Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Lentiviral aracılı transgenik fareler üretimi: doğrudan eğitim kurucuları basit ve son derece etkili bir yöntem

9.3K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/57609

⸱

7 Ekim 2018

 ,  ,  , 
1UPMC Univ Paris 06, INSERM U1127, CNRS UMR 7225, Institut du Cerveau et de la Moelle épinière, ICM, Sorbonne Universités, 2UPMC Univ Paris 06, INSERM UMRS1166, Institute of Cardiometabolism and Nutrition, Sorbonne Universités

Bu makalede

Özet

Burada, lentiviral bir vektör perivitelline alanda bir döllenmiş yumurta, basit bir iğne ile transgene entegrasyon ve kurucusu transgenik fareler ile yüksek etkinlik üretimini teşvik için bir protokol mevcut.

Özet

Yaklaşık 40 yıldır, pronuclear DNA enjeksiyon transgenes rasgele entegrasyonu ile transgenik fareler oluşturmak için standart yöntem temsil eder. Rutin bir işlem tüm dünyada yaygın olarak kullanılmaktadır ve kurucusu hayvanlar bir düşük verim içinde kaynaklanan transgene tümleştirme, zavallı etkinliği, onun ana sınırlama bulunur. Sadece birkaç yüzde enjekte döllenmiş yumurta implantasyonu sonra doğan hayvanların transgene entegre etmiş. Buna ek olarak, lentiviral vektörler bütünleştirici gen transferi için güçlü araçlar ve kullanımları döllenmiş yumurta transduce kurucusu yüksek verimli üretim % 70 üzerinde bir ortalama verim ile transgenik fareler sağlar. Ayrıca, herhangi bir fare zorlanma transgenik hayvan üretmek için kullanılabilir ve alellerle transgene ifade son derece yüksek, DNA mikroenjeksiyon karşılaştırıldığında lentiviral aracılı transgenesis ile % 80'i yukarıda. Kargo lentiviral vektör tarafından olabilir DNA parçasının boyutunu 10 kb ile sınırlı ve bu yöntemin büyük sınırlama temsil eder. Basit ve kolay enjeksiyon yordamı döllenmiş yumurta zona pelusida altında gerçekleştirmek kullanarak, 50'den fazla kurucusu hayvanlar mikroenjeksiyon tek bir oturumda üretilebilir. Böyle bir yöntem, doğrudan kurucusu hayvanlar, hızlı kazanç ve kayıp işlev çalışmaların veya ekran genomik DNA bölgeleri kontrol eden ve düzenleyen gen ifade içinde vivoyeteneklerini için gerçekleştirmek için son derece adapte.

Giriş

Gordon ve ark. öncü çalışmaları 1980 yılında pseudopregnant farelerde implantasyon sonra döllenmiş yumurta plazmid DNA enjeksiyon erkek pronuclei içine entegre transjenik hayvanlar üretimini getirebilecek gösterdi Plazmid DNA1. Transgenik memeliler oluşturulabilir gösteri küresel Yaşam Bilimleri Araştırma temel bilimler ve çevirim Biyomedikal Bilimler için hem de Roman alanlara yol açarak üzerinde çok büyük etkisi vardı. Son dört yıl içinde DNA mikroenjeksiyon rutin bir uygulama haline gelmiştir. Transgenik fareler çok büyük sayıda üretilen rağmen standart yöntem tam olarak tüm fare suşları için kullanılamaz ve zaman alıcı backcrosses2,3gerektirir. Uygulama diğer türler için zorlu4 kalır ve genel transgene tümleştirme verim d. hayvan5birkaç yüzdesine sınırlıdır. Buna ek olarak, transgene tümleştirme etkinliğini pronuclear DNA enjeksiyon zavallı genel verimi açıklayan sınırlayıcı bir faktör temsil eder. Bu açıdan bütünleştirici viral vektörler en verimli araçlar için kargo ve transgenes entegre ve böylece önemli ölçüde entegrasyon verim, bu 10 kb6 aşamaz transgene boyutu olmak tek sınırlama artırmak için yeni araç sağlayabilir .

Lentiviral vektörler ile örtmek protein Vesicular Stomatit virüs (VSV) sözde yazılı pantropic ve son derece bütünleştirici gen transferi araçlardır ve döllenmiş yumurta7transduce için kullanılabilir. Yumurtalar çevreleyen zona pelusida doğal virüs engeldir ve iletim lentiviral vektörler ile izin vermek için geçirilmesi gerekiyor. Transjenik hayvanlar tarafından transducing döllenmiş yumurta mikro delme veya zona pelusida8,9/ kaldırma sonra üretilmedi. Ancak, enjeksiyon perivitelline uzayda zona pelusida altında başlangıçta Lois ve meslektaşları7tarafından tanımlandığı gibi döllenmiş yumurta transduce için en basit yöntem gibi görünüyor.

