ImageJ kullanarak doku hazırlanan immünhistokimya Photomicrographs üzerinden Microglia morfoloji miktarının

Özet

Microglia anket ve değişmiş beyin fizyolojisi kantitatif değerlendirilecek morfolojik değişiklikleri ile tepki beyin bağışıklık hücreleri vardır. Bu iletişim kuralı özetliyor bir ImageJ microglia morfoloji hücre yaklaşım, karmaşıklık ve şekli gibi ölçümleri göre sürekli veri olarak temsil etmek için analiz protokolüne dayalı.

Özet

Microglia beyin homeostazı katılmak ve sürekli çevreleri disfonksiyon, yaralanma ve hastalık için anket beyin fagositler vardır. İlk müdahale olarak microglia nöron ve glia fonksiyon bozukluğu azaltmak için önemli işlevleri vardır ve bu süreç içinde onlar çok çeşitli morfolojik değişiklikler tabi. Microglia türleri morfoloji açıklayıcı kategorize edilebilir veya alternatif olarak, hücre yaklaşım, karmaşıklık ve şekil gibi parametreleri için sürekli bir değişken olarak sayılabilir. Tek Kişilik hücrelere microglia miktarının yöntemleri uygulanırken, tüm bir photomicrograph içinde birden çok microglia birkaç teknikleri uygulamak. Bu yöntemin amacı çoklu ölçmek etmektir ve tek hücreler hazır ImageJ protokolleri kullanarak. Bu iletişim kuralı adımları bir özetidir ve floresan ve alan parlak photomicrographs temsilcisi ikili ve skeletonized görüntülere dönüştürmek için ve çözümlemek için önerilen ImageJ eklentileri kullanarak yazılım eklentileri AnalyzeSkeleton (2D/3D) ve FracLac Morfoloji veri toplamak için. Bu eklentiler çıkış işlemi bitiş noktaları, kavşaklar ve uzunluğu yanı sıra karmaşıklığı, hücre şekil ve boyut tanımlayıcıları açısından hücre morfolojisi özetler. Burada açıklanan iskelet Çözümleme Protokolü bir bütün photomicrograph veya bölge (ROI) ilgi içinde birden çok microglia bir bölgesel analizi için uygun ise FracLac bir tamamlayıcı tek hücre analizi sağlar. Kombine, protokol bir amaç, çeşitli microglia türleri morfoloji sağlıklı ve yaralı beyin mevcut arasında tabakalaşmak için kullanılan hassas ve kapsamlı değerlendirme aracı sağlar.

Giriş

Microglia beyin fizyolojisi¹ olanakları bir süreklilik boyunca hiper yaklaşım ve son derece karmaşık türleri morfoloji arasında değişen de-ramified ve protozlar türleri morfoloji^{2 için değişiklikler için bir acil ve çeşitli morfolojik tepki var} . Microglia³polarize ve çubuk şeklinde de olabilir. Microglia hücre yaklaşım yaygın olarak birden çok işlem sahip karmaşık bir şekil tanımlanır ve genellikle bitiş noktası başına hücre sayısı ve hücre süreçleri uzunluğu bildirilir. Microglia ince ayarlı beri nöronal ve gliyal işlevi ile sürekli hücre-hücre çapraz-hadis ve in vivo hareketliliği^4,5, microglia türleri morfoloji farklı hücre işlevler ve işlev bozuklukları göstergeleri olarak hizmet verebilir beyinde. Yeterince tarif bu morfolojik değişiklikler çeşitliliği ve (epilepsi^5,6 gibi ince fizyolojik rezonans meydana ramified hücreleri arasındaki farkları ayırt etmek için nicel bir yaklaşım gereklidir ve beyin sarsıntısı⁷) ek olarak (örneğin, kontur⁸) Brüt yaralanma. Morfoloji miktar^{7,8,9,10,11,12,13,14} kullanımının artmasıyla microglia türleri morfoloji tam çeşitliliği sağlık ve hastalık sırasında ortaya çıkaracaktır. ImageJ eklentileri microglia floresan veya floresan photomicrographs üzerinden microglia morfoloji özetlemek gerekli kademeli kullanımı sabit kemirgen dokusunda immünhistokimya (IHC) sonra elde mevcut çalışma ayrıntıları.

Burada açıklanan analiz teknikleri için 2010 yılında büyük meme yapıları, ölçmek için geliştirilmiş ImageJ eklentileri AnalyzeSkeleton (2D/3D)¹⁵ve ImageJ ve Fraktal analizi için entegre 2014 yılında geliştirilen FracLac¹⁶, Merkez bireysel microglia şekiller ölçmek. Bu eklentileri microglia yaklaşım tüm photomicrographs içinde hızlı bir analiz veya birden çok microglia bir photomicrograph içinde tanımlanmış bir yatırım getirisi sağlar. Bu analiz tek başına veya tamamlayıcı fraktal analizi ile kullanılabilir. Tek hücreli fractal analiz (FracLac) zaman bir yatırım gerektirir ama microglia karmaşıklığı, şekli ve boyutu ile ilgili birden çok morfoloji çıkış sağlar. Her iki araç kullanımı gereksiz değil, hücre yaklaşım hücre karmaşıklığı için tamamlayıcı ve birden çok parametre birleşimini farklı microglia türleri veri kümeleri^12,17içinde morfoloji arasında ayırt etmek için kullanılabilir.

