Bu iletişim kuralı kritik adımlar ve yama-kelepçe sonra tek hücre multiplex Ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu gerçekleştirmek için gereken önlemleri açıklar. Bu teknik ifade profil genler tarafından yama-kelepçe kayıtları ile karakterize bir tek hücreden önceden belirlenmiş bir dizi analiz etmek için basit ve etkili bir yöntemdir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Tek hücre Multiplex Ters transkripsiyon polimeraz zincir tepkimesi sonra yama-kelepçe
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Serebral korteks çeşitli morfolojik, fizyolojik ve moleküler özellikler sergileyen çok sayıda hücre türleri oluşur. Bu hücre türleri, özel işlevleriyle çalışmak için Önkoşullar malzemelerin kolay tanımlanması ve bu çeşitliliği engellemektedir. Bu makalede, sonra yama-kelepçe dilimler halinde kayıt aynı anda onlarca genlerin ifade tek bir hücreye algılamak için sağlar multiplex tek hücre Ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) protokolünü açıklar. Bu basit yöntem ile morfolojik karakterizasyonu uygulanabilir ve kan damarlarının çevresinde gibi çeşitli hücre tiplerinin ve belirli hücresel çevreleri, fenotipik özellikleri belirlemek için yaygın olarak uygulanabilir. Bu iletişim kuralı bir hücre hasat ve ters yama-klemp tekniği ile uyarlamak sitoplazmik içeriğini kaydetmek için ve niteliksel algılamaya genler tarafından önceden tanımlanmış bir dizi ifade multiplex PCR ilkedir. PCR astar ve hücre içi yama-kelepçe çözüm RT-PCR ile uyumlu dikkatli bir tasarım gerektirir. Seçici ve güvenilir transkript sağlamak için algılama, bu teknik aynı zamanda sitoplazma amplifikasyon merdiven-e doğru hasat uygun denetimlerinin gerektirir. Burada tartışılan önlemler kesinlikle takip edilmesi gereken rağmen hemen hemen her elektrofizyolojik laboratuvar multiplex tek hücre RT-PCR tekniği kullanabilirsiniz.
Giriş
Serebral korteks çok sayıda hücre tipleri çeşitli fizyolojik süreçlerinde yer oluşmaktadır. Kendi kimlik ve karakterizasyonu, özel işlevleriyle, anlayış için bir ön koşul kortikal hücre tip1 karakterize büyük morfolojik, fizyolojik ve moleküler çeşitliliği göz önüne alındığında çok zor olabilir ,2,3,4.
Tek hücreli multiplex RT-PCR yama-kelepçe ve RT-PCR teknikleri kombinasyonuna dayanmaktadır. Aynı anda electrophysiologically tanımlanan hücreleri530'dan fazla önceden tanımlanmış genlerin i....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Hayvanlar kullanarak tüm deneysel prosedürler Fransız düzenlemeler (kod kırsal R214/87 için R214/130) ile sıkı uygun olarak gerçekleştirilen ve Avrupa Ekonomik Topluluğu (86/609/EEC) ve Fransız Ulusal Charter etik kuralları için standartlarla uyumlu hayvan deney etik üzerinde. Tüm iletişim kuralları Charles Darwin Etik Komitesi tarafından onaylanmış ve eğitim ve araştırma (onay 2015 061011367540) Fransız Bakanlığa gönderilmiş. IBPS hayvan tesisi Fransız yetkililer (A75-05-24) tarafından akredite edilmiştir.