Perivitelline enjeksiyon lentiviral vektörlerin d. hayvanların % 70 transjenik hayvanlar üretiminde yüksek verim sağlar. Böyle verim standart pronuclei DNA enjeksiyon7,10,11kullanılarak elde edilebilir en iyi verim fazla 10 kat daha yüksektir. Bu bağlamda, en az 50 transgenik kurucuları (F0) enjeksiyonları tek bir oturum oluşturur. Kurucuları çok sayıda, bu nedenle, fenotipleme doğrudan transgenik fare satırları oluşturmak için gerek kalmadan F0 fareler üzerinde gerçekleştirilen transgene etkisi ile uyumludur. Bu avantaj ve in vivo kazanç ve kayıp işlev çalışmaların hafta içinde gerçekleştirmek için özel olarak adapte transgene etkisi hızlı tarama için sağlar. Ayrıca, düzenleyici DNA elemanlarının da hızla arttırıcılar ve transkripsiyon faktörleri11,12' bağlı DNA motifleri eşlemek için taramaya tabi. Pronuclear iğne ile transgenes genellikle benzersiz bir odağı olarak birden çok kopya entegre. Lentiviral vektörler ile tümleştirme, locus10,13başına tek kopya olarak birden çok loci oluşur. Bu nedenle, tümleşik loci çokluğu yeni oluşturulan modeli daha sağlam yapar transgenik kurucuları gözlenen çok yüksek ifade alellerle ilgili olabilir.

Önemlisi, DNA'ın pronuclear enjeksiyon kullanırken, pronuclei görselleştirme işlemi sırasında kesinlikle gereklidir. Bu teknik sınırlama döllenmiş yumurta çok çeşitli fare suşları kaynaklanan kullanımını engeller. Bu nedenle, belirli bir transgenik bir modelde üretim için hangi pronuclei görünmez istenen fare transgene aktarmak için en az 10 ardışık backcrosses ardından izin veren bir yük hayvanlarda üretimini gerektirir zorlanma zorlanma. Lentiviral vektör enjeksiyonları ile perivitelline alanı her zaman görünür ve enjeksiyon çok özel beceri gerektirmez. Örnek olarak, pronuclei enjeksiyon için uygun değildir NOD/SCID transgenik fareler viral vektör enjeksiyonları14ile elde edilmiştir.

Burada, kapsamlı bir protokol transgenik fareler bir hücre sahne embriyo perivitelline uzayda lentiviral vektör enjeksiyonlar kullanarak basit üretim izin için sunulmuştur. İkisinden biri ile kontrollü Transgene ifade her yerde veya hücre belirli Rehberleri ayrıntılı olarak açıklanmıştır.

PTrip ΔU3 lentiviral omurga bu çalışma15dakika içinde kullanıldı. Bu vektör içinde U3 sıra kısmen U3 organizatörü etkinliğini kaldırmak ve kendi kendine inactivating bir vektör (günah)16oluşturmak için silinene kadar çoğaltma arızalı lentiviral vektörler üretmek için izin verir. Lentiviral vektör stokları HEK-293T hücre p8.91 kapsülleme plazmid (ΔVpr ΔVif ΔVpu ΔNef)6, pHCMV-G vesicular Stomatit virüs (VSV) glikoprotein-G17ve pTRIP ΔU3 kodlama ile geçici transfection tarafından üretildi Rekombinant vektör. Detaylı üretim yordamı tamamlayıcı yöntemler sağlanır.

Üretim yüksek titresi lentiviral vektör stoklarının Biyogüvenlik seviye II koşullarda (BSL-2) gerçekleştirilir. Bu BSL-3'te üretilmiş olmalıdır oncogenes dışında çoğu transgenes için geçerlidir. Bu nedenle, üretim BSL-2 koşullarda çoğu için yeterlidir. Buna ek olarak, kullanım ve üretim genellikle çoğu ulusal düzenleyici kurumlar genetiği değiştirilmiş organizmalar (GDO) ile başa çıkmak için kesilir. Çoğaltma beceriksiz günah lentiviral vektörler (aşağıda 2 µg p24 kapsid protein) sınırlı miktarda Fransızca GDO Ajansı ile anlaşma Avrupa Birliği'nin önerileri tarafından açıklandığı gibi BSL-1 koşullar altında kullanılabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Hayvan iş dahil tüm yordamlar etik onay almış ve Fransızca Bakanlığı araştırma ve eğitim numarası APAFIS #5094-20 16032916219274 v6 altında ve 05311.02 tarafından yetkili olmamıştır. PHENOPARC Fransız Tarım Bakanlığı Akreditasyon numarası B75 altında tarafından akredite ICM hayvan tesisi 13 19. Genel iletişim kuralı her yordam özetlenir kesin bir zaman çerçevesi içinde Şekil 1' de gerçekleştirilmesi.