Protokol

Tüm deneyler tarafından onaylanmış ve Arizona Üniversitesi Kurumsal hayvan bakımı ve kullanmak Komitesi ve bakım ve Laboratuvar hayvanlarının kullanımı için NIH kurallar tarafından kurulan yönergelere uygun olarak gerçekleştirilen. Bakım hayvan ağrı ve rahatsızlık en aza indirmek için çekildi. Ötanazi yöntemleri için onaylanmış bir protokol according ve servikal işten çıkarma isoflurane anestezi altında oluşur.

1. doku hazırlık

Not: microglia morfoloji Analizi hücre morfolojisi korumak için sabit, cryoprotected doku örnekleri üzerinde yürütmek. Birini hazırlamak ve doğrudan sabit doku floresans IHC için dilim için standart bir protokoldür.

1. Fare ya da sıçan beyin euthanized bir hayvandan istenen deneme sonra ve bir Standart laboratuvar protokolüne göre kaldırın. 5 mL 24 h 4 ° C'de % 4 paraformaldehyde çözüm de içeren bir 10 mL flakon beyin yerleştirin Sonra durulama ve 5-10 mL % 30 sükroz fosfat yerine çözüm (PBS, 0.01 M) için 72 h 4 ° C'de arabelleğe alınmış Bir microtome ile kesit bütün beyin doku cryostat ile kesit kadar-80 ° C'de veya 4 ° C'de saklayabilirsiniz.
   Not: Bu protokol henüz parafin gömülü dokudan dilimlenmiş doku kullanarak test edilmemiştir.
2. Bölüm beyin dokusu istenen bölüm kalınlığı ve bir cryoprotection çözüm (50 mM PBS, etilen glikol, gliserol) ya bir cryostat ya da microtome ve mağaza serbest yüzer bölümlerinde-20 ° C'de kullanarak Yönlendirme
   Not: Bu protokol başarıyla 50 µm için 200 µm arasında değişen kalınlıkta, koronal doku bölümlerinde yapılmıştır. Doku bölümleri daha az 50 µm microglia süreçler, kalın doku bölümlerde tam yayılımı yakalamak değil daha IHC boyama doku içine antikor penetrasyon nedeniyle kusurlu olabilir. Doku ya kesitli bir koronal veya sagittal yönlendirme olabilir ve bu seçim belirlenmesi için deneysel hedef ve beyin region(s) üzerinde bağlıdır.

2. immünhistokimya

Not: Floresan veya 3, 3 '-diaminobenzidine (DAB) IHC iskelet ve Fraktal analiz yöntemleri uygulanabilir. Aşağıda bir standart floresan IHC protokolüdür ve gerektiği gibi yerine olabilir. Floresans IHC DAB IHC karşılaştırıldığında hücre süreçlerin üstün görselleştirme verir.

1. Doku bölümler 4 mL Cam şişe (ilâ 15 fare beyin bölümleri/flakon) yerleştirin ve 1 mL solüsyon kadar % 10 at serum, PBS (0.01 M), %0,5 Triton, 1 h için (23 ° C) Oda sıcaklığında %0,04 NaN₃ içeren ile kuluçkaya.
2. Üç kez, oda sıcaklığında PBS (0.01 M) ile 5 dakika yıkayın.
3. 1 mL içeren PBS (0.01 M), %0,5 Triton, %0,04 NaN₃ve (NaN₃ etkinliğini korumak için) kaplı çözeltisi içinde 72 h için oda sıcaklığında birincil antikor (Iba1, 1:1, 000) ile kuluçkaya.
4. Üç kez, oda sıcaklığında PBS (0.01 M) ile 5 dakika yıkayın.
5. 4 h 1 mL içeren PBS (0.01 M), %0,5 Triton, %0,04 NaN₃ çözeltisi içinde için oda sıcaklığında kapalı ikincil antikoru (Anti-tavşan 488, 1:250) ile kuluçkaya
6. Üç kez, oda sıcaklığında PBS (0.01 M) ile 5 dakika yıkayın.
7. Beyin dokusu bölümler (sayı ve tercihine göre yönlendirme) subbed slaytlara monte, bir yumuşak-set Montaj araç slayta uygulamak ve coverslip doku yerleştirin. 4 ° C'de slaytları depolama
   Not: 1,5 cam coverslip kalınlığı confocal görüntüleme için gereklidir. Yumuşak-set bir tercih edilen montaj orta yüksek viskozite doku sıkıştırmak değil ve en iyi zaman hard-set montaj medyaya göre morfolojisi korur çünkü.

