Yöntem makalesi

Embriyonik tavuk doku gelişimi çalışmaya Organotypic kültür yöntemi

DOI:

10.3791/57619

⸱

25 Ağustos 2018

 , 
1Department of Biology, Mount Saint Vincent University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, embriyonik tavuk organları büyümeye Protokolü kültür bir organotypic mevcut tüp bebek. Bu yöntemi kullanarak, embriyonik tavuk doku gelişimi, kültür ortamı üzerinde kontrol yüksek derecede korunarak okudu.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Embriyonik tavuk genellikle omurgalı geliştirme için bir güvenilir model organizma kullanılır. Onun erişilebilirlik ve kısa kuluçka dönemi yapar deneme için ideal. Şu anda, tavuk embriyo gelişimsel bu yollar çalışmanın inhibitörleri ve uyuşturucu yerelleştirilmiş sitelerde ve çeşitli yöntemler kullanarak düşük konsantrasyonlarda uygulayarak yapılır. Vitro doku kültürü, konak organizmanın aynı anda birçok fiziksel sınırlamalar mevcut embriyolar için duyarlılık gibi bütün embriyo ile çalışırken atlayarak sırasında ayrılmış dokuların çalışma sağlayan bir tekniktir ölümcül kimyasal yüksek dozda. Burada, kültür gelişimsel süreçleri ötesinde şu anda kurulan yöntemleri incelenmesi için yeni fırsatlar sunan embriyonik tavuk yarım baş vitro, kültür için protokol bir organotypic mevcut.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Embriyonik tavuk (Gallus gallus) biyoloji alanında yaygın olarak kullanılan bir mükemmel model organizmadır. Kuluçka süresinin yaklaşık 21 gün olduğunu ve birçok yumurta aynı anda, hızlı ve verimli deneme yapma inkübe. Belki de en önemlisi, embriyo da kolaylıkla, yoğun çalışma temel gelişimsel süreçleri ve genler ve proteinler bu işlemler sürücü etkinleştirme yönetilebilir.

Embriyonik tavuk göz üzerinden farklı dokuların birçok diğer vücut sistemleri için benzer bir dizi etkileşim gelişir karmaşık bir organdır. Bu yöntem, gelişmiş gelişim aşamasında özellikle bu dokuların gelişimi çalışma sağlar. Örneğin, çok katmanlı retina sinir sisteminin gelişimi eğitim görenler için özel ilgi olabilir. Kornea, vitreal vücut, objektif, sklera ve göz kapakları gibi diğer göz dokuların çalışma alternatif yöntemleri araştırmacılar yararı vardır. Tavuk embriyonik göz de düz kemikleri, Intramembranous kemik indüksiyon ve ossifikasyon omurgalılar1çalışma için bir model olarak kullanılan scleral kemikçiklerdeki bir dizi içerir.

Şu anda, embriyonik geliştirme eğitim için kullanılan bir yöntem vardır. İnhibitör antikorlar veya diğer inhibitör molekülleri2,3, microinjections cerrahi olarak inhibitörü4' te batırılmış lastikteki implante ve adım5 tümleyici genler için kullanılabilir tüm yöntem vardır ya da bir embriyo ilgi proteinler. Benzer yöntemleri upregulate proteinler için kullanılır. Bu yöntemleri sınırlamaları değildir. Örneğin, kimyasallar embriyonik gelişim alter için kullanıldığında, embriyo üzerinde ölümcül etkileri değerlendirilecek gerekir ve bu uygulamanın, Beka sağlamak için düşük dozda yerelleştirilmiş sitelere yukarıda belirtilen yöntemlerden kısıtlar embriyo.

Vitro doku kültürü organizmalar geniş bir geliştirme eğitim için kullanılan ve bazı yukarıda belirtilen sınırlamaları bypass için kullanılabilir. Örneğin, femora6, tüy tomurcukları7,8ve bacaklarda9 tavuk tüm doku kültürü yöntemleri, fare10 ve kökleri testis ve köklerini bitkiler11olarak kullanarak incelenmiştir. Bu yöntemler bilim adamları yüksek derecede sıcaklık dalgalanma ve besin durumu değiştirme yeteneği gibi doku geliştirme üzerinde kontrol vermek. Bütün embriyo dokudan yalıtım da böylece düzenleme çalışmaları daha yüksek konsantrasyonlarda küresel ölçekte etkinleştirme kimyasalların ölümcül etkileri çok daha az duyarlı kolaylaştırır. Vitro kültürü bir diğer önemli avantajı doku'nın hücresel ortamı korunması olduğunu; dokuların düzenleme farklı doku türlerine9arasındaki etkileşimler çalışma edinerek nispeten değişmeden kalır. Böylece, deneysel açılır kapılar için ek kültür vitro değil vivo içinde veya ovo içinde modelleri mevcuttur yaklaşıyor.