1. hayvan satın alma ve temel bileşenler hazırlanması

  1. Hayvan satın alma
    1. 8 hafta (F1 üretimi orijinal ♀C57Bl/6JRj ve ♂CBA/JRj arasında haçlar) Yaş 25 vasectomized erkek B6CBAF1/JRj sipariş.
      Not: erkek girişte yalıtmak. Vasectomized erkeklerin en az bir yıl için yeniden kullanılabilir.
      Kafesleri her 3 haftada değiştirin.
    2. 10 hafta-in yaş ve en az 50 hayvanların bir havuzu tutun 50 B6CBAF1/JRj kadın sipariş.
    3. 10-15 C57BL/6JRj verimli erkek 8 hafta-in yaş olan sipariş.
    4. 4 hafta-in yaş vardır sipariş 30 C57BL/6JRj kadın.
  2. Anestezi ve ötenazi
    1. Anestezi intraperitoneally enjekte 300μL ketamin/xylazine karışımı bir birim için gerçekleştirilir (ketamin, 150μg/g vücut ağırlığı, xylazine, 0.15μg bir doz doz / g vücut ağırlık). Hayvanların vücut sıcaklığı ayarlamak için yastık Isıtma altında yerleştirilir. Refleksleri hayvanın kuyruk başlamadan önce yordamı pinching tarafından kontrol edin.
    2. Ötenazi servikal çıkığı tarafından gerçekleştirildi. İşten çıkarma ölüm hayvan onaylamak için bir ikincil Yöntem olarak dahil edildi. Ötenazi embriyo işten çıkarma tarafından gerçekleştirildi.
      Not: elimize hayvanlar (işleme veya çiftleşme) tesisin alıştırmak için 1 hafta en az izin. Önemlisi, transgenik satırları da dahil olmak üzere herhangi bir fare suşları olarak verimli ve bereketli erkeklerde ovumun için yararlı olabilir. Seçtiğiniz zorlanma bir bilimsel soru gereksinimlerine göre yapılmalıdır.
  3. Hormon hazırlık
    1. PSMG (hamile Mare Serum Gonadotropin) arabelleği 910 µL 1 liyofilize PMSG şişe eklemek, 100 µL aliquots alın ve -20 ° C'de saklayın
      Not: Her aliquot 11 fareler için 55 Kullanıcı arabirimi içerir. Asla 2 haftadır ilk kullanımdan sonra devam PMSG aliquots.
    2. 2730 µL hCG (insan korionik Gonadotropin) arabelleği 1 içine hCG şişe liyofilize ekleyin. 100 µL aliquots alın ve -20 ° C'de saklayın
      Not: Her aliquot 11 fareler için 55 Kullanıcı arabirimi içerir.
  4. Hyaluronidase hazırlık
    1. Hyaluronidase 1 şişe M2 10 mg/mL stok çözüm elde edilir ve 50 µL aliquots olun orta 3 mL ile yeniden oluşturma. -20 ° C'de depolayın
  5. Ameliyat araçları hazırlama
    1. Otoklav kullanarak tüm cerrahi .aletleri sterilize.

2. kadın bağış ovumun

  1. 12 h kullanarak bir hayvan tesiste gün - gece döngüleri, 2 de gün -3 PMSG enjekte. HCG gün -1 ve dostum 12 am sadece hCG enjeksiyonu sonra verimli erkek ile enjekte.
  2. -3 günde 1 mL steril % 0,9 NaCl çözeltisi PMSG 100 µL 1 aliquot ekleyin (55 UI). 10 C57BL/6JRj kadın intraperitoneally herhangi bir ölü cilt olmadan kullanarak 100 µL ile enjekte.
    Not: Her fare 5 ka'PMSG alırsınız.
  3. Gün -1, 1 mL steril % 0,9 NaCl çözeltisi hCG 100 µL 1 aliquot ekleyin (55 UI). Seyreltilmiş hCG çözüm (5UI) ile 100 µL PMSG enjeksiyon intraperitoneally alınan fareler enjekte. Bir şırınga herhangi bir ölü cilt olmadan kullanın. Enjeksiyon yavaş yavaş gerçekleştirmek ve böylece sıvı değil kaçak iğne kaldırmadan önce bekleyin.
    Not: Her fare 5 ka hCG'alırsınız. HCG enjeksiyonu 46 h PMSG sonra yapılmalıdır.
  4. Her C57BL/6JRj erkek damızlık erkek, kafes içinde doğrudan hCG enjeksiyonu sonra yerleştirin.
  5. 0 gün sabahı vajinal fişleri kontrol ve olumlu dişiler döllenmiş yumurta toplamak için kullanın.

3. B6CBAF1/jRj Pseudopregnant kadın hazırlayın

  1. Bir vasectomized erkek 5 de yumurta toplama (gün -1) 2 B6CBAF1/JRj kadın önceki gün dostum.
    Not: Mate ile eşitleme kadın döngüleri önlemek için farklı mağaraları tarafından kaynaklanan kadın için çok önemli. Bu vajinal fiş alma verim artacak. Buna ek olarak, bir erkek için son 2 gün içinde değiştirilmiş olan bir erkek kafes eklemek değil. Kafes kirli olduğunda erkek üreme davranışı etkinliği artar.

