Method Article

Geliştirme ve işlevsel fare Tolerogenic dendritik hücrelerin karakterizasyonu

DOI:

10.3791/57637

⸱

May 18th, 2018

 ,  , 
1Department of Biochemistry, School of Medicine, Case Western Reserve University, 2Department of Pediatrics, Division of Pediatric Hematology/Oncology, Case Western Reserve University, 3Angie Fowler Cancer Institute, Rainbow Babies & Children's Hospital, University Hospitals, Cleveland

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, geliştirmek ve tolerogenic dendritik hücreler (TolDCs) karakterize ve onların immunotherapeutic yardımcı programı değerlendirmek için bir protokol mevcut.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bağışıklık sisteminin yabancı antijenlere karşı denetleyici yanıt arasında sıkı bir denge tutarak çalışır ve öz-antijenleri yanı sıra antijenlere karşı tepkisiz bir durum komensal organizmalar türetilmiş. Bu bağışıklık homeostazı bozulma kronik inflamasyon ve otoimmünite gelişmesine yol açabilir. Dendritik hücreler (DC) doğuştan gelen bağışıklık sisteminin yabancı antijenlere karşı bağışıklık yanıtı başlatmak için saf T hücreleri aktive dahil profesyonel antijen sunan hücreler vardır. Ancak, DCs da korumak ve T hücre tolerans teşvik ve efektör hücreleri ya da otoimmün veya kronik inflamasyon koşulları gelişimine katkıda bastırmak için hareket TolDCs içine farklı. TolDCs son ilerlemesi anlayışımız içinde DC tolerans ayırt etme durumları oransal tarafından elde edilebilir öneriyor. Bu olay TolDC tedaviler çok sayıda bağışıklık bozuklukları nedeniyle neden olduğu bağışıklık toleransı kırmak için gelişmekte olan muazzam büyüme yol açmıştır. Preklinik otoimmünite fare modelleri başarılı çalışmalar daha da TolDCs immunotherapeutic yardımcı programı otoimmün hastalıklar tedavi doğrulanmış var. Bugün, TolDCs kliniğinde çeşitli bağışıklık hastalıkları bağışıklık toleransı koruyucu bağışıklık olduğu gibi bırakarak patojenik otoimmün yanıtları hedefleyerek geri getirmemesi için umut verici bir immunotherapeutic aracı haline gelmiştir. Stratejilerinin bir dizi TolDCs ikna etmek için birden fazla labs tarafından önerilen, orada olsa da hiçbir tutarlılık bu hücrelerinin hücresel ve fonksiyonel fenotip karakterize. Bu iletişim kuralı kemik iliği türevi DCs çok sayıda, onları bir sentetik triterpenoid 2-cyano-3,12-dioxooleana-1,9-dien-28-oic TolDCs ayırt etmek için kullanılan benzersiz bir yöntem geliştirilmesi için adım adım yönergeler sağlar asit-difluoro-propil-Amid (CDDO-DFPA) ve TolDCs temel moleküler imza analizleri de dahil olmak üzere kendi fenotip onaylamak için kullanılan teknikler. Son olarak, biz onların immünsüpresif yanıt vitro ve in vivo preklinik manken multipl skleroz test ederek TolDC işlevini değerlendirmek için bir yöntem gösterir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dendritik hücreler (DC) doğuştan gelen bağışıklık sisteminin ayrılmaz bir parçası olan ilk keşfetti ve Ralph Steinman ve Zanvil Cohn birincil profesyonel antijen sunan hücreler1olarak 1973 yılında ile karakterizedir. DCs T hücreleri ve B hücreleri MHC kompleksi (MHC) ile işlenmiş antijen ikincil lenfoid organlara içinde doğuştan gelen ve edinilmiş bağışıklık sistemleri2bağlantı sunarak bağışıklık harekete geçirmek içinde önemli bir rol oynadığı gösterilmiştir. Memeli bağışıklık sisteminde miyeloid DCs ve plazmasitoid DCs (PDC)3açıklanan DC'lerin en az iki kategorisi vardır. Myeloid DCs, geleneksel DCs (KGK), CD11c ifade tarafından karakterize ve olgunlaşmamış DCs (iDCs) içinde vitro kemik iliği progenitör hücre veya kullanarak periferik kan monosit olarak farklı olarak da bilinir granülosit-makrofaj-koloni uyarıcı faktör (GM-CSF) ve Il-4 fare veya insan türler, sırasıyla4.

Sürücü moleküler desenleri (PAMP) patojen ilişkili veya moleküler desenleri (nem), hasar ilişkili öyle aynı derecede immunojenik DCs doğru iDCs olgunlaşma olgun DCs (mDCs) olarak çeşitli desen tanıma reseptörleri bağlama via 'tehlike' aktive, sinyalleri DC yüzey5. İmmunojenik DCs daha da prime saf T hücre çoğalması ve MHCII2, costimulatory ligandlar (CD80, CD86 ve CD40)6, sitokinler ve diğer çözünür arabulucu7upregulation aracılığıyla farklılaşma. Pro-inflamatuar arabulucu üretim immünojenik DCs gelen bir çağlayan sitokin aracılıklı T hücre farklılaşması için esastır. Örneğin, IL-12 ve IFN γ Th1 farklılaşma8 ve Il-1, için gerekli olan Il-6 ve IL-23 saf T hücre polarizasyon Th17 hücreleri9doğru için önemlidir. Her ne kadar olgun DCs yabancı antijenleri için tepki, kontrolsüz DC etkinleştirme tarafından öz-antijenleri tolerans ablasyon neden olabilir ve autoreactive T hücreleri olan harekete geçirmek10 doku yıkıma yol oluşturarak otoimmün hastalıklar gelişimi teşvik .

