Yöntem makalesi

Immunostimulatory Ajan değerlendirme: Lenfoid doku çıkarma ve Enjeksiyon rota bağımlı dendritik hücre aktivasyonu

DOI:

10.3791/57640

⸱

16 Eylül 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Shanghai Public Health Clinical Center, Shanghai Medical College, Fudan University, 2Department of Medical Biotechnology, Yeungnam University, 3Department of Chemistry, Pukyong National University, 4Marine-integrated Bionics Research Center, Pukyong National University, 5Department of Biochemistry, Chungbuk National University, 6Department of Biomedical Sciences, University of Ulsan College of Medicine, Asan Medical Center

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lenfoid dendritik hücre aktivasyonu sınamak için lenfatik doku sonraki çıkarma deneysel yordamları bir immunostimulating nanomaterial tedaviden sonra açıklanmıştır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yeni bir tedavi aracı immünoterapi veya aşı için değerlendirme için bağışıklık Hücre aktivasyonu lenf dokularda Analizi esastır. Burada, biz farklı yönetim yolları fare nanopartikül formundan bir roman lipid-DNA immunostimulant immünolojik etkileri araştırdık: oral, burunici, subkutan, footpad, mayi ve intravenöz. Bu iğneleri doğrudan bağışıklık yanıtı ve lenfatik doku hasat etkileyecektir ve dokularda dendritik hücre (DC) aktivasyon analizi bu değerlendirmeler çok önemli parçalarıdır. Mediastinal lenf bezleri (mLNs) çıkarma boyutunu ve konumunu bu organ nedeniyle önemli ama oldukça karmaşık. İnguinal lenf nodu (ILN), milyon ve dalak hasat ve DC etkinleştirme tarafından Akış Sitometresi Analizi için kademeli bir yordam açıklanır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gelişmeler İmmünoloji ve Nanomalzemeler Biyomedikal ilaç dağıtım ve immunostimulation de dahil olmak üzere, uygulamalar için potansiyel yeni tedavi stratejileri bir bolluk yol açmıştır. Yönetim rota optimizasyonu immunostimulatory ajanların etkinliğini etkileyen çok önemli bir yönüdür. DNA'sı oluşan bir immunostimulatory nanopartikül (INP) tarafından microphase ayrılık lipid-DNA1amfifilik yapısı nedeniyle kendi kendini monte yeni geliştirilen bir nano-bağışıklık adjuvan var. Bu nedenle, iletişim kuralları için farklı yollar ve inguinal lenf nodu (ILN), mediastinal LN (milyon) ve dalak, gibi uygun doku hasat için üç yordamdan üzerinden malzeme1 in vivo yönetimini içeren INP açıklanan. Son olarak, bu dokuların dendritik hücre (DC) için harekete geçirmek, en güçlü antijen sunan hücreler bağışıklık sistemi analiz edildi. Bu iletişim kuralı antijenleri, antikorlar veya diğer bağışıklık adjuvan2değerlendirmek için de uygulanabilir.

Çünkü bu büyük söz göstermiştir bir ajan INP formülasyonu test ettik. INP olduğunu Toll benzeri reseptör 9 (TLR9) nükleik asitleri, immunostimulation hangi değerlendirilmesi için etkinliği farklı enjeksiyon yöntemleri3test etmek için gerekli içerir adjuvan malzeme. Bu bağlamda, DCs uyarılması vivo içinde değerlendirme için güçlü bir bitiş noktası olur. Sonra antijen veya immunostimulatory molekül DC'ler tarafından periferik dokularda veya kan fagosite, bu hücrelerin lenfoid organlara dalak ve INS4,5gibi göç eder. Böylece, DC harekete geçirmek dalak, ILN ve milyon enjekte hayvanların analiz edildi. Düzgün bu dokuların hasat bu nedenle da bir roman adjuvan veya patojenler5bağışıklık yanıtı değerlendirmek için çok önemlidir. Böyle doku hasat da bir roman immünolojik metodoloji bir kanser tedavisi olarak geliştirmek için önemlidir. Ayrıca, bu iletişim kuralını anti-insan immün yetmezlik virüsü tedavi6gibi diğer ilaçların etkinliğini doğrulamak için kullanılabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hayvan işleme, fedakarlık ve organ yalıtımı da dahil olmak üzere tüm deneysel prosedürler Uluslararası hayvan bakım ve kullanım Komitesi Şangay halk sağlığı klinik merkezi ve Asan Tıp Merkezi'nde kuralları sıkı doğrultusunda gerçekleştirilmiştir. Çalışma protokolü Şangay halk sağlığı klinik merkezi hayvan deneyleri etiği üzerine ilgili komiteleri tarafından kabul edildi (fare protokol numarası: SYXK-2010-0098) ve Asan Tıp Merkezi (2016-02-168).

