Yöntem makalesi

Termal Nanoimprinting teknik ve insan endotel hücreleri koloni oluşturan yanıt testi ile taranması degrade Nanopattern imalatı

7.4K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/57661

⸱

1 Temmuz 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Biomedical Engineering, Korea University, 2Department of Cardiology, Korea University Anam Hospital

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Burada, degrade nanopattern plakaları termal nanoimprinting ile imalat ve insan endotelyal progenitor hücreler yanıt taşınımı için eleme yöntemi için bir iletişim kuralı mevcut. Açıklanan teknolojisini kullanan, hücre davranış fiziksel uyaranlara tarafından işleyebilirsiniz bir iskele üretmek mümkündür.

Özet

Nanotopography çeşitli hücre dışı matrisler (ECMs) vücut etrafında bulunabilir ve hücresel reaksiyonlar üzerine önemli yasal eylemleri sahip olduğu bilinmektedir. Ancak, bir nanostructure boyutunu ve hücre uygun tarama araçları eksikliği nedeniyle yanıt arasındaki ilişkiyi belirlemek zordur. İşte, tekrarlanabilir ve düşük maliyetli degrade nanopattern plakaları hücresel yanıt manipülasyon gelişimini göstermektedir. Ana kalıp, degrade nanopattern pilakalar ve artan çap aralığı [120-200 nm (GP 120/200), 200-280 nm (GP 200/280) ve 280-360 nm (GP 280/360)] nanopillars olarak anodik alüminyum oksit (AAO) kullanarak basma tekniği bir termal tarafından fabrikasyon. Bu degrade nanopattern plakaları nanotopography ECM içinde çeşitli boyutlarda taklit etmek için tasarlanmıştır ve insan endotel koloni oluşturan hücre (hECFCs) yanıt-e doğru elemek için kullanılmıştır. Bu protokol için mühendislik, hECFCs insan periferik kandan yetiştirilmesi ve hECFCs nanopattern plakaları kültür teknikleri hücre için degrade nanopattern tabak imalatı, adım adım bir yordam açıklanmaktadır.

Giriş

Yanıt hücre yüzey topografyası fiziksel uyarılması tarafından son zamanlarda, hücre mühendislik1,2,3,4alanında kataloglarımızda. Bu nedenle, daha fazla dikkat hücre ek yüzey5üç boyutlu nanoyapıların üzerinde duruldu. Bu hücre yüzey tanıma oyunlarından biri, integrin ECM mikro-nano yapılar ile mekanik iletim6tarafından tahrik fiziksel uyarıcı iletir bildirilmiştir. Bu mekanik stimülasyon hücre davranış ile ilgili rehberlik7 düzenleyen ve odak yapışıklıklar ve sertlik hücre8' in yanı sıra şeklini değiştirmek için hücre iskeleti yeniden yapılanma neden olmaktadır.

İnsan endotelyal progenitor hücreler (hEPCs) vücuttaki yakından çevreleyen ECM9microenvironment ile etkileşim. Bu kesme stres kan akışı10' dan türetilmiş kadar ECM fiziksel durumunu belirli hücre-matris yapışması karmaşık oluşumu için önemli bir parametre olarak davranır gösterir. Bu yüzey nanotopography geniş kılcal tüp ağlar hEPCs11 ' in vitro oluşumunu artırır ve ECM/biyo çözünür faktör sistem kombine hEPCs işlevsel olmayan yüzeylerde tanımasını sağlar ve destekler bildirilmektedir şifa12,13yara. Yine de, ECM ve hEPCs arasındaki ilişkiyi açıkça anlaşılmış değildir.

Hücre yanıtları ve fiziksel ipuçları farklı yüzeylerde14,15,16arasındaki ilişkiyi açıklamak için pek çok araştırmacı çalıştı rağmen bu çalışmalar bir nanostructure yalnızca sabit boyutu kullanılan veya nanopatterns nanostructure ve hücre davranışını boyutu arasındaki ilişkiyi aydınlatmak için bir sınırlama var düzensiz düzenlemeler ile. Buradaki sorun nanostructure en uygun boyutu bulmak için varolan sıkıcı ve yinelemeli yaklaşımlar yerine hücresel yanıt süzmek için uygun araçlar eksikliğidir. Bu nedenle, basit bir teknik tekrarlama olmadan fiziksel elektrodlar hücre reaksiyonlar eleme için gereklidir.