3. görüntüleme

1. Iba1 pozitif hücrelerinin beyin doku kısmındaki bir 20 X objektif veya daha büyük kullanarak bir z-yığın alma yeteneği vardır alan parlak veya confocal mikroskop kullanarak görüntü.
   Not: düşsel parametreleri ve yazılım kurulumu tüm photomicrograph toplama bir deneyde sabit olması gerekir. Mükemmel süreç detay bir 40 X veya 63 X objektif kullanarak elde edilir. Burada tüm bir photomicrograph veya bir çok hücreli yatırım getirisi daha büyük bir photomicrograph içinde açıklanan iskelet çözümleme protokolü uygulamak mümkündür.
   1. 8-bit görüntüleri elde etmek belgili tanımlık mikroskop bilgisayar yazılımı için özel uygun yazılım ayarları kullanarak.
      Not: Dosyaları dönüştürme 8-bit sonrası satın alma için veri toplama bozabilir.
   2. En az bir 30 µm z-deste belgili tanımlık mikroskop bilgisayar yazılımı için özel uygun yazılım ayarları kullanarak görüntüleri 2 µm aralığını en fazla ile kazanmak.
      Not: Mikroskop ve yazılım bir X, Y ve Z eksenindeki resim alma için izin vermelisiniz. Bir z-yığın artırılabilir ve aralığı ek microglia ayrıntı sağlamak için azalabilir. Buna karşılık, saat görüntüleme artacaktır. Nyquist örnekleme floresan mikroskopi için mümkün olduğunda kullanın.
2. TIF dosyaları olarak ya da belgili tanımlık mikroskop bilgisayar yazılımı tarafından gerekli tüm dosyaları kaydedin.
3. Açık belgili tanımlık TIF eğe içinde ImageJ ve görüntü tıklayarak kanalları ayırmak için araç çubuğunu kullanın | Renk | Split kanallarıve görüntü tıklayarak görüntüleri yığını | Yığınlar | Proje x | Maksimum yoğunluk projeksiyon uygun olduğunda. .Tif dosyaları olarak kaydedin.

4. iskelet Analizi

1. Download FIJI ya da ImageJ gelen < https://imagej.net/Fiji/Downloads>. Bireysel eklentileri AnalyzeSkeleton(2D/3D) üzerinden download < http://imagej.net/AnalyzeSkeleton>¹⁵ ve FracLac üzerinden download < https://imagej.nih.gov/ij/plugins/fraclac/fraclac.html>¹⁶.
   Not: bir photomicrograph ikili bir skeletonized görüntüye dönüştürme tüm süreç az 1 dk sürer.
2. Floresan photomicrograph kullanıyorsanız, görüntü 8 bit olduğundan emin olun ve en iyi tüm olumlu boyama görselleştirmek için gri tonlamaya dönüştürmek. Araç çubuğunu kullanın ve görüntü tıklayın | Arama tabloları | Greys. Kullanarak bir DAB alan parlak fotoğraf, ilk kullanımda FFT bant eklenti filtre ( süreci tıklatarak araç çubuğunu kullanarak | FFT | Bant Filtre) ve daha sonra gri tonlamaya dönüştürme.
   Not: Bu protokol, ImageJ varsayılan ayarları bir FFT bant filtre için yeterli (filtre) 40, hiçbir şerit bastırma 3 piksele kadar amaçlıdır. Bir FFT bant filtre uygulayarak görüntünün genel olarak daha büyük yönlerini koruyarak gürültü (küçük Özellikler) kaldırır. Bu özellikle parlak alan görüntülerde kullanışlıdır nerede böler ve çatlaklar doku arka plan olarak görünür ve böylece iskelet analiz¹⁸zorlaştırıyor.
3. Parlaklığı ayarlayın ve görüntü çok karanlık ise kontrast ve microglia işlem görüntülenir. Araç çubuğunu kullanın ve görüntü tıklayın | Ayarlamak | Parlaklık/kontrast. Minimum veya maksimum kaydırıcıları, histogram ama hayır daha fazla kenarlarına kadar gerektiği gibi ayarlayın.
   Not: ImageJ, parlaklık ve kontrast piksel değerlerini değiştirilmemiştir böylece resmin arama tablosu (LUT), güncelleştirme tarafından değiştirilir. Max ve min kaydırıcıları görüntü aralığı piksel değerleri 255 beyaz görünen yukarıda ve aşağıda görünen siyah¹⁸0 piksel değerleri ile alt ve üst sınırları kontrol. En az kaydırıcıyı microglia lekeli DAB photomicrographs için kullanılacak ise floresan photomicrographs durumunda, maksimum kaydırıcıyı, kullanılmalıdır.
4. Daha da işlemi tıklatarak araç çubuğunu kullanarak karşıtlığı artırmak için Keskinliği Azaltma Maskesi filtresi çalıştırmak | Filtreler | Keskinliği Azaltma Maskesi. Bu iletişim kuralı, ImageJ'ın varsayılan ayarları amacıyla (3 piksel yarıçapı ve maske 0,6 ağırlığını) kullanılır.
   Not: Keskinliği Azaltma Maskesi keskinleştirir ve orijinal görüntüden (Keskinliği Azaltma Maskesi) bulanık bir sürümünü çıkarılarak ve sonuçta elde edilen görüntü orijinal görüntünün yüksek karşıtlık sürümü birleştirme tarafından görüntünün kenar özelliklerini geliştirir. Bu nedenle, Keskinliği Azaltma Maskesi filtresi ayrıntılarını oluşturmaz ancak yerine bir resimde varolan ayrıntı açıklar. (Ve böylece ne kadar bulanıklık kaldırılacak) ayarlarında değişiklikler nasıl bulanık Keskinliği Azaltma Maskesi RADIUS olacağını ve maske ağırlık ayarlama değişiklikleri Keskinliği Azaltma Maskesi ile birleştirilmiş karşıtlık derecesini (ve böylece son resmin zıtlığını ayarlar).
5. Keskinliği Azaltma Maskesi tarafından oluşturulan salt-and-pepper gürültü çıkarmak için bir despeckle adımı gerçekleştirin. Araç çubuğunu kullanın ve işlemi tıklatın | Gürültü | Gürültüyü Temizleme.
   Not: Lekeleri temizlemek her piksel, 3 × 3 mahallede medyan değeri değiştirerek salt-and-pepper gürültü kaldırır. Kenarları¹⁸netliği etkilemeden outliers yoğunluğu içinde medyan piksel tarafından değiştirilir etkisidir.
6. Görüntü tıklayarak araç çubuğunu kullanarak ikili görüntü dönüştürmek | Ayarlamak | Eşik.
   Not: Eşik özellikleri arka plan karşı ilgi içine gri tonlamalı görüntüler stratifies ve görüntü ikili¹⁸dönüştürür.
7. Despeckle, yakın-, uygulamak ve aykırı işlevler kaldırmak: kadar elde edilen ikili görüntüde tek piksel arka plan gürültü ve süreçler arasındaki boşluklar olabilir.
   1. İşlemi tıklatarak araç çubuğunu kullanarak despeckle işlevi uygular | Gürültü | Gürültüyü Temizleme.
      Not: Uygulama lekeleri temizlemek için ikili resim siler kalan tek piksellik gürültü yapmayın.
   2. İşlemi tıklatarak araç çubuğunu kullanarak yakın işlevi uygular | İkili | Yakın.
      Not: Bu eklenti ilâ 2 piksel ayrılırlarsa iki karanlık piksel bağlanır.
   3. İşlemi tıklatarak araç çubuğunu kullanarak kaldır outliers işlevi uygular | Gürültü | Outliers kaldırmak.
      Not: Bu protokol amacıyla, 2 piksel yarıçapı ve bir eşik 50 ile parlak outliers hedeflenir. Bu eklenti tarafından belirli bir değeri (eşik)¹⁸değerinden fazla sapma çevresindeki medyan piksel bir parlak ya da ölü aykırı piksel yerini alır.
8. Gelecekteki kullanımı ve/veya fractal analiz için ayrı bir dosya olarak kaydetmek ve işlemi tıklatarak araç çubuğunu kullanarak görüntü skeletonize | İkili | Skeletonize.
9. Skeletonized görüntüyü seçin ve çalışma plugin eklentileri tıklatarak araç çubuğunu kullanarak AnalyzeSkeleton(2D/3D) | İskelet | İskelet analizve şube bilgileri kutusunun işaretlenmesi.
   Not: Görüntü işleme en iyi duruma getirme ile ekleme ya da silme yukarıda önerilen adımlardan gerektirecektir olasıdır. Bu süreçte skeletonized görüntüleri bir bindirme iskelet ve orijinal görüntü oluşturarak doğruluk için değerlendirilir. Somas merkezden yayılan işlemleri ile tek kökenli puan olmalıdır; dairesel somas verileri yıkmak ve protokol ayarı kaçınılmalıdır. Tek bir noktadan dairesel somas karşı örneği Şekil 1' de gösterilmiştir.