1. malzeme hazırlanması

Not: Nano adjuvan INP, kendinden montajlı lipid-DNA taşımak için yani U4T, oluşan ve KSY-motif içeren oligonükleotid, eCpG, mevcut çalışmada immünoterapi ve aşılama için uygun enjeksiyon yol fareler2 test etmek için istihdam edildi . Önemlisi, diğer potansiyel terapötik moleküllerin antijenleri, antikorlar ve adjuvan Ajan INP için yedek olabilir ve aşağıda açıklanan aynı yöntemi kullanarak test.

  1. INP formülasyonu2,4,7
    1. U4T tavlama (160 µM, taşıyıcı) ile eCpG (80 µM, bir TLR9 agonist içeren) 1 x fosfat tamponlu tuz (PBS, pH 7,4) ve MgCl2 (2 mM) huzurunda. Tavlama için standart arasında 50 ve 110 µL PCR tüp içinde birimdir. Karışımı 10 min için 95 ° c ısı ve sonra yavaş yavaş (1 ° C/16 dk) bir thermocycler kullanarak 25 ° C'ye serin. Tavlama protokol yaklaşık 2 h gerektirir.
      Dikkat: U4T içeren sıvı çok köpüklü ve dikkatle ele alınması gerekir.
    2. 50 µL aliquots INP hazırlık yapmak; 50 µL her enjeksiyon için malzeme kullanın.
      Not: enjeksiyon başına 100 µL durumunda 1.1 malzemelerin uygun hesaplama ile arasındaki adımları yineleyin.

2. genel hayvan yordamları

Not: fareler işlemek için alternatif yöntemler laboratuvar gereksinimleri ve onaylanmış hayvan protokolleri8bağlı olarak kullanılabilir. 6-hafta-yaşlı C57BL/6 ve dişi fareler fare kullanılan türüdür.

  1. Malzeme listesi
    1. Hazırlamak sıvı anestezi (isoflurane), anestezik makine, karbondioksit (CO2) inhalasyon odası, steril gazlı bez, forseps, fare restrainer, eldiven, çengel forseps, 1-inç diseksiyon makası, 2-inç diseksiyon makası, alkol için Sterilizasyon ve insülin şırınga.
  2. Soluk çeken anestezi
    Not: Anestezi etkilerinin, subkutan, footpad ve fareler9İntravenöz enjeksiyonlar için zorunludur. Bağlı bir buharlaştırıcı makine ve oksijen deposu olan bir indüksiyon odası için bu yordam kullanılır.
    1. Hayvan indüksiyon odasında yerleştirin ve kapağı sıkıca kapattığınızdan emin olun.
    2. 1 L/dk oksijen akışı ve isoflurane için % 4'lük bir indüksiyon seviyesine Buharlaştırıcı ayarını ayarlayın.
    3. Pozlama süresi bağlı olarak hayvan ağırlık odasında hayvanların farklı; Ancak, 10'dan fazla pozlama ve her 5 dk izleme s anestezi10için gereklidir.
      Not: Başarılı anestezi yok pedalı refleks gösterir.
    4. İsoflurane Endüktör açmak ve 1 L/dak isoflurane gaz personel etkilenmemek için oksijen akışı.
  3. Kurban
    1. Bir oda için CO2 inhalasyon kurban NIH "yönergeleri için ötenazi, kemirgenler kullanarak karbon dioksit" uygun olarak hazırlamak11.
  4. Test gag yanıt-e doğru hayvan tamamen feda onaylayın.
    1. Fare düzgün onun ayak ucu pinching ve gag yanıt onaylayarak feda doğrulayın. Bir yanıt varsa, 2.2 adımları yineleyin.
  5. Dezenfeksiyon
    1. Enjeksiyonları veya alkol sprey ve steril gazlı bez ile gruptakiler için kullanılan tüm yüzey alanlarını dezenfekte.
  6. Organ depolama
    1. Forseps tüm yağ ve hasat organları çevreleyen kan kaldırmak için kullanın. Hasat Bu dokular tek tek PBS 3 mL ile dolu bir petri saklayın. Konteyner ve medya sonraki yordamı gereksinimlerine bağlı olarak farklı olabilir.

3. enjeksiyon güzergah

  1. Enjeksiyon bağımlı bağışıklık yanıtı araştırmak için altı enjeksiyon yöntemleri kullanın: oral, burunici, subkutan, footpad, mayi ve intravenöz8,12,13.