Burada, bizim önceki raporlar17,18,19 içinde hangi görücü usulü nanopillars çapını yavaş yavaş artar bir degrade nanopattern üretmek için kullanılan bir yöntem açıklanmaktadır. Buna ek olarak, ayrıca nasıl yetiştirmek ve hECFCs fiziksel bir çekim gücü etkisi hücreleri belirlemek için degrade nanopattern plakaları davranışını analiz nitelendirdi. Hafif anodization, yavaş yavaş gravür ve anti-yapışma katman kaplama yöntemi degrade AAO kalıp imal etmek kullanılmıştır. Litografi tekniği basma bir termal benimseyerek, aynı polistren degrade nanopatterns bir maliyet-etkin ve facile şekilde üretilmiştir. Degrade nanopatterns kullanarak, hangi boyutunu nanostructure deney bir dizi hücre davranışı üzerinde büyük bir etkiye sahip belirlemek için mümkün olabilir. Biz bu gradyan nanopattern kan kaynaklı hECFC veya diğer hücreler ve taşınımı çeşitli boyutlarda arasındaki etkileşim mekanizmaları anlamada yardımcı olacaktır bekliyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu çalışmada Kore Üniversitesi Anam Hastanesi (IRB No Kurumsal değerlendirme Komitesi tarafından kabul edildi ED170495). Tüm yordamları Helsinki Bildirisi'ne ve onun daha sonraki değişiklikler uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

1. Elektro-parlatma tarafından alüminyum (Al) yüzey hazırlanması

Uyarı: Elektro-parlatma aşındırıcı ve zehirli bir çözümdür. Nitril eldiven, gözlük ve laboratuvar önlüğü de dahil olmak üzere kişisel koruyucu ekipman giymek. Bir duman mahallede bu adımı gerçekleştirin.

  1. Elektro-parlatma çözüm etil alkol (C2H5OH, % 99.9) karıştırılarak hazırlamak ve perklorik asit (HClO4, %60) bir 1 L çift ceket ölçek (C2H5OH:HClO4 = 4:1).
  2. Çift ceket kabı bir sirkülatörün bağlanmak ve 7 ° C'de sıcaklığı ayarlamak Çift ceket kabı bir manyetik karıştırıcı koymak. Sıcaklık 7 ° C'ye düşünceye kadar karıştırma için en az 30 dakika altında çözüm bırakın
  3. Ultrasaf Al plaka bırakın (% 99.999, 20 × 50 × 1 mm3) ve karbon sayacı elektrot timsah klipleri ve bakır tel kullanarak elektro-parlatma çözüm içine. Al plaka ve birbirine yüz için karbon sayacı elektrot konumunu ayarlamak.
    Not: Dikkatli bir şekilde küçük resimleri yüklemek için gerekli olan çözüm dokunmak. Ne zaman belgili tanımlık eriyik, temas yabancı maddelerin dışarı kırpmak--dan akan Al plaka kontamine.
  4. Pozitif terminal ve karbon sayacı elektrot eksi terminali için Al plaka bağlanmak, bir doğru akım (DC) güç kaynağı.
  5. Manyetik karıştırıcı açmak ve bir gerilim koru bu devlet için 4 dk V. 20 uygulayın.
  6. Manyetik karıştırıcı açmak ve başka bir 6 min için akış için geçerli izin.
    Not: Statik koşulu kirleri ve pürüzlülük çoğunu Al plaka kaldırır ve dinamik koşulu elektro-parlatma final kalitesini artırır.
  7. Güç kaynağını ve el ile Al plaka kırpmak--dan ayrı. Titizlikle Al plaka tüm kalan çözümü kaldırmak için deiyonize su ile yıkayın.
  8. Azot ve depo inert gaz altında Al plakalı kuru. Adım 1 ve 2 tüm deneylerin sonunda bu kurutma işlemi gerçekleştirin.
    Not: Basınçlı hava enjekte, diğer tarafa cilalı bölümünden hava akışı olun. Tersi durumda, yabancı maddelerin sigara cilalı bölümünden kaçış ve Al plaka kontamine.

2. ile fosforik asit elektrolit degrade AAO kalıp imalatı

Uyarı: Metil alkol ve onun duman oküler toksik vardır. Krom sürekli maruz ciddi krom zehirlenmesi için yol açabilir. Bir duman mahallede bu adımı gerçekleştirin.