Son raporlar DC plastisite, yeteneklerini kendi doku microenvironment içinde farklı ipuçları ile etkileşim ve farklı efektör/bastırıcı DC alt kümeleri ayırt etmek için tarafından örneği açık kanıtlar sağlamıştır. IL-1011, TGF-β12ve HO-113 gibi anti-inflamatuar arabulucu tolerogenic DCs (TolDCs) inducing tarafından bağışıklık suppression içinde önemli bir rol oynadığı gösterilmiştir. Bu TolDCs düzenleyici işlevleri elde etmek ve T hücre proliferasyonu14bastırmak. Ayrıca, DC'ler tarafından ortak uyarım eksikliği ve anti-inflamatuar arabulucu TolDCs gelen üretim hem düzenleyici T hücreleri (Tregs) indüksiyon katkı ve aynı zamanda etkili Th1 ve Th17 farklılaşma ve genişleme15inhibe. İki yıl, TolDCs tedavi edici potansiyelini birkaç müfettişler tarafından bildirilmiştir. Bu çalışmalarda ex vivo yönetim sadece iyileştirmiştir TolDCs patolojik belirtiler otoimmün hastalıklar16 farklı preklinik modellerin oluşturulan ama aynı zamanda17 hastalarda immün tolerans gelişmesine yol açtı ,18. Otoimmün hastalıklar da dahil olmak üzere çeşitli klinik çalışmalarda 1 diyabet19, romatoid artrit20, türü için ilginç bir şekilde, bugün TolDCs terapi alternatif veya ek bir yaklaşım kabul edilmiştir 21, multipl skleroz (MS)22,23,24ve Crohn hastalığı25.

Çeşitli TolDCs geliştirmek için kullanılan iletişim kuralları vardır ve birkaç laboratuar yöntemleri üretimi ve TolDCs fenotipik karakterizasyonu için bildirdin. Bu yöntemler tekrarlanarak TolDCs vitro hematopoetik ataları oluşturmak ve stabil bir tolerogenic devlet vivo içinde26,27,28,29onları korumak için kullanılabilir. İDCs-ebilmek var olmak değiştirmek TolDCs çeşitli immunomodulatory farmakolojik ajanlar veya anti-inflamatuar sitokinlerin maruz. Örneğin, D3 vitamini IL-10 üretimi artırmak ve DCs gelen IL-12 salgılanması bastırmak ve böylece onların immünsüpresif işlevi30artırmak için bilinen bir iyi bilinen farmakolojik ajandır. DCs lipopolisakkaritler (LPS), gibi güçlü inflamatuar uyarıcılara maruz kaldığında Ayrıca, deksametazon31, rapamycin32ve kortikosteroidler33 gibi çeşitli farmakolojik ajanlar ikna etmek için gösterilmiştir CD40, CD80, CD86 ve MHCII34DC yüzey ifade azaltarak TolDC fenotip. IL-10 ve TGF-β DC tolerans35 ve eşlik eden maruz kalma bu sitokinler her ikisi de ikna etmek için en okudu anti-inflamatuar sitokinlerin tolerogenic fenotip DCs36içinde ikna etmek için göstermiştir vardır.

Yerine fenotipik işaretleri tarafından orada DC fonksiyonel özelliklere göre tanımlanır tolerogenic beri büyük bir TolDCs hücresel ve fonksiyonel karakterizasyonu için tutarlı bir yöntem geliştirmek zorundayız. Eğer biz etkili ve tekrarlanarak TolDC fenotip ikna etmek için yetenek yeni ajanların karşılaştırmak için Ayrıca, titiz ve tutarlı iletişim kuralı tutarlı değerlendirme ve tolerogenic DC fenotip karakterizasyonu için oluşturulmalıdır Laboratuvar. Burada ayrıntılı bir protokol ile adım adım yöntemler iDCs farelerin hematopoetik ataları gelen izole etmek ve daha sonra değerlendirme kapasitelerini TolDCs iDCs dönüştürmek için altında yeni ajanların etkinliğini çözümlemek için sağlam sağlayan sağlamak TolDCs fenotipik ve fonksiyonel karakterizasyonu vitro ve içinde vivo. Bu açıklama TolDCs onların yüzey ligandlar, sitokin profil ve immünsupresif işlevleri vitrotarafından karakterize etmek için ayrıntılı bir yöntem içerir. Biz de bu TolDCs MS, deneysel otoimmun ensefalomiyelit (EAE), önceden klinik bir modeli potansiyel tedavi uygulanması keşfetmek için bir yöntem örneği sağlar. Bu oluşturulmuş protokol TolDCs indüksiyon teşvik için yeni acentalar kapasitesini değerlendirmek için Müfettişler yardımcı olacak ve TolDC terapötik geliştirme kapsamını genişletmek için çaba kolaylaştıracaktır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Case Western Reserve Üniversitesi Tıp Fakültesi'nın kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi tarafından onaylanmış yordamlar ile uyumlu tüm çalışmaları yapıldı.