Temsilcisi olmayan iskeletler kaynaklanan ve çözümler önerdi ortak sorunları:

• Görüntü çok karanlık: gri tonlama için dönüştürmek, Parlaklık/kontrast kaydırıcıları ayarlayın ve/veya Keskinliği Azaltma Maskesi uygulama
• Çok fazla arka plan: Parlaklık/kontrast kaydırıcıları ayarlayın, Despeckle uygulamak ve/veya kaldırmak aykırı
• (Özellikle floresans görüntüler için) skeletonized görüntüdeki dairesel somas: FFT bant filtre ve/veya Keskinliği Azaltma Maskesi uygulamak
• Çatlaklar (özellikle alan parlak görüntüler için) bir doku: FFT bant filtre uygulamak ve/veya gürültüyü Temizleme

10. Tüm verileri sonuçlarından kopyalayın ve şube bilgi veriyor ve verileri bir Excel elektronik tabloya yapıştırabilirsiniz.
11. Excel'de, IHC ve görüntü alma neden iskelet parçaları kaldırmak için veri kırpın.
    1. İskelet analiz ham veri çıktısı deney kitabıyla çoğaltmak ve dosya adına TRIM ekleyin. Tüm sonraki veri düzeltme gelecekteki kullanım ve referans için ham verileri korumak için çoğaltılmış çalışma kitabındaki gerçekleşmelidir.
    2. Hangi parçaları uzunluğu ImageJ içinde skeletonized görüntüyü açıp, çizgi aracını seçerek veri kümesinden kırpılacağı belirlemek. Çeşitli parçaları ortalama uzunluk, not alma, ölçmek ve kesme biçimi değerini üzerinde karar verin.
       Not: burada sunulan veri, istenmeyen parçaları için kesme uzunluğu 0.5 amaçlıdır. Bu değer bir veri kümesi tutarlı olmalıdır.
    3. Özel sıralama Excel elektronik tablo tıklayarak Sırala ve Filtre Uygula tarafından | Özel sıralama. "Son nokta voxels" büyükten küçüğe ve yeni bir düzeye, tarafından "Mx şube pt" Büyükten Küçüğe Sırala.
    4. Kesme biçimi değerini daha az en büyük şube uzunluğunda 2 bitiş noktaları içeren her satır kaldırmak (i.e., 0.5). Para bitiş noktaları toplam sayısını hesaplamak için bitiş noktası sütundaki verileri görüntüden toplamış.
    5. Şube bilgileri veri için tekrar ediyorum: 'şube boyla' en küçük gelen büyüğe sıralamak. Kaydırma üzerinden veri ve bir dal kesme biçimi değerini daha az uzunlukta her satırını kaldırmak(i.e., 0.5). Tüm dalları görüntüden toplanan toplam uzunluğunu hesaplamak için şube uzunluk sütunundaki değerlerin toplamı.
    6. Tüm veriler kesilmiş ve özetlenebilir kadar adımları 4.11.3-4.11.5 her görüntü/sayfası için yineleyin.
    7. (Uç noktalarının sayısını toplanır ve branş uzunluğu toplamı) her görüntü verilerinden microglia somas karşılık gelen görüntü sayısı bölün. Son verileri (bitiş noktaları/hücre & dal uzunluğu/hücre) istatistiksel yazılım girin.
       Not: Toplam şube uzunluğu/hücre veri uzunluğu, pixel dönüştürme mikron gerektirebilir.