4. döllenmiş yumurta toplama

  1. Hazırlık
    1. 1450 µL m2 hyaluronidase çalışma çözüm hazırlamak için hyaluronidase hisse senedi ekleyin.
    2. Bir damla hyaluronidase çalışma çözüm 100 mm Petri kabına döllenmiş yumurta üretmek ve oda sıcaklığında tutmak için kullanılan erkek başına 100 µL yerleştirin.
    3. M16 500 µL 4 kuyu tabak içine ekleyin. Her türü zerk edilecek lentiviral vektörlerin 2 kuyu kullanın: bir de içerir enjekte yumurta ve diğer sigara enjekte olanlar. 4 iyi plakaları bir % 5 CO2 atmosfer ile 37 ° C'de kuluçka yerleştirin.
  2. Pipetler toplama ve işleme embriyolar için hazırlayın.
    1. Cam hematokrit kapiller (75 mm/60 µL) sabit cam Kılcal boru içinde alev ortasına döndürerek yumuşatır.
    2. Kılcal bir tüp ile bir iç çapı yaklaşık 300 µm. çekme temiz bir mola almak için soğutmalı tüp üzerinde edinmek için çekme ve mümkün olduğunca hızlı bir şekilde ısı kaldırmak.
  3. Oviducts toplamak.
    1. C57BL/6JRj kadın rahim ağzı çıkığı gün 0 9 am tarafından ötenazi. Ölüm işten çıkarma tarafından onaylanır.
      Not: Bu ötenazi Yöntem IACUC tarafından kabul edildi ve Avrupa önerileri takip eder.
    2. Karın boşluğu makasla açmak için büyük bir yatay kesi gerçekleştirin. Ovidukt rahim ve yumurtalık arasında yer almaktadır.
    3. Mesometrium ve önde gelen kan damarları ile eğri forseps taşıyan membran kaldırın.
    4. Ovidukt yumurtalıktan eğri forseps ile ayırın.
    5. Kıvrımlı pensler ovidukt eğri makas kullanarak yumurtalık üzerinden kesmek için bir kılavuz olarak kullanın.
    6. Ovidukt çekin ve rahim eğri makasla kesti.
      Uyarı: döllenmiş yumurta içeren şişmiş ampulla dokunmayın. Steril aletler kullanarak tüm yordamı gerçekleştirin.
    7. Tüm toplanan oviducts M2 Orta (35 mm Kültür çanak) Oda sıcaklığında yerleştirin
    8. 2 oviducts hyaluronidase çalışma çözüm (0.3 mg/mL) aynı 100 µL düşüş yerleştirin.
  4. Kümülüs hücreleri döllenmiş yumurta kaldırın.
    1. Bir stereomicroscope altında 2 insülin şırınga kullanın: ovidukt tutmak için ilk ve ampulla kadar gözyaşı ve dağıtmak için ikinci bir hyaluronidase çalışan çözüm yumurta döllenmiş.
    2. Yumurta toplamak için hazırlanan cam damlalıklı al ve tüp ve bütün yumurtaları Aspire için ağızlık üzerinde monte 0,22 mikron filtre bağlayın. Tüm yumurta toplamak ve art arda gelen geçit tarafından 100 µL M2 orta 6 farklı damla yıkayın.
    3. Yıkanmış döllenmiş yumurta % 5 CO2 M16 orta atmosferiyle oksijen 37 ° C kuluçka yerleştirin.

5. enjeksiyon yapma pipetler

  1. İnce duvarlı cam Kılcal boru (10-15 cm uzunluğunda) bir dış çapı 1 mm ile kullanın ve bu kılcal yatay micropipette çekici kelepçe.
    Not: en yatay pipet Elcikler içinde 3 parametre ayarlanabilir: ısı enerjisi, Isıtma ve çekerek arasında güç ve zaman gecikme çekerek. Şekil 2Asunulan benzer enjekte pipets elde etmek için bu parametreler ayarlayın. Rutin olarak DNA mikroenjeksiyon gerçekleştiren kullanıcılar için standart ayarları kullanın ve Isıtma ve Pipet Ucu küresel şeklini değiştirmek için çekerek arasında gecikme ayarlayın.

6. Holding yapma pipetler

  1. Holding pipet hazırlamak için enjekte bir pipet kullanın.
  2. Enjekte bir pipet bir microforge ekleyin. Pipet ile 80-100 µm çapının keskin bir simetrik ipucu elde etmek için microforge kesti. O zaman ısı ile ucunda keskin hedges bulunmayan bir simetrik yuvarlak şekli elde etmek için microforge Lehçe.

7. Lentiviral vektör içeren enjeksiyon pipet hazırlanması

  1. 160 x g enkaz kez dondurulmuş lentiviral stoklarında mevcut cips 2 min için de lentiviral vektör süspansiyon santrifüj kapasitesi.
  2. Süpernatant yeniden elde etmek ve yeni bir 0.5 mL tüp bir sınıf II Emanet kabin içine aktarın.
  3. 1 µL süpernatant, bir mikro-loader kullanarak 5. adımda açıklandığı gibi hazırlanmış bir enjeksiyon pipet aktarın.
  4. Enjeksiyon pipet doğru micromanipulator araç sahibinin ayarlayın. Holding damlalıklı sol micromanipulator bağlayın.
    Not: Lentiviral vektör iletim titresi doğrudan kurucusu üretim etkinliği ile ilişkili. Yüksek etkinlik için (> % 70), bir titresi 100 aralığında ile viral vektörleri kullanan p24 kapsid protein/µL ng. Titresi iletim birimi (TU) olarak ifade edilir, titresi 10 olmalıdır9 TU/mL. Lentiviral vektör hisse senetleri 293T hücre p8.91 encapsidation plazmid ile geçici transfection tarafından üretilen gerekir pHCMV-G, vesicular Stomatit virüs (VSV) glikoprotein-G ek yöntemleri18' açıklandığı gibi kodlama.