  1. Birincil anodization
    1. Fosforik asit elektrolit 1 L hazırlamak için bir cam şişe içine 590 mL deiyonize su yükleyin.
    2. Metil alkol (CH3OH, % 99) 400 mL ekleyin ve 10 mL Cam şişe içine fosforik asit (H3PO4, % 85). Çözüm de sallayarak el ile veya manyetik karıştırma ile karıştırın.
    3. Elektrolit 500 mL 1 L çift ceket kabı dökün. Cilalı Al plaka ve karbon sayacı elektrot timsah klipleri ve bakır tel ile çözüm içine bırakın.
    4. Elektro-parlatma 2-3 mm yukarıda çözüm yüzeyinin sınırını bulmak için ek elektrolit dökün.
      Not: Eğer Anodization çözüm dokunmadan elektro-parlatma sınır ile yürütülen, Al plaka anodization sırasında yazmak eğilimindedir.
    5. Dik milli bir U şeklinde Kaide yükleyin. Bir havai karıştırıcı ve metal kelepçeler kullanılarak fan ekleyin. Her iki elektrot daha düşük sonuna yakın fan pervane getirin. Havai karıştırıcı dönme hızı 200 ve 300 rpm arasında ayarlayın.
    6. Çift ceket kabı bir sirkülatörün bağlanmak ve sıcaklığı-10 ° C'de ayarlamak Sıcaklığı-10 ° C'ye düşünceye kadar karıştırma altında en az 1 h için sistemi terk
      Not: Su soğutucu kullanmayın. Düşük sıcaklıklarda su donuyor çünkü kan dolaşımı normal çalışmaz. Bu bir su karışımı ve etil alkol oranı 1:1 soğutucu olarak kullanmak için tavsiye edilir.
    7. 195 V 16 h için karıştırma altında bir gerilim uygulanır.
      Not: Geçerli 50'den fazla çıkarsa mA 2 veya 3 gerilim uygulandıktan sonra saat içinde yanan oluşacaktır olasılık çok yüksek. Hemen işlemini durdurmak ve Al plaka yenisiyle değiştirin. Tekrar tekrar bu sorun ortaya çıkarsa, sirkülatörün sıcaklık kontrolü hiçbir anormallik olup olmadığını denetleyin. Hiçbir anormallik, elektrolit değiştirin.
    8. Güç kaynağı durdurmak ve el ile Al plaka kırpmak--dan ayrı. Anodize Al plaka tüm kalan çözümü kaldırmak için deiyonize su ile yıkayın.
  2. Alümina gravür
    1. Kromik asit 500 mL deiyonize su 9.0 g krom oksit (CrO3) ve fosforik asit (H3PO4, % 85) 20,3 mL çözülerek çözüm aşındırma hazırlayın.
    2. Gravür çözüm 1 L çift ceket kabı dökün. Sıcaklık 65 ° C'de ayarla
    3. Anodize Al plaka gravür çözüm için en az 10 h karıştırma altında bırakın. Üst ölçek kabı alüminyum folyo ile kapatın.
    4. Kazınmış Al plaka deiyonize su ile birkaç defa durulayın.
  3. İkincil anodization
    1. Aynı deneysel koşullar adım 2.1.1-2.1.7 ayarlayın.
    2. Sistem anot kazınmış Al plakasına yüklemek ve bir gerilim 195 V 6 h için geçerlidir. Daha sonra güç kaynağını ve el ile Al plaka kırpmak--dan ayırmak. Hemen anodize Al plaka deiyonize su ile yıkayın.
      Not: Çamaşır zaman gecikmeli AAO gözenek boyutunu istemeden kalan fosforik asit nedeniyle artar.
  4. Degrade gözenek genişletme
    1. Gözenek genişleyen çözüm 5.765 g 500 mL deiyonize su fosforik asit çözülerek hazırlayın. Çözüm 1 L çift ceket kabı dökün.
    2. Çift ceket kabı için sirkülatörün bağlanmak ve sıcaklığı 30 ° C'de ayarlamak Doğrusal hareketli sahne kabı yanındaki dikey olarak yerleştirin. Köşeli ayraç doğrusal sahne hareketli parçası ekleyin.
    3. Doğrusal sahne hareketli parçası konumuna ayarlayın. Küçük resmi vidalar ve eloksallı Al plaka yükleyin.
    4. Böylece Al plaka tam çözüm yüzeyi üzerinde gelecek Al plaka konumunu el ile işlemek.
      Not: Bu adımda, Al plaka çözüm dokunmamanız gerektiğini. Al plaka çözüm ulaşır ulaşmaz gözenek genişletme işlemi başlar.
    5. Yavaş yavaş bir 35 mm AAO kalıp boyutu 120 degrade oluşturmak için 120 dakika için 4,86 µm/s hızında çözüm içine Al plaka bırakın nm 200 nm (GP 120/200). Bir kronometre Al plaka çözüm yüzeyine dokunduğundan Şu anda başlar.
    6. GP 200/280 ve GP 280/360 kalıpları yapmak için çözüm için 2 veya 4 h, sırasıyla genişletme gözenek GP 120/200 kalıp tüm alan bırakın.
    7. Degrade Al plaka deiyonize su ile birkaç defa durulayın.

3. kendi kendine monte Monolayer degrade AAO küf Anti-yapışma katmanda birikimi

Not: 3.2.1 3.3.3 torpido gözünde adımları. Bir vakum pompası ve kuru azot gazı enjektör eldiven kutusuna bağlanın. Tüm örnekler, reaktifler ve çizgisel nem alma işlemi öncesinde eldiven kutusuna yerleştirin. Tahliye ve azot gaz enjeksiyon döngüsü üç defadan fazla yeterli nem eldiven kutusundan kaldırmak için yineleyin. Kuru azot izin akış deneyi ile edildi.