Şu anda, kimyasallar kullanarak embriyonik tavuk göz gelişimi eğitimi özellikle meydan okuyor. Bir dizi extraembryonic membranlar lastikteki veya kimyasal uygulamak üzere embriyo, kapak; o zaten zor bir yöntem daha da zorlaştıran, büyüdükçe embriyo Ayrıca yumurta içinde çok aktif. Bu iletişim kuralı göz ve aynı zamanda göz içinde gelişim süreçlerini incelemek için yeni fırsatlar sağlarken bu engelleri ortadan kaldırarak onun çevre dokular kolay erişim sağlar. Bu iletişim kuralı embriyonik göz içinde scleral kemikçiklerdeki indüksiyon çalışmaya kurulmuştur.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Not: embriyo aşamaları için tablo hazırlama Hamburger ve Hamilton12 (HH) kullanmaktadır.

1. embriyo kuluçka

  1. Steril, ısı kontrollü kuluçka 37 ° C ± 1 ° C ve ~ %40 Nem, döllenmiş tavuk yumurtası kuluçkaya.
  2. Yumurta 1 çevirmek her gün ve HH34 için kuluçkaya kurmalarına izin (8 gün sonrası döllenme).

2. hazırlık ve sterilizasyon malzemeleri

  1. 12 embriyolar, distile su, % 0,85 piliç salin, 12 Cam pipetler, 1 kutu kağıt mendil, yarı gözenekli filtre kağıdı karelerinin 24 2.5 cm x 2,5 cm ve 24 2.5 cm x 2,5 cm kare çelik tel 1 L, 2 L mesh aşağıya doğru kavisli kenarlar ile basınçlı kap için. Malzemeler, sterilize etmek otoklav 121 ° c en az 15 dakika onları.
    Not: Malzemelerin ısıyla önceden yapılabilir.
  2. Kuluçka makinesi ile % 70 etanol yan, raflar ve kapı silerek sterilize. Place 2 plastik kaplar autoclaved içeren distile su içinde nem korumak için kuluçka makinesi. 37 ° C ± 1 ° C ve ~ %40 nem için kültür kuluçka prewarm. Kuluçka makinesi tamamen karanlık olduğundan emin olun; Kapıyı şeffaf ise, folyo ile kapak.
  3. 100 mL besin orta ve 1 mL penisilin kültür kuluçka makinesine koyarak prewarm.
  4. Bir kağıt havlu ile çalışma alanı kapsayacak ve % 70 etanol ile püskürtülerek tezgah sterilize. Forseps, diseksiyon makası, jilet ve % 70 etanol plastik bir kaşıkla 2 çift benzer bir şekilde sterilize.
  5. Yer 12 steril 100 mm Petri yemekler ve 24 35 mm Steril Petri yemekler kullanmak için bankta. Bulaşıkları bir steril torba kadar kullanmak kalır emin olun.

3. embriyo hazırlık

Not: Bu noktadan itibaren kültürler kirletici önlemek için koruyucu toz yüzünü maske takmak. Bir bakteri veya mantar enfeksiyonu kültür berbat olacak ve bunu hızlı bir şekilde kuluçka makinesi bütün kültürlerde yayılan bir risk olduğunu.

  1. Çatlamak yumurta açın ve embriyo %0.85 piliç serum fizyolojik içeren bir 100 mm Petri kabına aktarın. Anatomik özellikleri göre embriyo Hamburger ve yönergeleri12 basamak Hamilton'da açıklanan ve embriyo onaylamak HH34 aşamasıdır.
  2. Boyun kesme ve steril bir jilet kullanarak orta hat, embriyo Başkanı bisect. Steril forseps kullanarak, beyin kaldırın. Gaga olduğu gibi bırakma.

4. kültür Kur

  1. 35 mm Petri yemekler bir 100 mm Petri kabına içinde yer 2.
  2. Çelik tel örgü içinde her 35 mm Petri kabına yerleştirin.
  3. Forseps kullanarak, 1 bisected başkanları 2.5 cm x 2,5 cm yarı gözenekli filtre kağıt parçası için yukarı dönük olacak şekilde göz aktarabilirsiniz. Doku güvenli ve kapalı hafifçe eğerek kayma değil emin olun.
  4. Forseps kullanarak, dikkatlice göz doku ve filtre kağıdı 1 35 mm Petri yemekler, üst göz dokusuyla yükseltilmiş bir sahne oluşturma çelik tel örgü üstüne koyun.
  5. 4.3 ve diğer yarısı kafa ile 4.4 numaralı adımları yineleyin.
  6. Filtre kağıdı düzeyine ulaşıncaya kadar steril cam pipet kullanarak dikkatle her 35 mm Petri kabına doğrudan besin orta ekleyin. Besin orta yarım baş daldırın değil.
  7. 10.000 U/mL penisilin-streptomisin 50 µL her Petri kabına besin ortamda ekleyin.
  8. Doku kağıt küçük bir kare kat ve 100 mm içinde Petri kabına yerleştirin. Autoclaved distile suyla nemlendirin.
  9. Kültür çanak 4 gün için 37 ° C ± 1 ° C ve ~ %40 Nem, steril, karanlık kuluçka yerleştirin.
  10. Her embriyo için 3 ve 4 numaralı adımları yineleyin.
    Not: Embriyo sayısı belirli denemeyi bağlı olacaktır; burada, biz 12 embriyolar için protokol tanımlamak.