4. yalıtım dalak ve lenf bezleri

Not: genellikle büyük fareler lenf düğümleri etrafında inşa yağlar için zordur çünkü genç ve sağlıklı yalın fareler (6 hafta eski) için bu yordamları kullanın kaldırmak ve doğru görselleştirme organ engel olabilir.

  1. Adımları önceden hasat
    Not: Bu bölüm sonrası enjeksiyon ILN, dalak ve immün stimülasyon analiz etmek için fareler gelen mLN hasat açıklar. Yanıt ve dezenfeksiyon yöntemleri gag, kurban için 2.3-2.5 adımlara bakın.
    1. Fareyi cerrahi köpük kuruluna ekstremitelerin pin ve fare ile % 70 etanol ventral tarafında sterilize.
    2. Genital bölge ve bir çadır gibi dış deri kapağı çıkarmak için çengel kullanım forseps yukarıda 2 cm bir konumu seçin. Bu konumda bir yaklaşık 1 cm kesim yapmak ve makas (2 inç) başka diseksiyon kesim yapmadan deri altına kaydırın.
    3. Deri için dikey olarak her iki silah makas (2 inç) ile dış deri kesti. Periton ile kaplı iç organlar ortaya çıkarmak.
    4. PIN derinin dış katmanı.
  2. Yalıtım inguinal lenf düğümünün (ILN)
    1. Aşağı eğik bir mektup 'Y' görünür sol bacak damar birlikte takip bacak sol tarafındaki ILN bulun.
      Not: bir ILN enjeksiyon konumunun aynı tarafta subkutan enjekte fareler için seçin.
    2. Katman iki forseps ile örtülü lipit katmanı rip ve soluk sarı ILN (fasulye şekil, 2 mm) hasat ortaya çıkarmak. Sonraki tedavi ve doku depolama için bkz: adım 2.6.
  3. Yalıtım dalak 14
    1. Karın zarını kullanarak merkezi bir çadır forseps bir elinde kanca ve ince küçük kullanın (1 inç) periton kesmek için diğer elinde makas.
    2. Çengel kullanım forseps bağırsak kavramak ve fare karın sol üst tarafına bağlı kırmızı fasulye gibi dalak (yaklaşık 14 mm uzunluğu) bulmak için çevirmek için sol elinde.
    3. Başka bir set sağ kanca forseps ile diğer organlara ayırma sırasında forseps ile dalak yavaşça çekin. Adım 2.6 dalak depolamak için izleyin.
      Not: kolayca hasarlı yumuşak organ olduğu gibi bakım dalak, hasat gereklidir.
  4. Yalıtım mediastinal lenf düğümünün (milyon)
    Not: Milyon olan yaklaşık 1 cm kaburga altında bulunan ve kalp ve akciğer gibi diğer organlarda kapsamındadır. Konumu ve küçük boyutu nedeniyle, dikkatle forseps ve makas (1 inç) kullanarak çevredeki ortaya çıkarmak önemlidir.
    1. Diyafram kesme ve kaburga ayırma. Kaburga vücut forseps ile tutun ve sonra sol ve sağ tarafında kaburgalar (1 inç) makasla kesme. Kesme kaburga fare omuz üzerinden kalp ve akciğer ortaya çıkarmak için sağda pin.
      Not: kalp ve akciğer, kan damarlarının kesmeme değil için kan sızıntı çok küçük saydam mLN bulmak zor yapar gibi dikkat ediniz. Herhangi bir kan damarları kesersem, yavaşça gazlı bez ile bölgede kan emer.
    2. Omurga maruz kadar çengel forseps sağ elinde kullanarak, kalp ve akciğer yavaşça sağa doğru çevir. Düzenli forseps bir çift sol el sağ bu hasat ile yardımcı olmak için çengel forseps ile ILN kaldırmak için kullanın.
    3. Akciğerleri kapmak ve omurga yaygın maruz kadar onları ters çevirin. (Bir yarı saydam fasulye şekilli yapı yaklaşık 2 mm boyutunda) mLN akciğerler ve omurga arasında yer almaktadır.
    4. MLN çevresini göstermek için çengel forseps ve dokuya ayıklamak için diğer forseps kullanmaktadır.
      Not: MLN dikkatle önce hasat forseps ile kaldırılması gerekir çok sayıda diğer dokulara çevrilidir.
    5. Adım 2.7 yönergeler için bkz: hasat mLN depolama.

5. akış sitometresi için örnek hazırlanması

Not: DCs etkinleştirme hasat ILN, dalak ve mLN tahlil için tek hücreli süspansiyonlar bu dokuların floresans Birleşik antikorlar DC özgü işaretleri, co-stimulatory moleküller ve MHC ile karmaşık lekeli moleküller ve akış sitometresi tarafından analiz.

