Yöntem makalesi

Vitro Decidualization için insan endometrium Stromal hücre izolasyon

DOI:

10.3791/57684

⸱

1 Eylül 2018

 ,  ,  , 
1Department of Obstetrics and Gynecology, Center for Reproductive Health Sciences, Washington University School of Medicine

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmada yalıtım ve kültür vitro decidualization tahlil yapmak için insan endometrium stromal hücre için doğrulanmış ve en iyi duruma getirilmiş bir yordam sunar. Ayrıca, bu çalışmada çift insan endometrium stromal hücreler kullanarak belirli bir gen için verimli bir şekilde devirme detaylı bir yöntem sağlar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan endometrium stromal hücrelerden (HESC) fibroblast benzeri görünüm salgı decidua içine farklılaşma anne rahim rahim astarı içine embriyo implantasyonu için gerekli bir dönüşümdür. Yanlış decidualization implantasyon başarısızlığı ve sonraki erken embriyo düşük için kök neden olarak kurulmuştur. Bu nedenle, decidualization temel moleküler mekanizmaları anlama başarılı Doğum oranı artırmak için avantajlıdır. Yapay decidualization dayalı in vivo çalışmalar kez etik ikilemler içinde hayvan modelleri translasyonel komplikasyonlar yanı sıra insan araştırma ile ilişkili nedeniyle sınırlı hale gelir. Sonuç olarak, vitro deneyleri birincil hücre kültürü aracılığıyla sık sık decidualization modülasyon hormonlar keşfetmek için kullanılmaktadır. Bu çalışmada HESC yalıtım ve sonraki yapay decidualization kodlamayla orta hormonların takviyesi ile detaylı bir protokol sağlar. Daha fazla, bu çalışmada nakavt iyi tasarlanmış bir yönteme herhangi bir gen ilgi lipid tabanlı siRNA transfections kullanarak sağlar. Bu iletişim kuralı kültür saflık yanı sıra ürün verim, böylece bu modeli moleküler mekanizmalar decidualization ve bir sonraki miktar temel anlamak için güvenilir bir yöntem kullanma özelliğini maksimize optimizasyonu izin verir. decidualized rahim stromal hücreler tarafından salgılanan ajanlar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Marche aşamaları ve menopoz arasında üreme çağındaki kadınların rahim yayılması hormon düzenlenir, farklılaşma ve sonraki gebelikte adet1 bilinen bir işlem için hazırlık dökülme aylık döngüleri geçmesi ,2. İnsan endometrium tür fiziksel değişiklikler1rahim duvarı içine uygun embriyo implantasyonu için gereklidir. Morfolojik ve biyokimyasal uyarlamaları, dahil olmak üzere endometrium, değişikliklere aracılı yumurtalık steroid hormonlar östrojen ve progesteron (P4) üzerinden adet döngüsü boyunca3,4,5. (Veya) foliküler proliferatif faz içinde endometrium kalınlaşma başlatılıyor artış, preovulatory östrojen düzeyleri. Yumurtlama, salgı (ya da luteal) evre rahim stromal hücre (ESC) morfolojik dönüştürme inducing P4 konsantrasyonlarda önemli bir artış fibroblast benzeri çıkışı yuvarlak hücrelere, epitel benzeri decidual teşvik decidualization4,6bilinen bir işlem içinde. Yanlış decidualization implantasyon başarısızlığı ve sonraki erken embriyo düşük4,7,8için bir kök neden olarak kurulmuştur. Bu nedenle, decidualization temel moleküler mekanizmaları anlama tanı ve tedavisinde erken gebelik kaybı için avantajlıdır.

Şu anda, çeşitli metodolojiler endometrium stromal hücre decidualization temel etkilerini araştırmak için kullanılmaktadır. Vivo, fare rahim yapay olarak mekanik stimülasyon (tırmalamakYani,) üzerinden decidualization için indüklenen veya yağ enjeksiyonu hormonal astarlanmalıdır rahim9. Farklı insanlar, sentetik Bu uyarımı rahim lümen farklılaşma blastosist varlığı, kemirgenler10,11decidualization başlatılması için gerekli bir adım görünümünü sağlayarak teşvik etmektedir. Buna göre hayvan modelleri ve temel in vivo çalışmalar insanlarda çevreleyen etik ikilemler ile ilgili translasyonel komplikasyonlar nedeniyle decidualization dayalı modelleri en başarılı bir şekilde incelendiği tüp bebek.