1. dendritik hücreler (BMDCs) kemik iliği türevi hazırlayın

  1. Isıyla üzerinden tüm cerrahi aletler sterilize ve sınıf II biyolojik Emanet yürüttüğü güvenlik prosedürleri ile kabine deneme gerçekleştirin.
  2. C57BL/6 fareler CO2 odası kullanarak 8-10 hafta-in yaş ötenazi. Parçalanmış bir tahta üzerine fareyi getirin ve % 70 etanol ile durulayın. Cerrahi makas kullanarak Tibia-fibula ve uyluk kemikleri tüketim ve ile % 70 etanol 10 cm kültür tabağına koyun.
  3. Cerrahi bıçaklar ve forseps uzak doku incelemek için kullanın 10 cm kapağındaki mümkün olduğunca kültür çanak ve izole yırtılmalarıteşhis ve uyluk ile % 70 etanol 6 cm kültür tabağına koyun.
  4. Her iki ucunda da yırtılmalarıteşhis ve uyluk kırpmaya cerrahi bıçaklar kullanın. 3 mL PBS 3 ml şırınga 23 G iğne ile kemik iliği içeriğini kemik bir ucundan 12 ml PBS içeren bir konik tüp floş için kullanın. Bu adım 3 x her kemik için tekrarlamak.
  5. 300 x g 5 min için de hücre süspansiyon santrifüj kapasitesi.
  6. Süpernatant kaldırmak ve hücre Pelet kırmızı kan hücreleri kaldırmak 5 dakika için 1 ml ACK lysing tampon ile resuspend.
  7. 9 ml ACK lysing tampon ve 5 dakika için 300 x g, santrifüj sulandırmak için PBS ekleyin.
  8. Süpernatant kaldırmak ve 10 ml kültür orta (RPMI-1640 artı L-glutamine, %10 FBS, % 1 esansiyel olmayan amino asit (100 x), 10 mM HEPES, 50 nM β-mercaptoethanol ve % 5 penisilin/streptomisin) ile resuspend.
    Not: Endotoksin düzeyi daha az 0.1 EU/ml FBS içinde olmak zorunda.
  9. Hücre süspansiyon 40 mikron hücre süzgeç aracılığıyla geçmek ve hücre süspansiyon, 20 µl alıp trypan canlı hücreleri sitometresi kullanarak saymak için mavi 80 µl ile karıştırın.
  10. 1 x 106 hücre/ml 15 ng/ml GM-CSF ve 10 ng/ml Il-4 ile cep numarasını ayarlayın.
  11. 3 ml 1 x 106 hücre/ml her iyi 6-şey plaka plaka ve 37 ° C, % 5 CO2ve % 95 nem CO2 kuluçka hücreleri kuluçkaya.
    Not: Bir fare kemik iliği hücrelerinden olduğunu çevresinde 3-5 x 107 hücreleri, bu 2 ila 3 6-şey plakaları için yerleştirilebilir gösteren.
  12. Günde 3, tüm 3 ml kültür orta her kuyudan çıkarmak her kuyuda 2 ml taze PBS ekleyin ve sonra yavaşça yapışık olmayan hücreleri kaldırma sağlamak için plaka girdap.
  13. 15 ng/ml GM-CSF ve 10 ng/ml Il-4 her iyi 3 ml taze kültür orta yerine. 37 ° C, % 5 CO2ve % 95 nem CO2 kuluçka hücreleri kuluçkaya.
  14. 5 günde, doğrudan başka bir 3 ml taze kültür ortamına 15 ng/ml GM-CSF ve 10 ng/ml Il-4 ile her kuyuya ekleyin. 37 ° C, % 5 CO2, ve % 95 nem CO2 kuluçka hücreleri kuluçkaya.
    Not: Toplam her iyi şimdi 6 ml birimdir.
  15. 7 günde 10 dakika için buz üzerinde tüm plaka koymak. Hafifçe gevşek-yapışık BMDCs iDCs süspansiyon çıkarmak için her şey kültür ortamında pipette.
    Not: Yapisan makrofajlar hala plakasına eklenir. Düşük sıcaklık ve yavaşça yordamlar deneyler daha da etkilemeye DC etkinleştirme önlemek için anahtarıdır.
  16. 300 x g 5 dakika için de hücre süspansiyon santrifüj kapasitesi ve daha fazla deneyler için taze kültür orta ile resuspend.
    Not: BMDCs floresan etiketli CD11c antikor ile akış sitometresi tarafından tespit edilebilir ve Şekil 1' de BMDCs bizim perdeleme strateji daha fazla deneyler için gösterdi.

2. TolDC gen ve Protein profil karakterize

  1. 2 ml 1 x 106 BMDCs/ml 6 iyi-plaka bir kuyu başına 1 h 37 ° C, % 5 CO2 ve % 95 nem CO2 Kuluçka kuluçka için 100-400 nM CDDO-DFPA içinde kültür orta ile plaka.
    Not: CDDO-DFPA, sentetik bir triterpenoid 2 faktör (Nrf2) uyarıcı ve nükleer faktör-κB (NF-κB) inhibitörü - gibi - nükleer faktör (2 erythroid elde edilen) değil. İDCs IL-10, D3 vitamini, deksametazon veya BAY 11-7085, gibi diğer maddeleri TolDCs indüksiyon için uygulamak ve bu adımı her aracısının en uygun bir durumuna değiştirebilirsiniz.
  2. 10 veya 100 ng/ml LPS (kuluçka süresi nedeniyle mRNA veya protein ölçümü farklıdır) mDCs ikna etmek için 4-24 gönderilen kuluçka için ekleyin.
  3. Yavaşça her şey kültür ortamında pipette ve 1 ml pipet kullanarak hücre süspansiyon hasat. 300 x g hücreleri ve süpernatant, sırasıyla toplamak 5 dakika için de santrifüj kapasitesi.
  4. Uyarıcı ligandlar gibi akış sitometresi tarafından yüzey ligandlar hücre topakları üzerinden analiz: CD40, CD80, CD86, MHC-II, OX40L, ICOSL veya inhibitör ligandlar: PD-L1, PD-L2, ILT3, ILT4.
  5. RNA hücre topakları üzerinden yalıtmak ve RNA ve süpernatant örnekleri için nicel gerçek zamanlı PCR (qRT-PCR) ve ELISA, sitokin profil ve gen ve protein düzeyleri sırasıyla çözümleyebilirsiniz.
    Not: için örnek, inflamatuar sitokinlerin: TNF-α, IFNγ, EDN-1, IL-6, IL-12 ve IL-23 veya anti-inflamatuar sitokinlerin: Il-4, IL-10, IL-15, TGF-β1 ve HO-1.