5. kültür bakım

  1. Bir kez günlük, taze, autoclaved distile su ile kuluçka plastik kaplar kontör.
  2. Günlük tüm kültürler için bakteriyel veya mantar enfeksiyonları kontrol. Bu parçalanmış veya orta rengi değişti kültürler bulaşmış. Bulaşmış bütün kültürler atmak.

6. fiksasyon

  1. Kültür, aşağıdaki tüm yemekler kuluçka makinesi kaldırabilirsiniz.
  2. Forseps bir çift kullanarak, doku gözyaşı için dikkat çekici filtre kağıdı--dan göz yavaşça çıkarın.
  3. Göz doku %4 paraformaldehyde 1 fosfat tamponlu tuz gecede 4 ° C'de x veya % 10 formalin gecede, oda sıcaklığında tarafsız tamponlanmış düzeltin.
  4. Doku 4 ° C'de 1 fosfat tamponlu tuz x saklayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yöntemi kullanarak, embriyonik tavuk gözün gelişimi (HH34) 8 günün vitro 4 gündür kültürlü. Dört gün içinde ovo gelişimi için HH38 karşılık gelir.

Bu kodlamayla Yöntem geliştirme tüy tomurcukları göz çevreleyen ve göz kapakları (Şekil 1B) destekler. Bu tüy tüy bud geliştirme kodlamayla döneminde başlatılan ovo içinde13 (Şekil...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu iletişim kuralı bir tavuk gözünden embriyonik gün 8 (HH34) büyüme elde etmek için kurulan doku kültürü teknikleri kullanır vitro 4 gün için. Bu kılavuz kültür Yöntem aslında Trowell15tarafından tanımlanmıştır. Biz en iyi duruma getirilmiş bir protokol kullanan embriyonik tavuk göz15ayrı doku katmanları arasında endüktif sinyalleri çalışma için kılavuz ile yarı geçirgen bir zar olan Pinto ve Hall'ın 1991 çalışma16 . Bu yöntemi kullanarak, ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar protokol gelişiminde ön çalışmaları için Gregory Haller (Mount Saint Vincent Üniversitesi) teşekkür etmek istiyorum. Yazarlar ayrıca onun teknik uzmanlık ve filme ve üretim el yazması ses/görüntü bölümü ile ilgili yardım için Nicholas Jones (Mount Saint Vincent Üniversitesi) teşekkür etmek istiyorum. Daniel Andrews MSVU ve Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi, Kanada (NSERC) yolu ile bir lisans öğrenci Araştırma Ödülü fon tarafından desteklenmiştir. Tamara A. Franz-Odendaal bir NSERC bulma Grant tarafından desteklenir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
35 mm hücre kültürü petri kaplarıCorning353001kolay kavranan doku kültürü kabı, polistiren, pirojenik olmayan
100 mm hücre kültürü petri kaplarıCorning353003doku kültürü kabı, polistiren, pirojenik olmayan
kağıt mendilKimtech34155Kimtech Science Marka Görev Silecekleri, karton başına 280
tel örgün/an/apaslanmaz çelik tel örgü (ızgara boyutu 0,7 mm)
tek kullanımlık cam pipetlerVWR14673-010Borosilikat cam tek kullanımlık 5 3/4 "
besin ortamıGibco12591-038Fitton-Jackson Modifikasyonu, [+] fenol kırmızısı (BGJB) ile L-glutamin
penisilin-streptomisinSigma-AldrichP445810000 birim / mL penisilin streptomisin çözeltisi stabilize
filtre kağıtWhatman1454 090yarı gözenekli filtre kağıdı 90mm
döllenmiş tavuk yumurtasıDalhousie Üniversitesi Ziraat Kolejin/ayerel çiftliklerden elde edilebilir
sodyum klorür (NaCl)EMDSX0420-3sodyum klorür kristalleri, reaktif sınıfı
1 L cam şişeVWR89000-2401 L pyrex otoklavlanabilir cam şişe
etanolFisher ScientificBP82011%70 moleküler biyoloji sınıfı
tupperware kapların/an/amağazadan satın alındı ve EtOH tek kullanımlık tıraş bıçakları ile sterilize edildi
VWR55411-050tek kenarlı endüstriyel tıraş bıçakları (cerrahi karbon çeliği)
plastik kaşıklarn/an/amağazadan satın alındı ve EtOH
toz maskesi3Mn/a ile sterilize edildi3M 8500 Konfor Maskesi
paraformaldehitSigma-AldrichP6148paraformaldehit, reaktif sınıfı, kristalin
nötr tamponlu formalinFisher Scientific72210%10 nötr tamponlu formalin
fosfat tamponlu salin (PBS)n/an/a10X fosfat tamponlu tuzlu su pH 7.4 (137mM NaCl, 2.5mM KCl, 4.3mM Na2< / sub>HPO4< / sub>, 1.4mM KH2< / sub>PO 4< / sub>)
15 ml şahin tüpleriVWR21008-216önceden sterilize edilmiş santrifüj tüpleri
forsepsFSTn/aince forseps
civciv salin n/an/a % 0.85 NaCl
Teneke folyoN/AN/Amağazadan satın alınan
kağıt havlun/an/a mağazadansatın alındı