5. fractal analiz

Not: FracLac bir dizi değil kaplıdır farklı şekil analizleri bu protokol için çalıştırmak yapabiliyor. FracLac daha ayrıntılı bir açıklama çeşitli işlevler için FracLac el kitabı, bkz: < https://imagej.nih.gov/ij/plugins/fraclac/FLHelp/Introduction.htm> ve ilişkili başvurular ^2,16,19. Fraktal Çözümleme Protokolü 4.1-4.7 yukarıda açıklanan adımları kullanır.

1. Tüm fractal analiz için kullanılan YG boyutunu belirler. ROI çizmek için Dikdörtgen aracını kullanın. Kutuyu hücrenin tamamını yakalamak için yeterli büyüklükte ve veri kümesi tutarlı kalır emin olun.
   Not: dikdörtgen seçimi yerine serbest seçim tüm ROIs aynı boy dikdörtgen, ve bu nedenle, hücreleri aynı ölçeğe sahip sağlamak için kullanın. Serbest seçim ImageJ çünkü otomatik ölçek farklı boy dikdörtgen windows farklı ölçeklerde hücrelerle sonuçlanan sığacak şekilde kare bir yatırım getirisi kullandıysanız bu durumda olmazdı. Fraktal şekiller ölçekli bağımsız olmakla birlikte, FracLac ImageJ için kullanarak fractal analiz süreci ölçek¹⁶tarihinde bağlıdır. Böylece, veri toplama boyunca sürekli olarak ölçekli bir yatırım getirisi için gerek yoktur.
2. Rastgele microglia fractal analiz için her photomicrograph ve karşılık gelen ikili resim seçin. ROI Yöneticisi penceresinde ROI hücrenin konumunu kilitlemek için güncelleştirme seçin. CTRL + üst karakter + D alanı içinde yeni bir pencere olarak yatırım getirisi çoğaltmak için kullanın ve kırpılmış hücre kaydedin. (İskelet analizinden) karşılık gelen ikili görüntü üzerinde alan ROI Yöneticisi'ni kullanarak aynı hücre ile yinelenen. Hücreleri yeterli sayıda fractal analiz için rasgele seçilmiş ve tüm dosyalarını kaydetmek kadar yineleyin.
   Not: Bir rasgele sayı üreteci ve numaralandırılmış Kılavuzu rastgele hücreleri seçmek için kullanılabilir.
3. İkili resim ile bireysel hücreyi aç. Boya Fırçası aracını çift tıklatın, siyah rengi ayarlamak ve fırça genişliği gerektiği gibi ayarlayın. Eşleşen photomicrograph referans olarak kullanarak, bitişik hücre süreçleri kaldırmak, parçalanmış işlemleri bağlamak ve hücre ilgi yalıtmak için boya fırçası kullanın. İkili hücre izole edildikten sonra ikili dosyayı kaydedin.
   Not: 'alt' basılı (siyah) ön plan renginden boya fırçası arka plan rengine (beyaz) geçiş yapar.
4. Anahat araç yolu ile işlemi kullanarak ikili hücre dönüştürmek | İkili | Anahat.
   Not: FracLac görüntü j-ebilmek var olmak kullanılmış her iki katı şekillerdeki veya şekil özetliyor, ancak, Şu anki şekli kullanmak için¹⁶özetliyor kuralıdır.
5. Araç çubuğunda, eklentileri tıklatarak araç çubuğunu kullanarak FracLac açın | Fractal analiz | FracLac ve BC (sayma kutusu)seçin. Kılavuz tasarım ayarlarında, Num G 4 olarak ayarlayın. Grafik seçenekleri'nin altında analiz dışbükey hull ve hücre sınırlayıcı daire için ölçümleri kutuyu işaretleyin. Bittiğinde, Tamam' ı seçin.
   Not: Num G sayısı kutusuna tarama sırasında kullanılan ızgara yönelimleri sayma ve Num G için önerilen Aralık 4-12. Num G ayarı ve önerilen Aralık iyice FracLac el ile¹⁶' kevgirden geçirilir. NUM G artan hesaplama kez önemli ölçüde yavaşlatabilir. FracLac ayarlarını yalnızca bir kez oturum başına ayarlamak gerekir. Ayarları girdikten sonra tarama düğmesi kullanılabilir hale gelir.
6. Seçili resmin üzerine kutusunu sayma tarama çalıştırmayı tarama düğmesini seçin.
   Not: Tarama veri çıkışları olan üç windows oluşturur: gövde ve daire sonuçları, kutu sayısı Özeti dosya ve tarama türleri. Tarama türleri penceresinde kullanılan ayarları günlüğünü içerir, yanı sıra standart sapmalar kesin ölçer. Bu iletişim kuralının amacı gereği, tarama türleri penceresindeki kullanılmaz ve kapalı veya olabilir için gelecek bahsetme kurtarmak.
7. Gövde ve Daire sonuçları penceresindeki istenen tüm veri kopyalamak (i.e., yoğunluk, yayılma oranı ve döngü) sonuçları. Kutu sayısı Özeti penceresindeki istenen verileri kopyalamak (i.e., Fraktal boyut ve lacunarity) sonuçları. Kopyalanan verileri bir Excel dosyası veya istatistiksel yazılım aktarın.
   Not: FracLac tam bir listesi çıktı veri sağlanan ve iyice FracLac ImageJ el ile¹⁶için açıklanmıştır.