Bu çalışmada, konular aracılığıyla yerel hem İngilizce hem de İspanyolca gazete reklam yerleşimini işe. Bu çalışma için uygun adaylar olarak tanımlanan konular potansiyel riskleri tam açıklanması açıklanmıştır araştırma koordinatörü ile karşılamak için toplanırlar. Potansiyel risklerini tam bir anlayış onayı, yazılı ve sözlü formlarda konularda izni elde edilebilir. Konu izni izni (1) geçmesi flebotomi (2) uzun süreli depolama gelecekteki araştırma amacıyla onların dokuların ve kabul (3) birincil kültürler oluşturma için toplanan doku örnekleri içerir. Rıza konular yarış/etnisite ve/veya sağ gizlilik için izin verilen hangi kendi içinde tamamlamak için bir form verilir. Bir sonraki ziyaret ilgilinin adet döngüsü üzerinde dayalı endometrium biyopsi ulaşmak için planlanmıştır. Bu çalışma için işe gönüllü St. Louis metropolitan bölgesi etnik ve ırksal demografisi 2012 sayım tarafından belirtildiği gibi yansıtmak ve hamile kadınlar, fetus, embriyo de dahil olmak üzere herhangi bir savunmasız nüfus katılımı dahil değil, 18 yaş altı yaş veya diğer korunmasız grupların çocuklar. Uygunluk şartları biyopsi örnek koleksiyon katılım için yaş arası 18-45 yıl (2) (3) hiçbir geçerli gebelik veya hormonal/intrauterin aygıt kontraseptif kullanımı sahip normal siklus (25-32 gün) sahip olmak (1) dahil hiçbir geçerli vajinal enfeksiyon veya cinsel yolla bulaşan hastalıklar (5) hiçbir mevcut antibiyotik tedaviler ve (6) sahip sahip için 30 gün önce kayıt (4) hiçbir geçerli anormal Pap smear sahip.

Bu çalışma içinde insan endometrium stromal hücreler (HESC) kültürlü ve vitro decidualization (estradiol (E2), medroxyprogesterone asetat (MPA) ve siklik adenozin hormonların takviyesi üzerinden geçmesi yapay indüklenen monofosfattır (kampı)) orta. Bu yöntemde, decidualization derecesine göre gün hormonal tedavinin toplam sayısı değişir. Hücre iskeleti düzenlenmesi ile birlikte, hormon takviyesi biyokimyasal uyarlamalar decidual hücreler salgı benzeri nitelikleri2,4deneyim neden olmaktadır. Prolaktin (PRL) ve insülin benzeri büyüme faktörü bağlayıcı protein 1 (IGFBP1), gibi hallmark genlerin ifade onaylamak ve HESC decidualization5,12, derecesini ölçmek için kullanılması gereken 13 , 14. önemli, gen belirli nakavt yapmak için bu iletişim kurallarını canlılığı de gösterdi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma için toplanan tüm insan endometrium biyopsi Washington Üniversitesi St. Louis, kadın hastalıkları Bölümü'nden elde ve bir kurumsal İnceleme Kurulu (IRB) kullanarak kadın hastalıkları yazılı onayı formu onaylı.