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Franz-Odendaal, T. A. Towards understanding the development of scleral ossicles in the chicken, Gallus gallus. Developmental Dynamics. 237 (11), 3240-3251 (2008).
  2. Scholey, J. M. Functions of motor proteins in echinoderm embryos: an argument in support of antibody inhibition experiments. Cell Motility and the Cytoskeleton. 39 (4), 257-260 (1998).
  3. Horakova, D., et al. Effect of FGFR inhibitors on chicken limb development. Development, Growth & Differentiation. 56 (8), 555-572 (2014).
  4. Gerlach, G. F., Morales, E. E., Wingert, R. A. Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo. Journal of Visualized Experiments. (101), e52943(2015).
  5. Luz-Madrigal, A., Grajales-Esquivel, E., Del Rio-Tsonis, K. Electroporation of Embryonic Chick Eyes. Bio-protocol. 5 (12), e1498(2015).
  6. Roach, H. I. Long-term organ culture of embryonic chick femora: a system for investigating bone and cartilage formation at an intermediate level of organization. Journal of Bone and Mineral Research. 5 (1), 85-100 (1990).
  7. Jung, H. S., et al. Local inhibitory action of BMPs and their relationships with activators in feather formation: implications for periodic patterning. Developmental Biology. 196 (1), 11-23 (1998).
  8. McKinnell, I. W., Turmaine, M., Patel, K. Sonic Hedgehog functions by localizing the region of proliferation in early developing feather buds. Developmental Biology. 272 (1), 76-88 (2004).
  9. Smith, E. L., Kanczler, J. M., Oreffo, R. O. A new take on an old story: chick limb organ culture for skeletal niche development and regenerative medicine evaluation. European Cells & Materials. 26, 91-106 (2013).
  10. Sato, T., et al. In Vitro Spermatogenesis in Explanted Adult Mouse Testis Tissues. PLoS One. 10 (6), e0130171(2015).
  11. Ochoa-Villarreal, M., et al. Plant cell culture strategies for the production of natural products. BMB Reports. 49 (3), 149-158 (2016).
  12. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
  13. Yu, M., et al. The developmental biology of feather follicles. The International Journal of Developmental Biology. 48 (0), 181-191 (2004).
  14. Jabalee, J., Hillier, S., Franz-Odendaal, T. A. An investigation of cellular dynamics during the development of intramembranous bones: the scleral ossicles. Journal of Anatomy. 223 (4), 311-320 (2013).
  15. Trowell, O. A. The culture of mature organs in a synthetic medium. Experimental Cell Research. 16 (1), 118-147 (1959).
  16. Pinto, C. B., Hall, B. K. Toward an understanding of the epithelial requirement for osteogenesis in scleral mesenchyme of the embryonic chick. Journal of Experimental Zoology. 259 (1), 92-108 (1991).
  17. Mbiene, J. P., MacCallum, D. K., Mistretta, C. M. Organ cultures of embryonic rat tongue support tongue and gustatory papilla morphogenesis in vitro without intact sensory ganglia. Journal of Comparative Neurology. 377 (3), 324-340 (1997).
  18. Cloney, K., Franz-Odendaal, T. A. Optimized ex-ovo culturing of chick embryos to advanced stages of development. Journal of Visualized Experiments. (95), e52129(2015).
  19. Korn, M. J., Cramer, K. S. Windowing chicken eggs for developmental studies. Journal of Visualized Experiments. (8), e306(2007).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Doku K lt rYar m BaIn VitroSterilizasyon Prosed rTel rg A amasFiltre Ka dBesiyeriPenisilin Streptomisin

İlgili makaleler