  1. Hidroksil AAO kalıp Piranha tedavi ile modifikasyonu
    1. 140 mL sülfürik asit dökmek (H2SO4, %95) bir politetrafloroetilin (PTFE) ölçek. Hidrojen peroksit dropwise 60 mL (H2O2, % 30) ekleyin. Çözüm soğuduktan kadar 30 dk için bırakın.
      Uyarı: Piranha çözüm konusunda son derece dikkatli olun. Hidrojen peroksit ekleme andan itibaren çözüm şiddetle kaynar ve yüksek sıcaklık üretir. Deneme bir duman mahallede gerçekleştirin.
    2. AAO kalıp 30 için çözüm içinde kaybolmanızı s ametal bir cımbız kullanarak.
    3. AAO kalıp deiyonize su ile birkaç defa durulayın. Kalıp içinde 30 dk için deiyonize suyla ıslatın ve metil alkol başka bir 30 dk için koydum.
      Uyarı: Kullanılan Piranha çözüm atma zaman musluk suyu bol miktarda çözüm oranında seyreltin.
    4. AAO kalıp 3 h için vakum altında kurumasını.
  2. 20 × HDFS hisse senedi çözüm hazırlanması
    Not: HDFS (heptadecafluoro-1,1,2,2, - tetrahydrodecyl) bir kısaltma olduğunu dimethylchloro-silane
    1. -Üçte bir 1 L n-hekzan şişe moleküler elekler ile doldurun. Parafin film şişeyle mühür ve 24 saat için kuru azot altında saklayın.
    2. 200 mL n-hekzan cam şırınga ve 0.2 µm PTFE şırınga filtre kullanarak filtre.
    3. Filtre uygulanmış n-hekzan 80 mL 100 mL Cam şişe içine dökün. HDFS 2 mL ekleyin.
  3. Kendi kendine monte monolayer ifade
    1. Filtre uygulanmış n-hekzan bir 100 mL ölçek 57 mL yükleyin. AAO kalıp çözücü bırakın.
    2. HDFS hisse senedi çözüm 3 mL n-2,9 mM HDFS çözüm yapmak hekzan için ekleyin. Devam etmek reaksiyon için 10 dakika bekleyin.
    3. AAO kalıp taze n-hekzan aktarın. Kapatın ve tüm reaktif şişe mühür. Azot Vanayı kapat sonra torpido örnekleri dışarı çekin.
      Not: HDFS nem için son derece duyarlıdır. HDFS bir desiccator içeren tüm reaktifler saklayın.
    4. AAO kalıp 60 mL methoxynonafluorobutane (C10H6F18O2, % 99) emmek. Ultrasonik AAO kalıp bir ölçek 10 temiz s fiziksel olarak kaldırmak için bir kez başına adsorbe HDFS molekülleri. Temizlik yordamı 10 kez yineleyin.
      Not: Aralıkları olmadan uzun bir süre için ultrasonik AAO kalıp açığa oksit tabaka zarar verir.
    5. AAO kalıp 24 h için vakum altında kurumasını.
      Not: Bir başarıyla yatırılan Anti-yapışma süper su geçirmez ve ay için istikrarlı bir desiccator içinde depolanan katmanıdır. Protokol burada duraklatılmış.

4. degrade Nanopattern plakaları termal sürecinden tarafından imalatı

Not: 4.2-4.7 bir temiz oda adımları.

  1. 1,1 mm kalınlığında polistren sac 3.7 mm uzunluğunda bir baskılı devre kartı (PCB) kesici kullanarak 2,9 mm geniş bir boyutuna kesme.
  2. AAO kalıp 35 mm bir nipper kullanarak alt kesti. Üretim arkasında tarih ve örnek adı mark.
  3. Bir 8.0" gofret etil alkol küçük bir doz ile temizleyin. Polistren levhalar üzerinde gofret yapıp, işleri AAO kalıp bağlama.
  4. Alt film termal imprinter çekmeceye koy. En iyi film için conta iliştirin.
  5. Gofret alt film koymak. Conta gofret yerleştirin. Gofret üzerinde toz yok olduğundan emin olun.
  6. Termal imprinter çekmeceyi kapat. 165 ° C ısı ve 620.52 kPa basınç 100 için geçerli s.
  7. Oda sıcaklığında örneğe ne yapıyorsun? Yavaşça AAO kalıp serbest bırakmak için Polistren levha twist.

5. sterilizasyon ve degrade Nanopattern plakaları hidrofilik değiştirilmesi

  1. Nanopattern plaka üzerinde bir kare tabak yerleştirin. 100 mL % 70 Etil alkol dökün ve 30 dk için ultraviyole ışık için maruz.
  2. Azot ile nanopattern tabak kuru. Nanopattern plakaları bir oksijen plazma jeneratörü aktarın.
  3. 1.33 ulaşıncaya kadar tahliye odası baba. O zaman, 30 cm3oranında oksijen enjekte/dk. 60 W. koru oksijen plazma 90 için bir radyo frekansı güç uygulamak s.
    Not: Bu plazma tedavi nanopattern plakaları 14 gün içinde kullanmak için tavsiye edilir.
  4. Nanopattern plaka Toluen bir damla kullanarak bir hücre kültür çanak alt kısmına takın.
  5. Bir kese örneklerinde mühür ve düşük sıcaklık plazma ısıtıcı ile sterilize.

6. hECFCs tarımı

Not: Aksi belirtilmediği sürece 4 ° C'de tüm centrifuging prosedürlerini yürütecektir.