Sonuçlar

Burada açıklanan microglia morfoloji Analizi iletişim kuralları işleme floresan ve DAB photomicrographs xarakteristikaları analiz için yararlı adımları özetler. Aşağıdaki adımları görsel Şekil 2 ' de özetlenmiştir ve Şekil 3. Öyle ki birikmiş veri geçerli uygun şekilde orijinal photomicrograph modelleri bir temsilcisi ikili ve skeletonized görüntüsünü oluşturmada adımları hedefidir. İletişim kuralı uygulamadan sonra AnalyzeSkeleton eklenti sonuçları hangi etiketli bir iskelet görüntü bitiş noktaları ve şube sayısı (i.e., süreç) lengthcan elde edilen çıktı dosyalarından özetlenen. Bitiş noktaları ve işlem uzunluğu veri daha sonra microglia yaklaşım photomicrograph veya ROI ölçüde tahmin etmek için kullanılır. Şekil 4 ve iletişim kuralı uygulama olmadan toplanan elde edilen veriler (bitiş noktaları/hücre ve işlemi uzunluk/hücre) özetler. Benzer eğilimler var, rakam 4F içinde özetlenen veri daha az değişken daha fazla Şekil 4Eolan vardır. Buna ek olarak, bu veri iletişim kuralı uygulandığında gruplar arasındaki farklılıkları algılamak için artan duyarlılık göstermek. Son olarak, Uygulama Protokolü'nün arası Kullanıcı değişkenliği ile ilgili özen göstermelidir. Bu tür farklılıklar nerede aynı veri kümesi olarak yukarıda özetlenen özdeş bir protokol başvurusu iki bağımsız kullanıcılar tarafından analiz edildi Şekil 5 tarafından özetlenir.

Ek morfoloji veri iletişim kuralı uygulama sırasında oluşturulan ikili görüntülerden izole tek hücrelerden toplanır. Önce microglia Morfoloji ve FracLac eklenti Şekil 6' özetlenir kullanarak çözümlemek için protokol adımları. Biz her iki yaralı (Şekil 6A) bu analizde göstermek ve (Şekil 6B) doku yaralandı. İkili, anahatlı, dışbükey hull/daire ve kutusu sayım örnekleri iletişim kuralı uygulama Şekil 6C-F. içinde gösterilir ve her hücre ile analiz için Kapsüllenen temsilcisi görüntüleri Şekil 6Giçinde özetlenmiştir morfoloji veri farklılıkları kökenleri göstermek için bu görüntüler Yardım.

Şekil 1. Skeletonized microglia karşı (en iyi) bir tek kökenli soma ve karşılık gelen bindirme skeletonized hücre ile orijinal photomicrograph arasındaki bir dairesel soma (suboptimal) ile illüstrasyonlar. Ölçek çubuğu 10 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 2. Protokol uygulamaya floresan photomicrographs. Ayrıntıları göstermek için illüstrasyonlar floresan photomicrograph tek bir hücre ile uygulanan iskelet Çözümleme Protokolü'nün kırpılmış. Ölçek çubuğu 10 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 3. İletişim kuralı uygulamaya alan parlak DAB photomicrographs. Tek bir hücre ayrıntıları göstermek için kırpılmış alan parlak DAB photomicrograph uygulanan iskelet Çözümleme Protokolü'nün illüstrasyonlar. Ölçek çubuğu 10 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 4. Veri analizi ve iletişim kuralı uygulama olmadan. (A) Floresan IHC ve kırpılmış hücre (B) sarı kutusuna karşılık gelen bir örnek photomicrograph. Örnek ikili ve skeletonized görüntüleri ile (C) ve (D) açıklandığı gibi uygulanan protokol olmadan. Microglia bitiş noktaları/hücre ve işlemi uzunluk/hücrenin özet verileri (beyaz) yaralanmamış ve (gri) (E) ile kortikal doku yaralandı ve protokol (F) uygulanır. İstatistiksel analiz kullanarak bir öğrenci t-testi ve n = 3, ** p < 0,01 gösterir. Ölçek çubuğu 10 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 5. İletişim kuralı uygulama ile Kullanıcı farklılıkları. Kullanıcı 1 ve Kullanıcı 2 ikili ve iskelet görüntüleri orijinal bir görüntü ve protokol dönüştürme örneği. Renkli daireler eşleme ile iki resim arasındaki farklar vurgulanmıştır. Kullanıcı 1 ve Kullanıcı 2 yaralı ve yaralı beyin bölgelerinde microglia bitiş noktaları/hücre ve işlemi uzunluk/hücre veri Özet grafikleri. İstatistiksel analizi ANOVA ve örnek boyutudur n = 3; p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Ölçek çubuğu 10 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 6. Fractal analiz ve iletişim kuralı uygulama olmadan. Microglia zarar görmemiş (A) ve karşılık gelen ikili (C) ve ile ve uygulanan protokol olmadan neden anahat (D) görüntüleri ile yaralı (B) korteks kırpılmış photomicrographs örneği. İlişkili dışbükey hull (mavi) ve karşılık gelen anahat şekilleri (E) için (pembe) Daire içine alarak şekil yoğunluğu hesaplamak, oranı ve döngü (G) için kullanılır. Sayım yöntemi kutusu (F) resimli ve Fraktal boyut (D_B) ve (G) lacunarity (λ) hesaplamalar için kullanılır. Ölçek çubuğu 10 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Tartışma