3. TolDCs fonksiyonun değerlendirildiği Vitro ve In Vivo

  1. T-hücre Syngeneic yayılması tahlil
    1. Isıyla üzerinden tüm cerrahi aletler sterilize ve sınıf II biyolojik Emanet yürüttüğü güvenlik prosedürleri ile kabine deneme gerçekleştirin.
    2. MAC'ler arabellek % 0.5 Sığır serum albumin (BSA) ve 2 mM EDTA 500 ml PBS kullanarak hazırlayın. Arabellek 0.2 µm filtreden süzerek sterilize.
      Not: aşağıdaki deneme sırasında arabellek buz üzerinde tutun.
    3. CD4 elde etmek için+ T hücreleri, CO2 odası kullanarak 8-10 hafta-in yaş OT-II T-hücre reseptör (TCR) transgenik fareler ötenazi. Parçalanmış bir tahta üzerine fareyi getirin ve % 70 etanol ile durulayın. Karın sol tarafındaki dalak cerrahi makas ve forseps kullanarak yalıtmak.
    4. 2 ml PBS ile dalak bir 6 cm kültür tabak koyun ve bir 40 mikron hücre süzgeç geçirerek dalak bin dereden su getirmek için bas-3 ml şırınga parça arka kullanın.
    5. Hücre süspansiyon ve 5 dakika için 300 x g, santrifüj toplamak.
    6. Hücre Pelet MAC'ler arabellek 400 μl içinde resuspend.
    7. CD4 100 μl eklemek+ T hücre Biotin-antikor kokteyl 4° c 5 dakika için.
      Not: Antikor kokteyl CD4 dışındaki diğer hücre türleri üzerinde bağlar+ T hücreleri, CD8a, CD11b, CD11c, CD19, CD25, CD45R gibi (B220), CD49b (DX5), CD105, Anti-MHC sınıf II, Ter-119 ve TCRγ/δ.
    8. MAC'ler arabelleği 300 μl ve anti-Biotin boncuk (Tablo reçetesi) 200 μl 4 ° C'de 10 dakika için ekleyin.
    9. Sütun oluşan yer ferromanyetik küre (Malzemeler tablo) ve ön ayırma alanını seçin ve MAC'ler arabellek 3 ml ile durulayın filtrede birlikte manyetik.
    10. MAC'ler arabelleği 9 ml hücreleri ve 300 x g, santrifüj 5 dakika için ekleyin.
    11. Hücre Pelet 3 ml MAC'ler arabellek resuspend ve sütun uygulayın. Toplamak akışı içeren CD4 aracılığıyla+ T hücreleri.
    12. Başka bir 3 ml MAC'ler arabelleği sütun yıkama ve aynı zamanda akış aracılığıyla toplamak.
    13. Dalak pan DCs elde etmek için CO2 odası kullanarak C57BL/6 fareler 8-10 hafta-in yaş ötenazi. Parçalanmış bir tahta üzerine fareyi getirin ve % 70 etanol ile durulayın. Karın sol tarafındaki dalak cerrahi makas ve forseps kullanarak yalıtmak. Dalak 2 ml collagenase D çözeltisi içeren bir 6 cm kültür tabak koyun (2 mg/ml collagenase D çözünmüş kalsiyum, magnezyum içeren HBSS).
    14. 1 ml collagenase D çözeltisi dalak için iki kez 1 ml şırınga ve bir 25 G iğne ile enjekte. Dalak küçük parçalar halinde küçük makasla kesilmiş.
    15. Salla ve 25 dakika için oda sıcaklığında kuluçkaya.
    16. 0, 5 M EDTA 500 μl, oda sıcaklığında 5 dakika için ekleyin.
      Not: 3.1.13-3.1.14 adımlardan DCs verimini artırmak için kritik öneme sahiptir.
    17. Şimdi itmek-3 ml şırınga parça arka tarafından geçen 40 mikron hücre süzgeç dalak Bulamaç kıyma ve 300 x g 5 dakika için de centrifuging tarafından hücre süspansiyon toplamak için kullanın.
    18. Hücre Pelet MAC'ler arabellek, 50 μl FcR engelleme reaktif ve Pan dendritik hücre Biotin-antikor kokteyl, 100 μl 4 ° C'de 10 dakika için 350 μl resuspend.
      Not: Antikor DC'ler tarafından ifade değil antijenlere karşı kokteyl.
    19. Hücreleri 300 x g 5 dakika için de 9 ml MAC'ler arabellek ve santrifüj ekleyerek yıkayın.
    20. Hücre Pelet MAC'ler arabellek 800 μl içinde resuspend ve anti-Biotin boncuk 200 μl 4° C'de 10 dakika için ekleyin.
    21. DCs toplamak için 3.1.9-3.1.11 gelen adımları yineleyin.
    22. Başka bir 3 ml MAC'ler arabelleği sütun iki kez yıkama ve aynı zamanda akış aracılığıyla toplamak.
    23. 2 x 105 DCs/ml 100-400 nM CDDO DFPA 37 ° c+ için 1 saatlik ayrı, etiket CD4 T hücreleri (1 x 107/ml) içinde cihaz 15 dakika süreyle 37 ° C'de 1 mikron CFSE ile tedavi, PBS ile yıkayın ve son konsantrasyonu 2 x 106 T hücre/ml almak için birimin yeniden ayarlayabilirsiniz.
    24. Daha sonra bir 96-şey tabak içinde tedavi dendritik hücreler 100 μl CFSE etiketli CD4 aynı hacmi ile ortak kültür+ T hücreleri,--dan belgili tanımlık yukarıda merdiven-1:10 almak için toplanan her ikisi de oranı. Şimdi 100 ng/mL ovalbumin (OVA) peptid 323-329 iyi ve ölçü CFSE yoğunluk akış sitometresi tarafından T hücrelerinin başına 2-3 gün sonra kuluçka ekleyin.
      Not: Hücre sayıları ve oranı DCs ve T hücreleri bizim önceki iş37optimize edilmiştir.
  2. Pasif neden BMDCs enjekte edilerek EAE Geniş puls miyelin Oligodendrocyte glikoprotein (MOG) (35-55)
    1. 2 ml 1 x 106 BMDCs/ml 6 iyi-plaka bir kuyu başına 1 saat kuluçka için 100-400 nM CDDO-DFPA içinde kültür orta ile plaka.
    2. 10 ng/ml LPS 24 kuluçka için ekleyin gönderilen.
    3. 100 μg/ml MOG (35-55) 4 kuluçka için ekleyin gönderilen.
    4. Hücre süspansiyon ve 5 dakika için 300 x g, santrifüj hasat.
    5. Hücre Pelet PBS ile resuspend ve hücreleri saymak.
    6. Subkutan 200 μl 8-10 hafta yaşlı kadın C57BL/6 farelere (her arka bacak içine 100 μl) 2 x 106 hücrelerinin enjekte et.
    7. BMDC enjeksiyon ve 48 gün gönderilen. daha sonra 200 enjekte ng boğmaca toksin (PTX) her fare.
    8. Adımları 3.2.6-3.2.7, 4 hafta boyunca haftada bir kez yineleyin.
    9. EAE klinik belirtileri günlük standart ölçütleri37 (0,5-topal kuyruk sonunda, 1-topal kuyruk, 2-orta arka bacak zayıflık, 3 şiddetli hind uzuv zayıflık, 4-tam hind felç, 5-kesici veya can çekişen devlet, 6-ölüm) kullanarak değerlendirmek.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Farklılaşma ve BMDCs seçimi:

Kemik iliği progenitör hücre GM-CSF ve Il-4 iDCs 7 gün (Şekil 1A) ayırt etmek için tam RPMI ortamda kültürlü. Gün 1, hücreleri küçük içinde büyüklük ve küresel morfoloji gösterdi. Önce gün 3 taze orta yerine hücreleri form kümeleri için yardımcı oldu ve aynı zamanda CD11c nüfusu arttı PBS ile yıkama+ hücreleri. Günde 4, BMDCs boyutunda büyütül...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu kağıt için tekrarlanarak iDCs oluşturmak ve daha sonra onları TolDCs ayırt etmek için kullanılabilir verimli bir iletişim kuralı tanımlar ve önerdiğimiz bu TolDC ikna etmek için yeni moleküler hedef aracıları kapasitesini değerlendirmek için uygulanabilir fenotip. Bu raporda açıklanan, hangi biz ilk yüzey ligandlar TolDC ifade tarafından qRT-PCR ve ELISA tarafından ölçülen DC sitokin profil bir değerlendirmesini ve ardından akış sitometresi analiz bir sıra takip ettik. Son olarak, TolDCs immunoregulatory fonksiyonu T ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tekrar ilaç CDDO DFPA verdiğiniz için teşekkür ederiz. Ayrıca Jane ve Lee Seidman sandalye Pediatrik kanser yenilik (John Letterio) desteğiyle anıyoruz. Bu eser Savunma Bakanlığı tarafından [W81XWH-12-1-0452]; desteklenmiştir Angie Fowler ergen ve Genç Yetişkin kanser araştırma girişimiyle durumda kapsamlı Kanser Merkezi; ve FJ Callahan temelden Hsi-Ju Wei Callahan mezunu Scholar Ödülü.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
CDDO-DFPA (RTA-408)Reata Pharmaceuticalsev sentezindeHücre kültürü
Fare GM-CSFPeprotech Inc.315-03BMDC farklılaşma
Fare IL-4Peprotech Inc.214-14BMDC farklılaşması
Lipopolisakkaritler (LPS)Sigma Aldrich Inc.L2880Hücre kültürü
ve beta;-merkaptoetanolSigma Aldrich Inc.516732Hücre kültürü
Boğmaca toksini (PTX)Ar-Ge D sistemleri3097EAE indüksiyon
MOG (35– 55) peptit21. yüzyıl Biyokimyasallarıev sentezindeEAE indüksiyonu
Tripan mavisiGibco, Yaşam Teknolojileri15250-061Hücre kültürü
RPMI-1640 artı L-glutaminThermoFisher Scientific11875-093Hücre kültürü
Esansiyel olmayan amino asit (100X)ThermoFisher Scientific11140050Hücre kültürü
HEPESThermoFisher Scientific15630080Hücre kültürü
penisilin/streptomisinThermoFisher Scientific15140122Hücre kültürü
40 μ m hücre süzgeciCorning352340Hücre izolasyonu
PE konjuge CD80BD Biosciences557227Akış sitometrisi
PE konjuge CD86BD Biosciences555665Akış sitometrisi
PE konjuge PD-L1BioLegend124307Akış sitometrisi
APC konjuge MHCIIMiltenyi Biotec Inc.130-112-388Akış sitometrisi
APC-konjuge CD11cBD Biosciences340544Akış sitometrisi
İzotip, uyumlu, PEMiltenyi Biotec, Inc.130-091-835Akış sitometrisi
İzotipi ile eşleşen APCMiltenyi Biotec Inc.130-091-836Akış sitometrisi
CFSEBioLegend423801T hücresi proliferasyon testi
Pan dendritik hücre izolasyon kitiMiltenyi Biotec Inc.130-100-875T hücre proliferasyon deneyi
FcR Bloke Edici ReaktifMiltenyi Biotec Inc.130-100-875T hücre proliferasyon deneyi
Pan Dendritik Hücre Biyotin-Antikor KokteyliMiltenyi Biotec Inc.130-100-875T hücre proliferasyon deneyi
Anti-Biotin Mikro BoncuklarMiltenyi Biotec Inc.130-100-875T hücre proliferasyon deneyi
CD4 + T hücre izolasyon kitiMiltenyi Biotec Inc.130-104-454T hücresi proliferasyon deneyi
CD4 + T hücresi Biotin-Antikor KokteyliMiltenyi Biotec Inc.130-104-454T hücre proliferasyon deneyi,
Anti-Biotin Mikro BoncuklarMiltenyi Biotec, Inc.130-104-454T hücre proliferasyon testi
ACK parçalama tamponuThermoFisher ScientificA1049201BMDC farklılaşması
1 ml şırıngaBD Biosciences309626T hücresi proliferasyon testi
3 ml şırıngaBD Biosciences309588BMDC farklılaşması
25G iğneBD Biosciences309626T hücre proliferasyon testi
23G iğneBD Biosciences309588BMDC farklılaşması
BSASigma Aldrich Inc.A2058T hücresi proliferasyon deneyi
EDTAThermoFisher Scientific15575020T hücresi proliferasyon testi
LS SütunuMiltenyi Biotec Inc.130-042-401T hücre proliferasyon deneyi
Ön Ayırma FiltresiMiltenyi Biotec Inc.130-095-823T hücre proliferasyon deneyi,
kollajenaz DSigma Aldrich, Inc.11088858001T hücresi proliferasyon testi
HBSSThermoFisher Scientific14025076T hücresi proliferasyon testi
ovalbümin (OVA) peptidi 323– 329Sigma Aldrich A.Ş.O1641T hücre proliferasyon deneyi
Fare IFN-&gama; TaqMan probuThermoFisher ScientificMm01168134_m1qRT-PCR
Fare IL-12a TaqMan probuThermoFisher ScientificMm00434165qRT-PCR
Fare IL-12 p70 DuoSet ELISAR& D sistemleriDY419-05ELISA
Fare EDN-1 ELISARayBiotechELM-EDN1-1ELISA
TNF-&alfa; TaqMan probuThermoFisher ScientificMm00443258qRT-PCR
Fare TNF-&alfa; Quantikine ELISA KitiR& D sistemleriMTA00BELISA
IL-6 TaqMan probuThermoFisher ScientificMm00446190qRT-PCR
Fare IL-6 Quantikine ELISA KitiR& D sistemleriM6000BELISA
IL-23a TaqMan probuThermoFisher ScientificMm01160011qRT-PCR
Fare IL-23 DuoSet ELISAR& D sistemleriDY1887-05ELISA
IL-4, TaqMan probuThermoFisher ScientificMm99999154_m1qRT-PCR
IL-10, TaqMan probuThermoFisher ScientificMm01288386_m1qRT-PCR
TGF-β TaqMan probuThermoFisher ScientificMm01178820_m1qRT-PCR
Anti-Heme Oksijenaz 1 antikoruAbcamab13248Western blotting
Anti-β-aktin antikoruAbcamab8226Western blotting
CFX96 Dokunmatik Gerçek Zamanlı PCR Tespit SistemiBio-Rad Inc.qRT-PCR
BD FACSCalibur Hücre Analiz CihazıBD BiosciencesAkış sitometrisi
, , ,, , : , , , , ,