8. mikro-enjeksiyon

  1. M2 orta bir depresyon slayt ve kapak merkezinde 8 µL ışık parafin yağı (embriyo test) ile dağıtmak buharlaşma önlemek için.
  2. Yer 20 yumurta içine damla mümkün olduğunca az dağınık gibi.
    Dikkat: embriyo yatırırken kabarcıklar yapmayın.
  3. Enjeksiyon Pipet Ucu açık olduğundan emin olun. Eğer değilse, enjeksiyon pipet holding pipet ile dokunun.
  4. Microinjector 20 enjeksiyon süre ayarla s.
    Not: Viral süspansiyon viskozitesi perivitelline uzayda viral vektör dispersiyonu açık görselleştirme sağlar. Enjeksiyon basıncı 20 içinde tüm boşluğu doldurmak için ayarlanması gereken s, 10-100 birim temsil eder enjeksiyon pL. Enjeksiyon basıncı 600 hPa aşmaması gerekir.
  5. 2 pro çekirdeği ve 2 kutup organları ile stereomicroscope altında tutarak pipet içeren bir döllenmiş yumurta Aspire edin.
  6. Yumurta 8.4, perivitelline alanında tanımlanan ayarları kullanarak microinjector ile enjekte.
    Uyarı: enjeksiyon damlalıklı ile plazma zarı dokunmayın.
  7. Tüm döllenmiş yumurta 20 yumurta toplu olarak kullanılabilir enjekte edip enjekte yumurta hemen önceden ısıtılmış M16 ortamda oksijen 37 ° C kuluçka %5 CO2atmosferiyle yerleştirin.
    Not: enjeksiyon embriyo transferi önce sonra en az 30 dk enjekte yumurtaları kuluçkaya.

9. B6CBAF1/JRj Pseudopregnant kadın embriyo transfer

  1. Birleşme tak 16 h B6CBAF1/JRj B6CBAF1/JRj vazektomi erkeklerin dişilerle çiftleşme sonra kontrol edin. Bunu sadece yumurta toplama başlamadan önce.
  2. İmplantasyon pipetler enjekte embriyo için hazırlayın.
    1. Toplama ve embriyo (adım 4.2) işleme için açıklandığı gibi embriyo implantasyonu pipetler olun. Pipetler dar bir kısmı yaklaşık 4-5 cm yaklaşık 150 µm bir iç çapı ile uzunluğunu seçin.
      Not: Belgili tanımlık uç, yumurta veya ovidukt olası hasar azaltmak için parlak alev olmalıdır.
      1. Işık parafin yağı (embriyo test) ile sadece Pipet omuz doldurun.
      2. Bir küçük hava kabarcığı sonra M2 orta ve son olarak ikinci bir hava kabarcığı Aspire edin.
      3. Embriyolar tek embriyo ile birlikte ovidukt enjekte orta hacmi en aza indirmek için diğer her arkasında çizin.
      4. Bir embriyo genişliğini çok az bir damla ışık parafin yağı (embriyo test) yükleyerek bitirmek.
        Dikkat: pipet taşıma sırasında nazik ol.
  3. Embriyo transferi.
    1. Tüm aletleri sterilize.
    2. Çözümün ketamin bas vücut ağırlığının g başına 150 μg ve g Xylazine, vücut ağırlığının başına 0,15 μg içeren steril NaCl %0.9 300 μL mayi bir enjeksiyon kullanarak erkek anestezi.
    3. Anestezi derinliği hayvanın kuyruk forseps ile pinching tarafından doğrulayın ve subcutaneouly 0.1 mg/kg analjezik (buprenorfin) Başlat yordamı önce enjekte.
    4. Arkadaki son kaburga düzeyinde spinal kord boyunca her iki tarafında 2 cm tıraş.
    5. Dişi fare bir Isıtma yastık üzerinde ve steril bir alana yerleştirin. Fare arka ortasında bir 2 cm x 2 cm pencere kesmek.
    6. Antiseptik bir çözüm (% 10 Povidone iyodür) cilt üzerinde uygulamak ve makas ile 1 cm enine kesi yapmak sonra Yumurtalık (turuncu renk) vücut duvarın içinden görünene kadar cilt yanal parmağınızı kaydırın.
    7. Dürbün cerrahi mikroskop altında iyi makas ile vücut duvara yumurtalık hemen üzerinde 5 mm kesi olun.
    8. Kadar yağ yastığı bir atravmatik bulldog kelepçe ile almak ve yumurtalık, ovidukt ve rahim üst çekin.
    9. Ampulla görselleştirmek ve yumurtalık ampulla için bağlantılar ovidukt kesimindeki kenasen makasla bir hemisection olun.
    10. Transfer embriyo pipet tanıtmak ve implantasyon pipet ilk hava balonunda durdurma ampulla, içine yumurta teslim.
    11. İkinci ovidukt yordamı yineleyin.
    12. Cilt yara klipleri ile kapatın.
    13. Tam olarak uyanık kadar yer hayvan kurtarma (39 ° C, 30-60 dakika) odası.
    14. Analjezik enjeksiyon 12 h sonra ve ağrı veya acı belirtileri durumunda 48 h tekrarlayın.
    15. 7-10 gün ameliyat sonrası yara klip kaldırın.
    16. İmplante kadın gebelik için onların ağırlık eğrisi her 3 günde implantasyonu sonrası durumunu. Önemli kilo alımı 10-12 gün implantasyonu sonrası dikkat edilmesi ve hamilelik için gösterge olacaktır.
      Not: burada olacak geliştirecek tüm embriyoların sözde transgenik kurucuları temsil ediyor. Bu kurucuları fenotip herhangi bir gelişim aşamalarında veya Doğum göre bilimsel soru transgenik bu hayvanların üretimi için bağlandıktan sonra analiz edilebilir.