  1. Periferik kan yalıtma önce mononükleer hücreler (PBMCs), bir 12-şey kültür kolajen kaplı yemek için 1 h 37 ° C'de kuluçkaya.
  2. 1 × steril fosfat tamponlu tuz (PBS) kullanarak 12-şey kültür bulaşık yıka.
  3. 50 mL heparin inhibitörü tüp kullanarak insan kanı toplamak.
  4. 6 mL hidrofilik polisakkarit çözeltisi 15 mL tüp içinde koymak ve 8 mL kan hidrofilik polisakkarit ekleyin.
    Not: Yavaş yavaş kan hidrofilik polisakkarit çözümde pipette.
  5. Tüp vasıl 1020 x g hücreleri cips 20 dk santrifüj kapasitesi.
  6. Opak hücre katmanı hasat ve yeni bir 15 mL tüp aktarın.
  7. % 10 fetal Sığır serum (FBS) Ekle-PBS kapsanan ve tüp vasıl 1020 x g hücreleri cips 10 dk santrifüj kapasitesi.
  8. Süpernatant kaldırın ve kırmızı kan hücre lizis arabellek ekleyin. 5 min için buz üzerinde tutun.
  9. % 10 PBS FBS yer alan ekleyin ve tüp vasıl 1020 x g hücreleri cips 5 dakika santrifüj kapasitesi.
  10. Süpernatant kaldırın ve % 10 PBS FBS yer alan ekleyin. Santrifüj tüpü 1020 x g hücreleri cips 5 min için de kapasitesi.
  11. Süpernatant kaldırın ve 1 mL % 10 ile desteklenmiş endotel hücre genişletme orta ekleyin FBS. Her kolajen kaplı yemek için iyi başına tohum 8.0 × 106 hücre.
  12. Kültür orta 1 hafta boyunca her gün değiştirin. O zaman, kültür orta 2 günde değiştirin.
    Not: hECFCs kültür 10-14 gün sonra bulundu. hECFCs tipik Arnavut kaldırımlı benzeri morfoloji göstermek ve faz kontrast mikroskobu içinde gözlenen bir koloni oluşturur. Von Willebrand faktör (vWF) ve vasküler endotel cadherin (CD144) ayirt boyama da daha fazla hücre genişletme sonra hECFCs karakterizasyonu için gerçekleştirilebilir.
  13. HECFCs yetiştirmek için endotel hücre genişletme orta %5 FBS ve penisilin/streptavidin oksijen bir atmosferde % 5 CO2içeren 37 ° C'de ile takıma kullanın. Orta günde bir kez değiştirin.
  14. HECFC indüksiyon sonra geçiş 7 daha fazla deneyler için hücreleri büyümeye.

7. hücre tohum ve degrade Nanopattern tabaklarda kültür

Not: Adım 7 hECFCs kültür degrade nanopattern plaka üzerinde açıklar, ancak diğer hücre kaynakları da kullanılabilir.

  1. 1 mL %0.1 protein kaplama çözeltisi PBS içinde oda sıcaklığında 10 dakika ile kat degrade nanopattern tabaklar.
    Not: % 0.1 protein kaplama nanopillar özelliklerinin içermez.
  2. HECFCs süspansiyon tripsin kullanarak standart bir hücreyi bölme yol tarafından kültür yemek yapmak.
  3. İstenen izdiham ulaşmak için hücre süspansiyon sulandırmak. Degrade nanopattern plakaları ve düz kontrol (örneğin, 1,0 × 104 hücreleri/cm2) üzerine hECFCs tohum.
    Not: HECFCs 1,0 × 104 hücreleri/cm2 degrade nanopattern plakaları seribaşı zaman, hücre confluency genellikle 2 gün sonra % 70-80 ulaşır.
  4. Hücreleri düz veya degrade nanopattern plakaları kuluçka 2 gün için kültür.