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Steinman, R. M., Cohn, Z. A. Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice. I. Morphology, quantitation, tissue distribution. J Exp Med. 137 (5), 1142-1162 (1973).
  2. Inaba, K., et al. Efficient presentation of phagocytosed cellular fragments on the major histocompatibility complex class II products of dendritic cells. J Exp Med. 188 (11), 2163-2173 (1998).
  3. Banchereau, J., et al. Immunobiology of dendritic cells. Annu Rev Immunol. 18, 767-811 (2000).
  4. Sallusto, F., Lanzavecchia, A. Efficient presentation of soluble antigen by cultured human dendritic cells is maintained by granulocyte/macrophage colony-stimulating factor plus interleukin 4 and downregulated by tumor necrosis factor alpha. J Exp Med. 179 (4), 1109-1118 (1994).
  5. Hemmi, H., Akira, S. TLR signalling and the function of dendritic cells. Chem Immunol Allergy. 86, 120-135 (2005).
  6. Caux, C., et al. B70/B7-2 is identical to CD86 and is the major functional ligand for CD28 expressed on human dendritic cells. J Exp Med. 180 (5), 1841-1847 (1994).
  7. Chastain, E. M., Duncan, D. S., Rodgers, J. M., Miller, S. D. The role of antigen presenting cells in multiple sclerosis. Biochim Biophys Acta. 1812 (2), 265-274 (2011).
  8. Smeltz, R. B., Chen, J., Ehrhardt, R., Shevach, E. M. Role of IFN-gamma in Th1 differentiation: IFN-gamma regulates IL-18R alpha expression by preventing the negative effects of IL-4 and by inducing/maintaining IL-12 receptor beta 2 expression. J Immunol. 168 (12), 6165-6172 (2002).
  9. Gyulveszi, G., Haak, S., Becher, B. IL-23-driven encephalo-tropism and Th17 polarization during CNS-inflammation in vivo. Eur J Immunol. 39 (7), 1864-1869 (2009).
  10. Kronenberg, M., Rudensky, A. Regulation of immunity by self-reactive T cells. Nature. 435 (7042), 598-604 (2005).
  11. Boks, M. A., et al. IL-10-generated tolerogenic dendritic cells are optimal for functional regulatory T cell induction--a comparative study of human clinical-applicable DC. Clin Immunol. 142 (3), 332-342 (2012).
  12. Anderson, A. E., et al. Tolerogenic dendritic cells generated with dexamethasone and vitamin D3 regulate rheumatoid arthritis CD4+ T cells partly via transforming growth factor-beta1. Clin Exp Immunol. 187 (1), 113-123 (2017).
  13. Chauveau, C., et al. Heme oxygenase-1 expression inhibits dendritic cell maturation and proinflammatory function but conserves IL-10 expression. Blood. 106 (5), 1694-1702 (2005).
  14. Maldonado, R. A., von Andrian, U. H. How tolerogenic dendritic cells induce regulatory T cells. Adv Immunol. 108, 111-165 (2010).
  15. Schmidt, S., Nino-Castro, A., Schultze, J. Regulatory dendritic cells: there is more than just immune activation. Frontiers in Immunology. 3 (274), (2012).
  16. Hilkens, C. M., Isaacs, J. D., Thomson, A. W. Development of dendritic cell-based immunotherapy for autoimmunity. Int Rev Immunol. 29 (2), 156-183 (2010).
  17. Dhodapkar, M. V., Steinman, R. M. Antigen-bearing immature dendritic cells induce peptide-specific CD8(+) regulatory T cells in vivo in humans. Blood. 100 (1), 174-177 (2002).
  18. Dhodapkar, M. V., Steinman, R. M., Krasovsky, J., Munz, C., Bhardwaj, N. Antigen-specific inhibition of effector T cell function in humans after injection of immature dendritic cells. J Exp Med. 193 (2), 233-238 (2001).
  19. Giannoukakis, N., Phillips, B., Finegold, D., Harnaha, J., Trucco, M. Phase I (safety) study of autologous tolerogenic dendritic cells in type 1 diabetic patients. Diabetes Care. 34 (9), 2026-2032 (2011).
  20. Benham, H., et al. Citrullinated peptide dendritic cell immunotherapy in HLA risk genotype-positive rheumatoid arthritis patients. Sci Transl Med. 7 (290), 290ra287(2015).
  21. Bell, G. M., et al. Autologous tolerogenic dendritic cells for rheumatoid and inflammatory arthritis. Ann Rheum Dis. 76 (1), 227-234 (2017).