10. Genotipleme transgenik kurucuları

  1. 10 mM Tris-HCl, pH 8 içeren Genotipleme arabellek hazırlamak; 5 mM EDTA, pH %8.0 0,2 SDS (w/v), 50 mM NaCl ile. Genotipleme arabellek 0,22 µm filtreden sterilize ve birkaç ay için oda sıcaklığında saklayın.
  2. (Embriyo için) koymak extraembryonic membranlar veya küçük 500 µL içine (d. hayvanlar için) kuyruk parçası Genotipleme arabellek filtre ve 15 µL (20 mg/mL), İndinavir K ekleyin. Gecede 55 ° C'de kuluçkaya
  3. 15.000 x g 5 min için de lysate santrifüj kapasitesi ve süpernatant ile 1 µL PCR reaksiyon için kullanın. Lysate 4 ° C'de birkaç ay depolanabilir.
  4. PCR güçlendirme transgene parçasının içeren 1 x PCR tampon, 1.5 mM MgCl2, dNTPs, her PCR astar 0.2 µM, 1 UI Taq DNA polimeraz ve sindirilir her örneğinin 1 µL 200 µM 20 µL tepki birim içinde gerçekleştirin. Bir negatif kontrol H2O. 1 µL kullanın Pozitif kontrol, DNA transgene içeren lentiviral vektör plazmid kullanın.
  5. Açıklanan eGFP tespiti için kullanın:
    eGFP ileri astar: 5' GACCACATGAAGCAGCACGACTTCT 3'
    eGFP ters astar: 5' TTCTGCTGGTAGTGGTCGGCGAGCT 3'
  6. Bir thermocycler PCR güçlendirme gerçekleştirmek: 94 ° c, 60 ° C'de 1 dk 1 dk 35 döngüleri ardından 94 ° C'de 4 dk ve 72 ° C'de 2 dk
  7. Şekil 2Biçinde gösterildiği gibi bir 300 bp eGFP PCR ürünü görselleştirmek için % 2 özel jel PCR ürünü yükleyin.
    Not: tüm bireylerin 300 bp PCR Wataha gösterilen eGFP transgene entegre etmiş ve transgenics kabul edilebilir.
  8. Transjenik hayvanlar transgene ifade analiz. Örneğin, histolojik gerçekleştirmek ve immunostaining olarak Şekil 3 ve Şekil 4 resimli ve tamamlayıcı yöntemler açıklanmıştır.
    Not: Her ikisi de transgene ifade analizi ve fenotip çözümlemesi gerçekleştirilmesi küresel bilimsel soru göre uygun yöntemlerle.

11. miktar Transgene kopya numarası

  1. DNA örnekleri kantitatif PCR için hazırlayın.
    1. Adım 10,3 üretici yönergelerine uygun ticari bir seti kullanarak elde genomik DNA (gDNA) lysate İndinavir K dan ayıklayın.
    2. GDNA tarafından spectrophotometry 260 ölçmek nm.
    3. Her gDNA örnek 10 ng/µL son konsantrasyonu sulandırmak.
    4. Her örnek için aşağıdaki konsantrasyonlarda 6 tüpler elde etmek için (1:5) içinde H2O 5 seri dilutions hazırlamak: 10 ng/µL, 2 ng/µL, 0.4 ng/µL, 0,08 ng/µL, 0,016 ng/µL ve 0.0032 ng/µL
  2. Kantitatif PCR (qPCR) tepki karışımı hazırlayın.
    1. Astar mix qPCR için hazır olun. Her astar çift qPCR için kullanmak 10 µL ileri astar (100 µM astar stok çözelti), ters astar (100 µM) 10 µL ekleyin ve H2o 80 µL
      Not: eGFP yükseltmek için ileri TCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCA ve ters TTGATGCCGTTCTTCTGCTTGTCG astar kullanın. Cdx2 gen normalleştirici qPCR (genom başına 2 kopya) için kullanılır. İleri GCCAGGGACTATTCAAACTACAGG ve ters GACTTCGGTCAGTCCAGCTATCTT astar Cdx2 normalizer için kullanın
    2. 2 qPCR karışımları, biri eGFP astar karışımı ile ve diğeri Cdx2 astar karışımı hazırlayın. Her gDNA, yineleme içinde dilutions 6 yükseltmek için yeterli qPCR karışımını hazırlayın. Bir qPCR reaksiyon H2O, floresan yeşil 2 reaksiyon mix x 5 µL ve astar Mix 0.2 µL 3.8 µL içerir.
      Not: transgenik her hayvan için test etmek, 24 qPCR reaksiyonlar gerçekleştirilecek. Reaksiyon karışımı bir 384 iyi qPCR makine için sağlanır.
    3. Her hayvan test etmek dağıtmak: 12 wells ile 9 µL Cdx2 qPCR karışımı ile eGFP qPCR mix ve 12 kuyu 9 µL. Her gDNA seyreltme 1 µL içeren eGFP qPCR MIX 2 kuyu ve eGFP qPCR içeren 2 kuyu karıştırın.
    4. Bırak 2 wells için her qPCR hangi gDNA tarafından H2O negatif kontrol olarak değiştirmek oldu karıştırmak.
  3. 384 iyi plaka qPCR makinesinde yerleştirin ve aşağıdaki çalışan iletişim kuralı uygula: 10 min 95 ° c sonra 50 döngüleri 10 / 95 ° C ile 60 ° C'de 1 dk s
  4. Veri analiz. Test etmek her gDNA için toplam gDNA tutarı (çoğaltmaları 6 puan) günlük bir fonksiyonu olarak Ct değerleri arsa. Doğrusal regresyon ile az kare yöntemi kullanarak eğriyi uydurmak ve karşılık gelen y ekseni ile yakalamayı Ct değeri tahmin. Cdx2 göre eGFP kopya sayısını hesaplamak için eGFP ve normalleştirilmiş Cdx2 ekstrapole Ct değerleri kullanın (2 kopyalar)11Standart 2ΔdCt yöntemi kullanarak.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Transjenik hayvanlar burada sunulan protokolü kullanılarak oluşturuldu. Temsilcisi her ikisi de her yerde karşımıza çıkan sonuçlar ve hücre türü belirli transgene ifade gösterilmiştir.