8. gözlem ve analiz

  1. Taramalı elektron mikroskobu (SEM) görüntüleme
    1. Düz veya degrade nanopattern plakaları ile 4 ° C'de % 2.5 oxazolidin gece için kültürlü hECFCs saptamak.
    2. % 1 osmiyum tetroxide 1 h için oda sıcaklığında tedavi. Örnekleri PBS ile yıkayın.
    3. Etil alkol düşük yüksek konsantrasyon (% 50, % 70, %80, % 90 ve % 100) her adım başı 10 dk örnekleriyle kurutmak.
    4. Hexamethyldisilazane (HMDS) 15 dakika oda sıcaklığında tedavi. Bundan sonra örnekleri ile taze HMDS yıkama ve örnekleri duman başlık altında kalan HMDS tamamen buharlaşır kadar en az 1 gün bırakın.
    5. Platin sputter coater 5 min için örnekleriyle kat ve bir SEM ile incelemek
  2. Transmisyon Elektron mikroskobu (TEM) görüntüleme
    1. Gece için 4 ° C'de %2 paraformaldehyde ve % 2.5 oxazolidin karışımı içinde PBS ile düz veya degrade nanopattern tabaklarda kültürlü hECFCs saptamak.
    2. Sonrası fiksasyon gerçekleştirmek % 1 osmiyum tetroxide kullanarak ve istimal belgili tanımlık yöntem içinde 8.1.3 örnekleri kurutmak.
    3. Epoksi reçine örnekleri katıştır. Blok 60 nm kalın bölümleri yapmak ve bir bölüm bir TEM ızgara üzerinde yer.
    4. Bölüm 10 mg uranyl asetat 100 mL metil alkol ve 0.1 mg kurşun sitrat 100 mL distile su karışımı ile leke. Bir TEM ile görüntü elde.
  3. Floresans boyama
    1. Düz veya degrade nanopattern plakaları ile 15 dakika oda sıcaklığında %4 paraformaldehyde kültürlü hECFCs saptamak.
    2. Permeabilize ve örnekleri %5 keçi serum ve % 0.1 octylphenol PBS (PBST) ethoxylate, oda sıcaklığında 30 dakika ile blok.
    3. Örnekleri ile Anti-insan vinculin birincil antikor (PBST 1:500), oda sıcaklığında 2 h. durulama örnekleri üç kez ile PBST için kuluçkaya.
    4. Floresans Birleşik örnekleri ile floresan Birleşik phalloidin (1:1, 000 PBST), ikincil antikor (PBST 1:1, 000), oda sıcaklığında 2 h. durulama örnekleri üç kez ile PBST için kuluçkaya.
    5. Örnekleri ile 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, PBST 1:1,000), oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya.
    6. 10 µL montaj orta gradyan nanopattern yüzey üzerinde bırak. Bir coverslip montaj medyada yer.
    7. Örnek baş aşağı örnek sahnesinde yerini ve confocal floresan mikroskop kullanarak görüntüleri.
  4. Görüntü Analizi
    1. HECFCs çekilen bir görüntü analiz sistemi aktarın.
    2. Resim boyama phalloidin rasgele alanı seçin. Eşik ayarlayın ve hücrelerin arka plandan farklı olan bir ikili görüntü oluşturun.
    3. Hücre alan ve çevre ölçmek ve el ile filopodia hücre başına saymak için hücrelerin etrafındaki hatlarını çizin.
    4. Resim boyama vinculin rasgele alanı seçin. Eşik ayarlayın ve odak yapışma alanlarda ikili bir görüntüsünü oluşturabilirsiniz.
      Not: Görüntü eşik yapay bitti - veya altında - filling odak yapışma alanları önlemek için uygun şekilde ayarlayın.
    5. Her hücrenin odak yapışma saymak.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar


Şekil 1 SEM görüntüleri uydurma degrade AAO kalıp türüne ve konumuna göre gösterir. Şekil 2 SEM görüntüleri degrade nanopattern plakaları ile normal yuvarlak nanopillars gösterir ve Şekil 3 nanopillar çapının miktar verilerdir. Tablo 1 fabrikasyon nanopillars özellikleri listeler.