  22. University Hospital, A. A "Negative" Dendritic Cell-based Vaccine for the Treatment of Multiple Sclerosis: a First-in-human Clinical Trial (MS tolDC). ClinicalTrials.gov. , (2015).
  23. Pujol, F. I. G. T. i Tolerogenic Dendritic Cells as a Therapeutic Strategy for the Treatment of Multiple Sclerosis Patients (TOLERVIT-MS) (TOLERVIT-MS). ClinicalTrials.gov. , (2016).
  24. Varea, S. Treatment of Multiple Sclerosis and Neuromyelitis Optica With Regulatory Dendritic Cell: Clinical Trial Phase 1 B. ClinicalTrials.gov. , (2017).
  25. Jauregui-Amezaga, A., et al. Intraperitoneal Administration of Autologous Tolerogenic Dendritic Cells for Refractory Crohn's Disease: A Phase I Study. J Crohns Colitis. 9 (12), 1071-1078 (2015).
  26. Mahnke, K., Schmitt, E., Bonifaz, L., Enk, A. H., Jonuleit, H. Immature, but not inactive: the tolerogenic function of immature dendritic cells. Immunol Cell Biol. 80 (5), 477-483 (2002).
  27. Lutz, M. B., Schuler, G. Immature, semi-mature and fully mature dendritic cells: which signals induce tolerance or immunity? Trends Immunol. 23 (9), 445-449 (2002).
  28. Suciu-Foca, N., et al. Molecular characterization of allospecific T suppressor and tolerogenic dendritic cells: review. Int Immunopharmacol. 5 (1), 7-11 (2005).
  29. Wakkach, A., et al. Characterization of dendritic cells that induce tolerance and T regulatory 1 cell differentiation in vivo. Immunity. 18 (5), 605-617 (2003).
  30. Szeles, L., et al. 1,25-dihydroxyvitamin D3 is an autonomous regulator of the transcriptional changes leading to a tolerogenic dendritic cell phenotype. J Immunol. 182 (4), 2074-2083 (2009).
  31. Unger, W. W., Laban, S., Kleijwegt, F. S., vander Slik, A. R., Roep, B. O. Induction of Treg by monocyte-derived DC modulated by vitamin D3 or dexamethasone: differential role for PD-L1. Eur J Immunol. 39 (11), 3147-3159 (2009).
  32. Reichardt, W., et al. Impact of mammalian target of rapamycin inhibition on lymphoid homing and tolerogenic function of nanoparticle-labeled dendritic cells following allogeneic hematopoietic cell transplantation. J Immunol. 181 (7), 4770-4779 (2008).
  33. Woltman, A. M., et al. The effect of calcineurin inhibitors and corticosteroids on the differentiation of human dendritic cells. Eur J Immunol. 30 (7), 1807-1812 (2000).
  34. Hackstein, H., Thomson, A. W. Dendritic cells: emerging pharmacological targets of immunosuppressive drugs. Nat Rev Immunol. 4 (1), 24-34 (2004).
  35. Torres-Aguilar, H., Blank, M., Jara, L. J., Shoenfeld, Y. Tolerogenic dendritic cells in autoimmune diseases: crucial players in induction and prevention of autoimmunity. Autoimmun Rev. 10 (1), 8-17 (2010).
  36. Rutella, S., Danese, S., Leone, G. Tolerogenic dendritic cells: cytokine modulation comes of age. Blood. 108 (5), 1435-1440 (2006).
  37. Wei, H. J., Pareek, T. K., Liu, Q., Letterio, J. J. A unique tolerizing dendritic cell phenotype induced by the synthetic triterpenoid CDDO-DFPA (RTA-408) is protective against EAE. Sci Rep. 7 (1), 9886(2017).
  38. van Etten, E., Mathieu, C. Immunoregulation by 1,25-dihydroxyvitamin D3: basic concepts. J Steroid Biochem Mol Biol. 97 (1-2), 93-101 (2005).
  39. Pan, J., et al. Dexamethasone inhibits the antigen presentation of dendritic cells in MHC class II pathway. Immunol Lett. 76 (3), 153-161 (2001).
  40. Zhu, J., Paul, W. E. Heterogeneity and plasticity of T helper cells. Cell Res. 20 (1), 4-12 (2010).
  41. Spirig, R., et al. TLR2 and TLR4 agonists induce production of the vasoactive peptide endothelin-1 by human dendritic cells. Mol Immunol. 46 (15), 3178-3182 (2009).
  42. Walton, E. L. Make immunological peace not war: Potential applications of tolerogenic dendritic cells. Biomed J. 40 (2), 77-79 (2017).