1. ön dikkat edilmesi gereken noktalar
Not: contaminations önlemek için aşağıdaki önerileri girişim tek hücre....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Multiplex RT-PCR temsilcisi doğrulamasına Şekil 3' te gösterilmiştir. Protokol aynı anda 12 farklı genler ifade soruşturma için tasarlanmıştır. Veziküler glutamat ışınlama vGluT1 glutamatergic nöronlar42için pozitif kontrol olarak alınmıştır. Enzimler (GAD65 ve GAD 67), peptit Y (NPY) ve Somatostatin (SOM) sentezleme GABA GABAergic interneurons3,5,1.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Tek hücre multiplex RT-PCR electrophysiologically tanımlanan hücreleri530'dan fazla genlerin ifade aynı anda ve güvenilir bir şekilde yama-kelepçe yoklama sonra. Gen ifadesinin tek hücre düzeyinde analiz yüksek verimli PCR astar gerektirir. En sınırlayıcı adımlardan biri hücrenin içerik topluluğudur. Verimlilik hücre boyutu eşleştirme sırasında mümkün olduğu kadar büyük olmalıdır yama pipet ucu çapı göre değişir. Pipetler 1-2 µm açık uç çapı en nöronal türleri için uygun olduğu kanıtlanmıştır. Yal.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar ifşa gerek yok.
Teşekkürler
Dr Alexandre Mourot el yazması üzerine onun yorum için teşekkür. Bu eser Agence Nationale de la Recherche (ANR 2011 MALZ 003 01; gelen hibe tarafından desteklenmiştir ANR-15-CE16-0010 ve ANR-17-CE37-0010-03), BLG Fondation pour la Recherche sur Alzheimer bursu tarafından desteklenmektedir. IBPS (Paris, Fransa) hayvan tesisi teşekkür ediyoruz.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| MACAW v.2.0.5 | NCBI | Astar tasarımı için çoklu hizalama | |
| Ditiyotreitol | VWR | 443852A | RT |
| Rastgele primerler | Sigma-Aldrich (Merck) | 11034731001 | RT |
| dNTP'ler | GE Healthcare Yaşam Bilimleri | 28-4065-52 | RT ve PCR |
| RNasin Ribonükleaz İnhibitörleri | Promega | N2511 | RT |
| SuperScript II Ters Transkriptaz | İnvitrojen | 18064014 | |
| RT Taq DNA Polimeraz | Qiagen | 201205 | PCR |
| Mineral Yağ | Sigma-Aldrich (Merck) | M5904-5ML | PCR |
| PCR primerleri | Sigma-Aldrich (Merck) | PCR / tuzdan arındırılmış ve 200 &° C'de seyreltilmiş; M | |
| Tüpler, 0,5 mL, düz kapaklı | ThermoFisher Scientific | AB0350 | RT ve PCR |
| BT10 Serisi - 10 & L Filtre | Ucu Neptune Scientific | BT10 | RT ve PCR |
| BT20 Serisi - 20 & mikro; L Filtre | Ucu Neptune Scientific | BT20 | RT ve PCR |
| BT200 Serisi - 200 & mikro; L Filtre Ucu | Neptune Scientific | BT200 | RT ve PCR |
| BT1000 Serisi - 1000 & mikro; L Filtre Ucu | Neptune Scientific | BT1000.96 | RT ve PCR |
| DNA Termal Silindir | Perkin Elmer Cetus | ||
| PCR Etidyum Bromür | Sigma-Aldrich (Merck) | E1510-10ML | Agaroz jel elektroforezi |
| Tris-Borat-EDTA tamponu | Sigma-Aldrich (Merck) | T4415-1L | Agaroz jel elektroforezi |
| UltraPure Agaroz | Yaşam Teknolojileri | 16500-500 | Agaroz jel elektroforezi |
| ve Phi; X174 DNA-Hae III Digest | NEB (New England BioLabs) | N3026S | Agaroz jel elektroforezi |
| EDA 290 | Kodak Agaroz | jel elektroforezi | |
| Elektroforez Güç kaynağı EPS 3500 | Pharmacia Biotech | Agaroz jel elektroforezi | |
| Midi Yatay Elektroforez Ünitesi Modeli SHU13 | Sigma-Aldrich (Merck) | Agaroz jel elektroforezi | |