Microglia hücreleri ince fizyolojisi ve patoloji mikro-etki alanları içinde ayarlanan ve türleri morfoloji² çeşitli bir yelpazede ince^7,14 ve brüt yaralanma⁸. ImageJ iletişim kurallarının kullanımını microglia morfoloji miktar platformu olarak tüm laboratuvarlar için erişilebilir yapar ve eklentileri bir açık kaynak görüntü işleme yazılımı vardır. Açıklanan protokol görüntü işleme ve analiz bu yazılımı kullanarak üzerinde odaklanmış iken, veri toplama, geçerlilik ve güvenilirlik tutarlılığını mükemmel IHC ve mikroskobu ile başlar. Bu iletişim kuralı ikili, iskelet ve tüm photomicrographs ve tek hücre anahat gösterimleri geliştirmek için kullanılır ama zavallı IHC boyama yer alamaz ve düşük kontrast içinde sonuç mikroskobu bulanık veya görüntü bozuk. Bir ek dikkate, değiştirilemez bir şekilde portaldan microglia morfoloji değiştiren beyin dokusu Muhafazası kesit, öncesinde sırasında değil düzleştirmek için özen göstermelidir. Son olarak, her deneme içinde aynı ölçek gibi aynı mikroskop kullanarak microglia yansıması gerekir. Araçları, amaçları ve yazılım benzer hedefleri rağmen farklı büyüklükteki photomicrographs neden ve detay yanı sıra her çerçeve içinde hücre sayısını değiştirmek mikroskoplar arasında değişir. Örneğin, iki kez sayı hücre ve edinimi Zeiss 880 kullanma daha ayrıntı daha az 40 X objektif bir Leica SPII kullanarak resim alma sonuçlanır. Bu veri örnekleme bir sorun olduğunda bu özellikle tek bir hücre yerine tüm çerçeve toplanan hücre yaklaşım veri için önemlidir.

Genel olarak, hangi tüm photomicrograph iskelet analiz tek hücre fractal analiz iki nedenden dolayı önce gelir. Belirleyici hücre yaklaşım bir photomicrograph tüm hücreleri tek hücre fractal analiz için karşılaştırıldığında ve saat bir faktör ise bir tarama aracı olarak düşünülebilir hızlı. Buna ek olarak, iskelet çözümleme sırasında elde edilen ikili görüntüleri fractal analiz için kullanılır. Yansıma sonra iskelet Çözümleme sonuçlarını etkilemek ve Kullanıcı-etkisi tanıtmak kritik adımlar vardır. Kullanıcılar arasında en değişken Protokolü adımlar adım 4.2 (artan görüntü parlaklığını) ve 4.5 (eşik belirleme) adım. Mümkün olduğu durumlarda, (max veya min kaydırıcısını 0-255 arasında) artırmak için en uygun bir numarası belirler ve tüm görüntüler ve kullanıcılar için sabit tutulan. Görüntü değişkenlik büyük olduğunda, Kullanıcı yerine görüntüler arasında değişir bir parlaklık seçebilirsiniz. Alternatif olarak, görüntüleri parlak ve kontrast yüksek ise, parlaklık artan atlanabilir ve eşik standardize özel eşik filtre kullanarak (Örn., Huang) daha değişken varsayılan yerine. Bir kez en iyi duruma getirilmiş, parametreler için ek Kullanıcı-etkisi en aza indirmek için yapıştırılır.

Bir örnek Kullanıcı değişkenlik Şekil 5' te gösterilmiştir. Veri değerleri Kullanıcı 1 Kullanıcı 2 karşı artmış ve eğer Kullanıcı 1 ve Kullanıcı 2 veri toplama için katkıda bu nedenle değişkenlik yükseltilmiştir. Kullanıcı 1 ve Kullanıcı 2 ikili ve skeletonized görüntüleri farklılıkları örneği olan vurgulanır renkli daireler (Şekil 5). Bu durumda, hem kullanıcılar hem de microglia sınırlı uzmanlık ile kısaca eğitimli lisans öğrencileri vardı. Normal gözetim ve bir microglia ile birlikte artan Protokolü eğitim² uzman tarafından danışmanlık arası Kullanıcı değişkenliği azaltır. İkili hücreleri el ile ve tek tek izole microglia şekiller belirlemek için yalnızca eşik güvenmek yerine bir photomicrograph olduğundan burada değerlendirildi değil, fractal analiz arası Kullanıcı değişkenlik tabi daha az olsa da. Ancak, tüm yöntemler bazı değişkenlik kullanıcılar arasında bulunur. Bu nedenle, tek bir Kullanıcı (ideal olarak, microglia hücrelerde bazı uzmanlık eğitim) tüm veri kümesinin veri toplama tamamlamak.