  1. Tek hücreli süspansiyonlar hazırlanması: dalak
    1. Taze kültür orta (CM) 5 mL 6 mm Kültür çanak içine ekleyin ve buz üzerinde örnekleri yerleştirin.
    2. Çevresindeki kan ve yağ dokuları çıkarın ve doku kültürü çanak kapağı yerleştirin.
    3. Belgili tanımlık doku küçük parçalara kesip (< 1 mm) eğri makas ile kesme. Parçaları iplik tarafından izlenen PBS askıya aşağı doku bir santrifüj 646 × g 5 min için kullanarak ve süpernatant kaldırma.
    4. Örnekleri tekrar CM 3 mL askıya alma ve parçaları ile çözüm collagenase IV 20 dk ile takıma % 2 fetal Sığır serum (FBS) 200 µL sindirmek.
    5. Yavaşça sallayın ve 1 h. filtre uygulamak için naylon mesh yoluyla sindirilmiş doku örneği 37 ° C'kuluçkaya (100 nm) ve onları aşağı spin. 5 mL PBS de tek kişilik hücrelerde yıkama ve süpernatant Santrifüjü tarafından kaldırın.
    6. 5 mL de çözüm izole hücre hücreleri yeniden askıya alma. 5 mL sulu bir katman katman yığını oluşturmak için açik hücre izolasyon çözüm de bir katmanı yeniden yükleyin.
    7. 2012 × g de hücre hazırlık için 10 dk. elde hafif yoğunluk kesir olan süpernatant, santrifüj kapasitesi (< 1.077 g/cm3), sonraki Akış Sitometresi Analizi için.
    8. Bir hemasitometre içeren hücreleri saymak.
  2. Tek hücreli süspansiyonlar hazırlanması: lenf nodu
    1. Adım 5.1.1-5.1.2 izleyin.
    2. 3 - 4 kez pipetting tarafından hücreleri askıya almak için bir 10 mL damlalıklı kullanarak CM 5 mL ekleyin. İyice hücreleri askıya sonra steril naylon mesh hücreler 15 mL konik tüp koleksiyonunda için filtre uygulamak için kullanın.
    3. Hücreleri aşağı vasıl 646 ×g 7 dk. 4 ° C'de için spin ve süpernatant kaldırın.
    4. CM bir ek 5 mL daha iyi hücreleri pipetting tarafından askıya almak için 10 mL damlalıklı içine ekleyin.
    5. PBS ile yıkama ve hücreleri saymak.
  3. Akış Sitometresi Analizi
    1. Aliquot 0.5-1 × 106 hücre (FACS) tüp sıralama her floresans aktif hücre içine.
    2. Vasıl 646 × g 5 min için 4 ° C'de santrifüj kapasitesi ve süpernatant Aspire edin.
    3. 5 floresans Birleşik µL her seyreltilmiş antikor hazırlık hücre Pelet ve girdap yeniden askıya almak için hücrelere ekleme.
      Not: Fluorescently etiketli antikorlar ışığa duyarlı olduğundan hücre Pelet ışık maruz mümkün olduğunca korumak önemlidir. Bir antikor ana karışım oluşturmak ve her zaman Fc blok ekleyin.
    4. PBS, ısı inaktive düzenli FBS ve % 0.1 Sodyum azid %1 100 µL kullanarak FACS arabellek hazırlayın.
    5. Örnek 30 dk. 2-4 mL FACS hücrelerle tampon ve örnek 4 ° C'de 7 min için 1700 rpm'de santrifüj kapasitesi durulama için 4 ° C'de tüpü yerleştirin
    6. Karanlıkta FACS tamponunun 500 µL hücrelerde yeniden askıya alma. Hücreleri akış sitometresi tarafından analiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

INP uygun enjeksiyon yollar lenfatik doku DC harekete geçirmek için değerlendirmek için DC nüfus soy olarak tanımlanmış -CD11c+ hücreleri dalak, ILN ve milyon ve co-stimulatory molekülleri ifade düzeyde analiz. INP subkutan (sc) ve şarapla (IV) enjeksiyon tedavisi (Şekil 2B ve 2 C) dalak ve ILN DCs CD40, CD80 ve CD86 ifadede önemli artışlar terfi. Footpad ve mayi (IP) enjeksiyon INP da önemli ö...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Birçok gelişmeler nanoteknoloji ve İmmünoloji ilaç dağıtım ve immunostimulation tedavi araştırma yoluyla elde ettik. Enjeksiyon yöntemi dikkatli seçimi hangi da çalışmanın odak oldu immunostimulation için önemli olduğu bilinmektedir.