Şekil 4A ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Sık sık bir AAO imalatı kusurları çatlaklar, gözenekleri ve yazma düzensiz şekiller gibi muzdarip. Ana nedeni bu kusurları için güçlü Eloksal metal yüzeylerde yapısı ve elektrolit21direnci etkilenir elektrolitik bir arıza denir. Bağlı olarak sıcaklık elektrolit direnci değişir bu yana ısı sürekli elektrotlar ortadan kaldırmak olarak böyle bir yüksek gerilim Eloksal durum ahırda elektrolit gerektirebileceği sıcaklığı korumak için kritik nokta olduğunu. Bu iletişim kuralı, AAO kalıpları Masuda'nın i...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Bu eser temel bilim araştırma programı aracılığıyla Ulusal Araştırma Vakfı, Kore (Milli Eğitim Bakanlığı, bilim ve teknoloji (MEST) [NATO Mukabele Gücü-2015R1D1A1A01060397] ve biyolojik ve tıbbi teknoloji geliştirme tarafından finanse edilen NMG) tarafından desteklenmiştir NMG Bilim Bakanlığı, ICT ve gelecek planlama [NATO Mukabele Gücü-2017M3A9C6029563] tarafından finanse edilen program.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Perklorik asit% 60Daejung Kimyasalları & Metaller6512-4100
Etil alkol, mutlak %99,9DaejungKimyasallar & Metaller4118-4100
Fosforik asit %85Daejung Kimyasallar & Metaller6532-4400
Metil alkol% 99.5Daejung Kimyasallar & Metaller5558-4400
Krom (VI) oksitDaejung Kimyasallar & Metaller2558-4400
Sülfürik asit %95Daejung Kimyasallar & Metaller7781-4100
Hidrojen peroksit %30Daejung Kimyasallar & Metaller4104-4400
n-hekzan %95Daejung Kimyasallar & Metaller4081-4400
Toluen %99,5Daejung Kimyasallar ve Metaller8541-4400
(heptadekafloro-1,1,2,2, -tetrahidrodesil) dimetilklorosilanGelestSIH5840.4Neme duyarlı
Metoksinonaflorobütan% 99Sigma aldrich464309
Kollajen çözeltisiKök hücre# 4902
JelatinSigma aldrichG1890Protein kaplama çözeltisi
Ficoll-PaqueGE Heathcare17-1440-03Hidrofilik polisakkarit çözeltisi
EGM-2MVLonzaCC-3202Endotel hücre genişleme ortamı
Penisilin-StreptomisinGibco15140-122
Fosfat tamponlu salinGibco10010031
Fetal sığır serumuGibco12483-020
ParaformaldehitSigma aldrichP6148
GlutaraldehitSigma aldrichG5882-100ML
Osmiyum tetroksitSigma aldrich201030-1G
HeksametildisilazaneSigma aldrich440191
Triton X-100Sigma aldrichX100-100MLOktilfenol etoksilat 
Keçi serumuGibco26050-088
anti-insan vinkülin birincil antikoru Sigma aldrichV9131
F-aktin probuMoleküler ProblarA12379Floresan konjuge phalloidin
Alexa Fluor 488-konjuge anti-fare   IgG antikoruMoleküler ProblarA11001Floresan konjuge ikincil antikor 
4 ', 6-diamidino-2-fenilindol ve nbsp;Sigma aldrichD9542
Montaj ortamıDAKOS3023
Anti-insan vWF birincil antikoru DAKOA0082
Anti-insan  CD144 primer antikor BD Biosciences#555661
Eponate 12&ticaret; Gömme Kiti, BDMA ileTed Pella18012Epoksi reçine
Uranil Asetat, 25gTed Pella19481
Kurşun Sitrat, Trihidrat, 10gTed Pella19312
Ultra saf alüminyum levhaGoodfellow26050-088
Polistiren levhaGoodfellowST313120
8.0" silikon gofretSiltron29-01024-03Tek tarafı cilalı, 725 & m kalınlığında
Vakumlu desikatör, 4.4 LKartellKA.230
Vakum pompasıVakumlu V3. VOP100
Güç kaynağıUnicorntechUDP-3003
Manyetik karıştırıcıDaihan scientificSL.
Üstten karıştırıcıDaihan bilimselHT120DX
SirkülatörDaihan bilimselWCR-P12
Doğrusal hareketli tablaZaberA-LSQ300A-E01-KT07
Köşebent, 90 dereceZaberAB90MLineer hareketli tabla
aksesuarı PMP forseps, 145 mmVitlab67995Metalik olmayan cımbız
PTFE beher, 250 mLCowieCW007.25
Ultrasonik temizleyiciBransonB2510MTH
PCB kesiciHozan Aracı EndüstriyelK-110
Nanoimprint cihazıNanonexNX-2000
Oksijen plazma jeneratörüFemto ScienceCUTE
Düşük sıcaklık sterilizatörüLowtemKristal 50
CO2 İnkübatörPanasonicMCO-18AC
Confoal lazer tarama mikroskobuCarl ZeissLSM700
Taramalı elektron mikroskobuJEOLJSM6701
Transmisyon elektron mikroskobuHitachiH-7500
SMS03022