| Saten görünümlü pürüzsüz kağıt | Fisherbrand | 1748B | Yama kelepçesi iç çözeltisi |
| Potasyum Hidroksid | Sigma-Aldrich (Merck) | 60377 | Yama kelepçesi iç çözeltisi |
| Etilen glikol-bis (2-aminoetileter) -N, N, N ve prime;, N ve prime;-tetraasetik asit | Sigma-Aldrich (Merck) | E3889 | Yama kelepçesi iç çözümü |
| HEPES | Sigma-Aldrich (Merck) | H4034 | Yama kelepçesi iç çözeltisi |
| Potasyum D-glukonat | Sigma-Aldrich (Merck) | G4500 | Yama kelepçesi iç çözeltisi |
| Magnezyum klorür çözeltisi | Sigma-Aldrich (Merck) | M1028 | Yama kelepçesi iç çözümü |
| 5500 Buhar Basıncı Ozmometresi | Wescor | Yama kelepçesi iç çözümü | |
| Biocytin | Sigma-Aldrich (Merck) | B4261 | Yama kelepçesi iç çözeltisi |
| Sükroz | Sigma-Aldrich (Merck) | S5016 | Dilim hazırlama |
| D-(+)-Glikoz monohidrat | Sigma-Aldrich (Merck) | 49159 | Dilim hazırlama |
| Sodyum klorür | Sigma-Aldrich (Merck) | S6191 | Dilim hazırlama |
| Potasyum klorür | Sigma-Aldrich (Merck) | 60128 | Dilim hazırlama |
| Sodyum bikarbonat | Sigma-Aldrich (Merck) | 31437-M | Dilim hazırlama |
| Sodyum fosfat monobazik | Sigma-Aldrich (Merck) | S5011 | Dilim hazırlama |
| Magnezyum klorür çözeltisi | Sigma-Aldrich (Merck) | 63069 | Dilim hazırlama |
| Kalsiyum klorür çözeltisi | Sigma-Aldrich (Merck) | 21115 | Dilim hazırlama |
| Kinürenik asit | Sigma-Aldrich (Merck) | K3375 | Dilim hazırlama |
| Isofluran | Piramal Healthcare UK | Dilim hazırlama | |
| VT 1000S | Leica Biosystems | 14047235613 | Dilim hazırlama |
| Hidrojen peroksit çözeltisi | Sigma-Aldrich (Merck) | H1009 | Yama Kelepçesi kurulum temizliği |
| İnce Duvar Camı Filamentli | kılcal damarlarDünya Hassas Aletler | TW150F-4 | Yama Kelepçesi |
| PP-83 | Narishige | Yama Kelepçesi | |
| Eppendorf Mikro Yükleyici | Eppendorf | 5242956003 | Yama Kelepçesi |
| BX51WI Dik mikroskop | Olympus | Yama Kelepçesi | |
| XC-ST70/CE CCD S/B VİDEO KAMERA | Sony | Yama Kelepçesi | |
| Axopatch 200B Amplifikatör | Moleküler Cihazlar | Yama Kelepçesi | |
| Digidata 1440 | Moleküler Cihazlar | Yama Kelepçesi | |
| pCLAMP 10 yazılım paketi | Moleküler Cihazlar | Yama Kelepçesi | |
| 10 mL şırınga | Terumo | SS-10ES | |
| Düz Gövdeli E Serisi Çıkarma (Tutucu) | Phymep | 64-0997 | Sodyum |
| fosfat dibazik | Sigma-Aldrich (Merck) | S7907 | Histokimyasal vahiy |
| Sodyum fosfat monobazik | Sigma-Aldrich (Merck) | S8282 | Histokimyasal vahiy |
| Paraformaldehit | Sigma-Aldrich (Merck) | P6148 | Histokimyasal vahiy |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich (Merck) | X100 | Histokimyasal vahiy |
| Soğuk su balık derisinden | jelatinSigma-Aldrich (Merck) | G7041 | Histokimyasal vahiy |
| Streptavidin, Alexa Fluor 488 eşlenik | ThermoFisher Scientific | S11223 | Histokimyasal vahiy |
| 24 kuyulu plaka | Greiner Bio-One | 662160 | Histokimyasal vahiy |
Kaynaklar
- Ascoli, G. A., et al. Petilla terminology: nomenclature of features of GABAergic interneurons of the cerebral cortex. Nat.Rev.Neurosci. 9 (7), 557-568 (2008).
- DeFelipe, J., et al. New insights into the class....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