Farklı enjeksiyon yolları hangi rotayı en iyi sonuç verdiğini belirlemek için bir doğal toksik olmayan ve biyolojik olarak parçalanabilen DNA tabanlı malzeme için INP (immunostimulatory nanopartikül) değerlendirildi. Bu yaklaşım aynı zamanda antikorlar antijenleri...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu araştırma yaratıcı malzemeleri bulma Program aracılığıyla Ulusal Araştırma Vakfı, Kore (deniz biyoteknoloji programı tarafından finanse edilen ve Bilim Bakanlığı, ICT ve gelecek planlama (NMK-2017M3D1A1039421) tarafından finanse edilen NMG) tarafından desteklenmiştir Okyanuslar Bakanlığı ve balıkçılık, Kore ve bir hibe (20150220).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Malzeme< / güçlü >
fosfat tampon salinCorning21-040-CVRYıkama organları
(PBS, pH 7.4)
izofluran çözeltisi  Aesica Queenborough limited26675-46-7Anestezi süreci
Tüberkülin 1 mL şırınga -JunglimN/AEnjeksiyon
50 mL konik tüp S.P.L50050Anestezi işlemi
1mL İnsülin Şırıngası (BD Ultra-İnce < sup>TM < / sup>­ II)_short iğne324826İntramüsküler Enjeksiyon
DMEM Yüksek GlikozHiklonuSH30081.01Organların depolanması
Histopak  Sigma-Aldrich10771FACS analizi
Etil alkol susuz %99,5  Daejung4022-4110Dezenfektan
< güçlü > Ekipmanlar< / güçlü >
FineCycler C100 (Thermocycler)Ssufine-Anealing
Santrifüj
Santrifüj FACS tüpü ve nbsp;FALCON2052FACS analizi
Otomatik Yüksek Performanslı Akış SitometresiBD (ABD), FACSVerse-FACSanalizi

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Park, H. Preparation of dodecynyl modified DNA nanoparticles with unmethylated CpG adjuvant and ovalbumin for immunostimulation. , Department of Chemistry. Pukyong National University, Master Thesis. (2016).
  2. Jin, J. O., Park, H., Zhang, W., de Vries, J. W., Gruszka, A., Lee, M. W., Ahn, D. R., Herrmann, A., Kwak, M. Modular delivery of CpG-incorporated lipid-DNA nanoparticles for spleen DC activation. Biomaterials. 115, 81-89 (2017).
  3. Pal, I., Ramsey, J. D. The role of the lymphatic system in vaccine trafficking and immune response. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (10-11), 909-922 (2011).
  4. Jin, J. O., Kwak, M., Xu, L., Kim, H., Lee, T. H., Kim, J. O., Liu, Q., Herrmann, A., Lee, P. C. W. Administration of soft matter lipid-DNA nanoparticle as the immunostimulant via multiple routes of injection in vivo. ACS Biomaterial Science & Engineering. 3 (9), 2054-2058 (2017).
  5. Worbs, T., Hammerschmidt, S. I., Förster, R. Dendritic cell migration in health and disease. Nature Review Immunology. 17 (1), 30-48 (2017).
  6. Milling, S. W. F., Jenkins, C., MacPherson, G. Collection of lymph-borne dendritic cells in the rat. Nature Protocols. 1 (5), 2263-2270 (2006).
  7. Desormeaux, A., Bergeron, M. G. Lymphoid tissue targeting of anti-HIV drugs using liposomes. Methods in Enzymology. 391, 330-351 (2005).
  8. Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. Journal of Visualized Experiments. (67), (2012).
  9. Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. Administration of substances to laboratory animals: routes of administration and factors to consider. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 50 (5), 600-613 (2011).
  10. General anesthesia of mice and rats. , Animal Care and Use Standards Committee. (2016).
  11. Guidelines for the Euthanasia of Animals. , Veterinary Record. (2013).
  12. JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Compound Administration I. Journal of Visualized Experiments. , (2018).
  13. JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Compound Administration III. Journal of Visualized Experiments. , (2018).
  14. Mebius, R. E., Kraal, G. Structure and function of the spleen. Nature Review Immunology. 5 (8), 606-616 (2005).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Lymphoid Tissue ExtractionDendritic Cell ActivationFlow CytometryMediastinal Lymph NodeInguinal Lymph NodeSpleen IsolationImmunostimulatory AgentInjection RouteDC Activation AnalysisNanoparticle Immunostimulant

İlgili makaleler