  43. Constantinescu, C. S., Farooqi, N., O'Brien, K., Gran, B. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) as a model for multiple sclerosis (MS). Br J Pharmacol. 164 (4), 1079-1106 (2011).
  44. Xu, Y., Zhan, Y., Lew, A. M., Naik, S. H., Kershaw, M. H. Differential development of murine dendritic cells by GM-CSF versus Flt3 ligand has implications for inflammation and trafficking. J Immunol. 179 (11), 7577-7584 (2007).
  45. Angelov, G. S., Tomkowiak, M., Marcais, A., Leverrier, Y., Marvel, J. Flt3 ligand-generated murine plasmacytoid and conventional dendritic cells differ in their capacity to prime naive CD8 T cells and to generate memory cells in vivo. J Immunol. 175 (1), 189-195 (2005).
  46. Lowes, M. A., et al. Increase in TNF-alpha and inducible nitric oxide synthase-expressing dendritic cells in psoriasis and reduction with efalizumab (anti-CD11a). Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (52), 19057-19062 (2005).
  47. Schnorrer, P., et al. The dominant role of CD8+ dendritic cells in cross-presentation is not dictated by antigen capture. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (28), 10729-10734 (2006).
  48. Wang, W., Li, J., Wu, K., Azhati, B., Rexiati, M. Culture and Identification of Mouse Bone Marrow-Derived Dendritic Cells and Their Capability to Induce T Lymphocyte Proliferation. Med Sci Monit. 22, 244-250 (2016).
  49. Lutz, M. B., et al. An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow. J Immunol Methods. 223 (1), 77-92 (1999).
  50. Griffin, M. D., et al. Dendritic cell modulation by 1alpha,25 dihydroxyvitamin D3 and its analogs: a vitamin D receptor-dependent pathway that promotes a persistent state of immaturity in vitro and in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (12), 6800-6805 (2001).
  51. Bscheider, M., Butcher, E. C. Vitamin D immunoregulation through dendritic cells. Immunology. 148 (3), 227-236 (2016).
  52. Castiello, L., et al. Monocyte-derived DC maturation strategies and related pathways: a transcriptional view. Cancer Immunol Immunother. 60 (4), 457-466 (2011).
  53. Decker, W. K., et al. Deficient T(H)-1 responses from TNF-alpha-matured and alpha-CD40-matured dendritic cells. J Immunother. 31 (2), 157-165 (2008).
  54. Longhi, M. P., et al. Dendritic cells require a systemic type I interferon response to mature and induce CD4+ Th1 immunity with poly IC as adjuvant. J Exp Med. 206 (7), 1589-1602 (2009).
  55. Link, H., Huang, Y. M., Xiao, B. G. Dendritic cells in experimental allergic encephalomyelitis and multiple sclerosis. J Neuroimmunol. 100 (1-2), 102-110 (1999).
  56. Leech, M. D., et al. Cutting edge: IL-6-dependent autoimmune disease: dendritic cells as a sufficient, but transient, source. J Immunol. 190 (3), 881-885 (2013).
  57. Saul, L., Besusso, D., Mellanby, R. J. LPS-matured CD11c+ bone marrow-derived dendritic cells can initiate autoimmune pathology with minimal injection site inflammation. Lab Anim. 51 (3), 292-300 (2017).
  58. Aghdami, N., Gharibdoost, F., Moazzeni, S. M. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) induced by antigen pulsed dendritic cells in the C57BL/6 mouse: influence of injection route. Exp Anim. 57 (1), 45-55 (2008).
  59. Wilson, H. L. Limitations with in vitro production of dendritic cells using cytokines. J Leukoc Biol. 75 (4), 600-603 (2004).
  60. Ni, K., O'Neill, H. C. Development of dendritic cells from GM-CSF-/- mice in vitro : GM-CSF enhances production and survival of cells. Dev Immunol. 8 (2), 133-146 (2001).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Tolerogenic Dendritic CellsBone Marrow Derived DCsCDDO DFPA TreatmentFlow Cytometry AnalysisT Cell Proliferation AssayMagnetic Cell SortingCytokine Gene ExpressionPro Inflammatory ReductionAutoimmune Encephalomyelitis ModelImmunosuppressive Response Testing

Related Articles