Transgenes kurucu ifade

Her yerde Rehberleri transgenes sürekli ve etkin bir şekilde ifade etmek için temel araştırma araçlardır. Böyle Organizatör için bir çok büyük de...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Lentiviral vektörler döllü yumurta burada açıklanan perivitelline enjeksiyon transgenik embriyo toplam toplanan embriyo sayısına oranla % 70'den fazla vermiştir transgenik embriyo üretimini sonuçlandı. Bu sonuç önceki raporları ile tutarlı olacak ve özgüllük yordam2,7,10,11,12örneğidir. Önemli özellikleri Tablo 1' de sunulan tüm verileri karşı...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar hiçbir ifşa etmek çıkar çatışması var.

Teşekkürler

Biz Magali Dumont ve Rolando Meloni lentiviral vektör üretim ve hayvan sırasıyla konut teknik yardım için el yazması ve iVector ve Phenoparc ICM çekirdek eleştirel okuma için teşekkür ederiz. Bu eser Institut Universitaire Hospitalo de sinir Translationnelles de tarafından desteklenen Paris, IHU-A-ICM, Investissements d'Avenir ANR-10 / IAIHU / 06. Alınan Halkla İlişkiler Derneği de Langue Française için finansman dökün l'Etude du Diabète et des Maladies Métaboliques (ALFEDIAM) ve ortak bir JDRF / INSERM verin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
PMSG 50UISigmaG4527
hCG 5000UISigmaCG5-1VL
NaClSigma7982
100 mm petri kabıDutsher353003
4 kuyulu Nunc çanakDutsher56469Tüp bebek çanağı
M2 ortaSigmaM7167
M16 ortaSigmaM7292
0,22 ve mikro; m Şırınga filtresiDutsher146611
Hyaluronidaz Enzimi 30mgSigmaH4272fare embriyosu test edildi
İnsülin seringiVWR613-3867Terumo Myjector
Kavisli forsepsMoria2183
Kavisli makasMoriaMC26
Kalibre edilmiş mikrokılcal pipetler için aspiratör borusu tertibatlarıSigmaA5177-5EA
Borosilikat cam kılcal damarlarHarvard aparatıGC 100-10
Yatay mikropipet çektirmeNarishigePN-30
MicroforgeNarishigeMF-900
Ters mikroskopNikonTransferman NK2 5188Hoffman modülasyonu kontrast aydınlatması gereklidir
MikromanipülatörEppendorfCelltram hava
Tutma pipeti kontrolcüsüEppendorfFemtojet
Mineral yağSigmaM8410fare embriyosu test edildi
MikroenjektörEppendorfFemtojetDNA veya viral vektörleri enjekte etmek için kullanılabilir
Dumont # 5 forsepsMoriaMC 40
vannas mikro makasMoria9600
İzofluransantrifüjISO005ISO-VET %100 250ml
ocrygelsantrifüjOCR002
Povidone iyodürsantrifüjVET001vetedine 120ml
BuprenorfinsantrifüjüBUP002Buprecare 0,3Mg/ml 10ml
Tris-HClSigmaT5941Trizma hidroklorür
EDTASigmaE9884
SDSSigma436143
NaClSigmaS7653toz
proteinaz KSigmaP2308 
oneTaq kitiNEBM0480L
PrimerlerEurogentec
8 PCR tüpüşeridi 4titude 4ti-0781
96 kuyu termal döngüleyiciUygulamalı Biyosistemler4375786Veriti
Genomik DNA mini kitiinvitrogenK1820-02
Nanodrop 2000Thermo ScientificND-2000C 
qPCR Master karışımıRoche4887352001SYBR Yeşil 
Çok kuyulu plaka 384Roche5217555001
qPCR cihazı 384 kuyuluRoche5015243001LightCycler 480