Kaynaklar

  1. Dalby, M. J., Gadegaard, N., Oreffo, R. O. Harnessing nanotopography and integrin-matrix interactions to influence stem cell fate. Nature materials. 13 (6), 558-569 (2014).
  2. Qian, W., Gong, L., Cui, X., Zhang, Z., Bajpai, A., Liu, C., Castillo, A., Teo, J. C., Chen, W. Nanotopographic Regulation of Human Mesenchymal Stem Cell Osteogenesis. ACS Applied Materials & Interfaces. 9 (48), 41794-41806 (2017).
  3. Naganuma, T. The relationship between cell adhesion force activation on nano/micro-topographical surfaces and temporal dependence of cell morphology. Nanoscale. 9 (35), 13171-13186 (2017).
  4. Han, J., Lin, K. H., Chew, L. Y. Study on the regulation of focal adesions and cortical actin by matrix nanotopography in 3D environment. Journal of Physics: Condensed Matter. 29 (45), 455101(2017).
  5. Liu, X., Wang, S. Three-dimensional nano-biointerface as a new platform for guiding cell fate. Chemical Society Reviews. 43 (8), 2385-2401 (2014).
  6. Turner, L. A., Dalby, M. J. Nanotopography-potential relevance in the stem cell niche. Biomaterials science. 2 (11), 1574-1594 (2014).
  7. Driscoll, M. K., Sun, X., Guven, C., Fourkas, J. T., Losert, W. Cellular contact guidance through dynamic sensing of nanotopography. ACS nano. 8 (4), 3546-3555 (2014).
  8. Yim, E. K., Darling, E. M., Kulangara, K., Guilak, F., Leong, K. W. Nanotopography-induced changes in focal adhesions, cytoskeletal organization, and mechanical properties of human mesenchymal stem cells. Biomaterials. 31 (6), 1299-1306 (2010).
  9. Davis, G. E., Senger, D. R. Endothelial extracellular matrix. Circulation research. 97 (11), 1093-1107 (2005).
  10. Nakayama, K. H., Surya, V. N., Gole, M., Walker, T. W., Yang, W., Lai, E. S., Ostrowski, M. A., Fuller, G. G., Dunn, A. R., Huang, N. F. Nanoscale patterning of extracellular matrix alters endothelial function under shear stress. Nano letters. 16 (1), 410-419 (2015).
  11. Bettinger, C. J., Zhang, Z., Gerecht, S., Borenstein, J. T., Langer, R. Enhancement of in vitro capillary tube formation by substrate nanotopography. Advanced materials. 20 (1), 99-103 (2008).
  12. Katz, B. Z., Zamir, E., Bershadsky, A., Kam, Z., Yamada, K. M., Geiger, B. Physical state of the extracellular matrix regulates the structure and molecular composition of cell-matrix adhesions. Molecular biology of the cell. 11 (3), 1047-1060 (2000).
  13. Deanfield, J. E., Halcox, J. P., Rabelink, T. J. Endothelial function and dysfunction. Circulation. 115 (10), 1285-1295 (2007).
  14. Tajima, S., Chu, J., Li, S., Komvopoulos, K. Differential regulation of endothelial cell adhesion, spreading, and cytoskeleton on low-density polyethylene by nanotopography and surface chemistry modification induced by argon plasma treatment. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 84 (3), 828-836 (2008).
  15. Mohiuddin, M., Pan, H. A., Hung, Y. C., Huang, G. S. Control of growth and inflammatory response of macrophages and foam cells with nanotopography. Nanoscale research letters. 7 (1), 394(2012).
  16. Kyle, D. J., Oikonomou, A., Hill, E., Bayat, A. Development and functional evaluation of biomimetic silicone surfaces with hierarchical micro/nano-topographical features demonstrates favourable in vitro foreign body response of breast-derived fibroblasts. Biomaterials. 52, 88-102 (2015).
  17. Seo, H. R., Joo, H. J., Kim, D. H., Cui, L. H., Choi, S. C., Kim, J. H., Cho, S. W., Lee, K. B., Lim, D. S. Nanopillar Surface Topology Promotes Cardiomyocyte Differentiation through Cofilin-Mediated Cytoskeleton Rearrangement. ACS Applied Materials & Interfaces. 9 (20), 16803-16812 (2017).
  18. Hwang, J. H., Lee, D. H., Byun, M. R., Kim, A. R., Kim, K. M., Park, J. I., Oh, H. T., Hwang, E. S., Lee, K. B., Hong, J. H. Nanotopological plate stimulates osteogenic differentiation through TAZ activation. Scientific Reports. 7 (1), 3632(2017).
  19. Bae, D., Moon, S. H., Park, B. G., Park, S. J., Jung, T., Kim, J. S., Lee, K. B., Chung, H. M. Nanotopographical control for maintaining undifferentiated human embryonic stem cell colonies in feeder free conditions. Biomaterials. 35 (3), 916-928 (2014).
  20. Cui, L. H., Joo, H. J., Kim, D. H., Seo, H. R., Kim, J. S., Choi, S. C., Huang, L. H., Na, J. E., Lim, I. R., Kim, J. H. Manipulation of the response of human endothelial colony-forming cells by focal adhesion assembly using gradient nanopattern plates. Acta biomaterialia. 65, 272-282 (2017).
  21. Lee, W., Park, S. J. Porous anodic aluminum oxide: anodization and templated synthesis of functional nanostructures. Chemical reviews. 114 (15), 7487-7556 (2014).
  22. Masuda, H., Fukuda, K. Ordered metal nanohole arrays made by a two-step replication of honeycomb structures of anodic alumina. science. 268 (5216), 1466(1995).
  23. Masuda, H., Satoh, M. Fabrication of gold nanodot array using anodic porous alumina as an evaporation mask. Japanese Journal of Applied Physics. 35 (1B), L126(1996).
  24. Zaraska, L., Sulka, G. D., Jaskuła, M. The effect of n-alcohols on porous anodic alumina formed by self-organized two-step anodizing of aluminum in phosphoric acid. Surface and Coatings Technology. 204 (11), 1729-1737 (2010).
  25. Yang, K. Y., Kim, J. W., Byeon, K. J., Lee, H. Selective deposition of the silver nano-particles using patterned the hydrophobic self-assembled monolayer patterns and zero-residual nano-imprint lithography. Microelectronic engineering. 84 (5), 1552-1555 (2007).
  26. Park, B. G., Lee, W., Kim, J. S., Lee, K. B. Superhydrophobic fabrication of anodic aluminum oxide with durable and pitch-controlled nanostructure. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. 370 (1), 15-19 (2010).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Anodik Al minyum OksitNanos tun FabrikasyonuH cre Yan t TaramaG zenek Geni letme Tekni iKendi Kendine D zenlenen MonotabakalarPolistiren SubstratFilopodyum Uzamas

İlgili makaleler