Ek değişiklikler bu iletişim kuralı için kolayca yapılabilir ve görüntü kalitesi ve gürültüyü azaltmak ve işlem bağlantısını sağlamak için harcanan çabaları bağlı olacaktır. Örneğin, kontrast yeterli ise, o zaman Keskinliği Azaltma Maskesi gerekli değildir ve atlanabilir. En iyi duruma getirme ve görüntüler, deneysel çalışmaları ve bütün bir set veri toplama önce denetimleri, belirli bir kümesi için protokol sonlandırmak akıllıca olur. Son olarak, ek eklentileri diğerleri yerine açıklamak veya bu protokol için açıklanmayan görüntüleri netleştirmek için kullanılabilir dilate veya keskinleştirme gibi.

Bu iletişim kuralı avantajları onun evrensel kullanılabilirlik ve uyum vardır. Buna ek olarak, AnalyzeSkeleton kullanarak hücre yaklaşım değerlendirirken hızlı ve tüm photomicrograph için geçerli. Çok hücreli analiz yaklaşımı tek hücre yerine bir bütün bölge odaklanmak şeydir. Bu nedenle, hızlı bir şekilde, resmin içinde tüm microglia (bitiş noktaları ve işlem uzunluğu) açısından yaklaşım ortalama değerlendirmek mümkündür. İskelet çözümlemesi sağlayan birden çok hücre Analizi: veri örnekleme tarafından fractal analiz tek photomicrographs hücrelerden yalıtmak için gerekli zaman yatırım nedeniyle eşleştirilemeyen hücre sayıları açısından. Nerede bu en uygun olabilir bir örnek microglia türleri proximities fokal bir sakatlık içinde morfoloji eleme olurdu. IHC photomicrographs iskelet modeller oluşturmak için tüm alan görüntü işleme için daha zaman alıcı tek hücre yaklaşım karşılaştırıldığında kusurlu bir kısıtlamadır. Buna ek olarak, bir bölge analiz nerede microglia türleri morfoloji aynı alanda bulunan büyük ölçüde farklı koşullara uygun değil. Son olarak, bu analiz yöntemi hücre sayısı, deneysel koşullar arasında farklı olabilir bir parametre bağlıdır.

Fractal analiz tek bir hücre üzerinde yapılır ve bu nedenle iskelet çözümlemesinden ortalama hücre yaklaşım veri çıkışı tamamlar. Her ne kadar çok daha zaman alıcı, bu yatırım çok çeşitli xarakteristikaları veri verir. Örneğin, yoğunluk, yayılma oranı, hücre ve döngü veri boyutu, uzama ve hücre anahattının şeklini sırasıyla açıklanmaktadır. Fraktal boyut ve lacunarity hücre karmaşıklığı ve şekil heterojenite, anılan sıraya göre özetler. Her parametre nasıl hesaplanır ve nasıl veri yorumlanır daha ayrıntılı bir özetini içinde etkileşimli el ile¹⁶ sağlanır ve bu ayrıntı özel araştırma soru ile ilgili olarak düşünülmelidir. Hassas araçları fizyolojik ve patolojik koşullarda oluşabilir 2D microglia türleri morfoloji küçük değişiklikleri ölçmek için açıklanan protokol sonuçlarında. Sağlamlık, gönderilir ve form faktörü^16,20 gibi ek xarakteristikaları analiz 3D şekiller oluşturmak mümkün olabilir.

İletişim kuralı geliştirme ve uyum sürekli ve Kullanıcı tarafından. Bu floresan⁸ ' den DAB/parlak-alan resim⁷ ama henüz katıştırılmış doku alkol için kapsayacak biçimde genişletilmiştir. Buna ek olarak, bu ek analiz için Imaris gibi özel mülk yazılım ile birlikte kullanılabilir. Bu iletişim kuralı Fizyoloji çeşitli için uygulanabilir ve microglia için sınırlı değildir ancak herhangi bir hücre veya doku belirli desen veya IHC yöntemlerle tespit şekilleri ile uygulanabilir. Son olarak, yeterli örnek boyutu ile birden fazla varyasyon veya küme analizi microglia göre morfolojisi^12,21tabakalaşmak uygulanabilir; microglia morfoloji microglia işlevleri ve yanıt çevreleri için çok önemli bir göstergesi olarak bu anlamlı bilgi yok. Mikroglial morfolojik çeşitlilik için takdir genişleyen ve tam olarak sağlık ve hastalık sırasında nöron-glia-vasküler etkileşimleri anlamak önemlidir. Bu alanda büyüme ölçmek ve microglia morfoloji birden çok sürekli değişken kullanarak özetlemek için iyi gelişmiş, kullanımı kolay ve tekrarlanabilir protokolleri tarafından geliştirilmiştir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
primer antikor anti-IBA1	Wako	019-19741	tavşan konakçı
Vectashield yumuşak montaj	Vektör Labs	H-1000
İkincil antikor	Jackson ImmunorResearch	711-545-152	eşek ev sahibi
4 mL cam şişe	Wheaton	UX-08923-11
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151
Sodyum Azide (NaN3)	Sigma	S-8032
cam lamel	Fisher Scientific	12-544-G