. 9 (17), 14596-14605 (2017).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Koloni Olu turan BirimlerKonfokal Lazer Taramal MikroskopiFlorasan BoyamaBakteriyel Canl l kBiyofilm Olu umuAntimikrobiyal Etki

İlgili makaleler