Kaynaklar

  1. Gordon, J. W., Scangos, G. A., Plotkin, D. J., Barbosa, J. A., Ruddle, F. H. Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA. Proceedings of the National Academy of Science USA. 77 (12), 7380-7384 (1980).
  2. Bock, T. A., Orlic, D., Dunbar, C. E., Broxmeyer, H. E., Bodine, D. M. Improved engraftment of human hematopoietic cells in severe combined immunodeficient (SCID) mice carrying human cytokine transgenes. Journal of Experimental Medicine. 182 (6), 2037-2043 (1995).
  3. Miyakawa, Y., et al. Establishment of human granulocyte-macrophage colony stimulating factor producing transgenic SCID mice. British Journal of Haematology. 95 (3), 437-442 (1996).
  4. Hirabayashi, M., et al. A comparative study on the integration of exogenous DNA into mouse, rat, rabbit, and pig genomes. Experimental Animals. 50 (2), 125-131 (2001).
  5. Isola, L. M., Gordon, J. W. Transgenic animals: a new era in developmental biology and medicine. Biotechnology. 16, 3-20 (1991).
  6. Zufferey, R., Nagy, D., Mandel, R. J., Naldini, L., Trono, D. Multiply attenuated lentiviral vector achieves efficient gene delivery in vivo. Nature Biotechnology. 15 (9), 871-875 (1997).
  7. Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors. Science. 295 (5556), 868-872 (2002).
  8. Ewerling, S., et al. Evaluation of laser-assisted lentiviral transgenesis in bovine. Transgenic Research. 15 (4), 447-454 (2006).
  9. Ritchie, W. A., Neil, C., King, T., Whitelaw, C. B. Transgenic embryos and mice produced from low titre lentiviral vectors. Transgenic Research. 16 (5), 661-664 (2007).
  10. Park, F. Lentiviral vectors: are they the future of animal transgenesis. Physiological Genomics. 31 (2), 159-173 (2007).
  11. van Arensbergen, J., et al. A distal intergenic region controls pancreatic endocrine differentiation by acting as a transcriptional enhancer and as a polycomb response element. PLoS One. 12 (2), e0171508(2017).
  12. Friedli, M., et al. A systematic enhancer screen using lentivector transgenesis identifies conserved and non-conserved functional elements at the Olig1 and Olig2 locus. PLoS One. 5 (12), e15741(2010).
  13. Sauvain, M. O., et al. Genotypic features of lentivirus transgenic mice. Journal of Virology. 82 (14), 7111-7119 (2008).
  14. Punzon, I., Criado, L. M., Serrano, A., Serrano, F., Bernad, A. Highly efficient lentiviral-mediated human cytokine transgenesis on the NOD/scid background. Blood. 103 (2), 580-582 (2004).
  15. Zennou, V., et al. The HIV-1 DNA flap stimulates HIV vector-mediated cell transduction in the brain. Nature Biotechnology. 19 (5), 446-450 (2001).
  16. Miyoshi, H., Blomer, U., Takahashi, M., Gage, F. H., Verma, I. M. Development of a self-inactivating lentivirus vector. Journal of Virology. 72 (10), 8150-8157 (1998).
  17. Yee, J. K., et al. A general method for the generation of high-titer, pantropic retroviral vectors: highly efficient infection of primary hepatocytes. Proceedings of the National Academy of Science USA. 91 (20), 9564-9568 (1994).
  18. Castaing, M., et al. Efficient restricted gene expression in beta cells by lentivirus-mediated gene transfer into pancreatic stem/progenitor cells. Diabetologia. 48 (4), 709-719 (2005).
  19. Gradwohl, G., Dierich, A., LeMeur, M., Guillemot, F. neurogenin3 is required for the development of the four endocrine cell lineages of the pancreas. Proceedings of the National Academy of Science USA. 97 (4), 1607-1611 (2000).
  20. Scharfmann, R., Axelrod, J. H., Verma, I. M. Long-term in vivo expression of retrovirus-mediated gene transfer in mouse fibroblast implants. Proceedings of the National Academy of Science USA. 88 (11), 4626-4630 (1991).
  21. Norrman, K., et al. Quantitative comparison of constitutive promoters in human ES cells. PLoS One. 5 (8), e12413(2010).
  22. Vandegraaff, N., Kumar, R., Burrell, C. J., Li, P. Kinetics of human immunodeficiency virus type 1 (HIV) DNA integration in acutely infected cells as determined using a novel assay for detection of integrated HIV DNA. Journal of Virology. 75 (22), 11253-11260 (2001).
  23. Ohtsuka, M., et al. One-step generation of multiple transgenic mouse lines using an improved Pronuclear Injection-based Targeted Transgenesis (i-PITT). BMC Genomics. 16, 274(2015).
  24. Tasic, B., et al. Site-specific integrase-mediated transgenesis in mice via pronuclear injection. Proceedings of the National Academy of Science USA. 108 (19), 7902-7907 (2011).
  25. Sumiyama, K., Kawakami, K., Yagita, K. A simple and highly efficient transgenesis method in mice with the Tol2 transposon system and cytoplasmic microinjection. Genomics. 95 (5), 306-311 (2010).
  26. Garrels, W., et al. Cytoplasmic injection of murine zygotes with Sleeping Beauty transposon plasmids and minicircles results in the efficient generation of germline transgenic mice. Biotechnology Journal. 11 (1), 178-184 (2016).
  27. Ding, S., et al. Efficient transposition of the piggyBac (PB) transposon in mammalian cells and mice. Cell. 122 (3), 473-483 (2005).
  28. Aida, T., et al. Cloning-free CRISPR/Cas system facilitates functional cassette knock-in in mice. Genome Biology. 16, (2015).
  29. Philippe, S., et al. Lentiviral vectors with a defective integrase allow efficient and sustained transgene expression in vitro and in vivo. Proceedings of the National Academy of Science USA. 103 (47), 17684-17689 (2006).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Lentiviral TransjenezPerivitelin EnjeksiyonuKurucu HayvanlarLentiviral Vekt rlerMikroenjeksiyon Tekni iEmbriyo TransferiOvidukt DiseksiyonuM16 MedyumuM2 Medyumu
Lentiviral aracılı transgenik fareler üretimi: doğrudan eğitim kurucuları basit ve son derece etkili bir yöntem
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.