1. hazırlık

  1. 1 x Hank'in dengeli tuz çözüm (HBSS) 500 mL (HBSS + aracı olarak daha fazla başvurulan) medya içeren şişe 100 U/mL penisilin ve 100 µg/mL streptomisin ekleyerek hazırlayın.
  2. Dulbecco'nın modifiye kartal orta 500 mL hazırlamak: fenol red, L-glutamine ve 15 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic asit (HEPES) % 1 antibiyotik antimycotic çözüm (son konsantrasyonu ekleyerek besin karışımı F-12 (DMEM/F12) 100 U/mL penisilin, 100 µg/mL streptomisin ve 0,25 µg/mL Fungizone) (daha fazla HESC yalıtım ortamı olarak başvurulan) şişe içeren medya için.
  3. %10 Fetal sığır Serum (FBS), 1 x Na2HCO3ve % 1 ekleyerek DMEM/F12 500 mL fenol red, L-glutamine ve 15 mM HEPES hazırlamak penisilin (10.000 U/mL) ve streptomisin (10.000 µg/mL) (kalem Strep) medyaya (daha fazla şişe içeren HESC medya başvuru olarak).
  4. L-Glutamine, 2.4 g/L sodyum bikarbonat ve HEPES ile Serum orta azaltılmış 500 mL % 2 ile hazırlamak kömür Stripped Fetal sığır Serum (csFBS) ve % 1 kalem Strep (daha fazla Decidualization medya başvurulan) şişe içeren medya için.
  5. Fenol (daha fazla değişim medya başvurulan) şişe içeren medya fetal Sığır serum (csFBS) ücretsiz DMEM/2% kömür ekleyerek F12 elimden kırmızı 500 mL hazırlayın.
  6. 10 nM estradiol (E2), 1 µM medroxyprogesterone asetat (MPA) ve 50 µM siklik adenozin monofosfattır (kampı) 15 mL polipropilen konik tüp içinde hazırlamak ve vitro için önceden hazırlanmış decidualization ortamının iyi aliquot başına 2 mL ekleyin decidualization tahlil (EPC medya daha fazla başvurulan).
  7. Medya %90 FBS ve % 10 dimetil sülfoksit (DMSO) ile (daha fazla buz gibi medya başvurulan) 50 mL polipropilen konik tüp buz gibi 50 mL hazırlayın.
  8. 25 mg Collagenase ve 5 mg DNaz önceden tartmak ben bir 50 mL konik polipropilen boru ve store-20 ° C'de

2. insan Endometrium biyopsi alma

  1. İnsan endometrium biyopsi örnekleri proliferatif faz (gün 9 - gün 12) toplanan HBSS onaylı IRB klinikte adet döngüsü elde.
  2. Biyopsi örnekleri prewarmed 37 ° C HBSS + orta 1 mL ile yıkama ve aşırı kan kaldırmak için hafifçe sallayın ve mukus.

3. yalıtım insan endometrium Stromal hücre (HESC)

Not: Bu yalıtım yordamı biyolojik güvenlik Kabin altında steril bir ortamda gerçekleştirilir.

  1. 10 mL içeren bir 50 mL konik Polipropilen santrifüj tüpüne ile sterilize forseps biyopsi aktarım taze HBSS.
  2. Biyopsiyi 500 x g 90 için de oda sıcaklığında santrifüj kapasitesi s.
    1. Hücre Pelet yırtığı yeniden spin eğer biyopsi 90 için 2.000 x g, s.
  3. 1 mL damlalıklı kullanarak medyayı çıkarın ve yıkama ile 37 ° C 10 mL prewarmed HESC yalıtım medya Santrifüjü 500 x g 90 için de ardından s.
  4. 1 mL damlalıklı kullanarak medyayı çıkarın ve şiddetle 3 mL taze HESC yalıtım biyopsi çıkarmak için medya ekleyin.
  5. Biyopsi HESC yalıtım medya 5 mL içeren bir Petri kabına dikkatle boşaltmak.
  6. Yaklaşık 20 dakika #5 forseps ve iyi düz dikiş makas kullanarak mümkün olduğunca küçük parçalar olarak biyopsiyi içine kıyma.
  7. DNaz hazırlamak için önceden ağırlığını DNaz 10 mL HESC yalıtım medya ekleyerek Collagenase enzimler ve ben ben (0,5 mg/mL) ve Collagenase (2.5 mg/mL). Damlalıklı ile karıştırın.
  8. Pipet 1 mL damlalıklı yeni 50 mL konik Polipropilen tüp kullanarak doku örnekleri kesti. HESC yalıtım Media 7 mL ile yıkayın ve tam örnek almaya polipropilen boru ekleyin.
  9. Santrifüj örnek vasıl 800 x g oda sıcaklığında 2 dakika süreyle yavaşça çıkarın süpernatant pipet tarafından.
  10. Ben ve Collagenase çözüm 0.2 µm filtresi ile 10 mL şırınga Pelet üzerine doğrudan bağlı DNaz filtre.
  11. 10 için girdap Pelet resuspend s.
  12. Özet 37 ° C su banyosu 1,5 saat için vortexing için 10 s iyice her 10 kadar doku sindirilmiş min.
  13. Filtre örnek bir 40 µm hücre süzgeç aracılığıyla epitel hücre ve doku enkaz kaldırmak için bir 50 mL konik polipropilen boru yığılmış.
    Not: 50 mL konik polipropilen boru Stromal hücreler vardır.
  14. 50 mL konik polipropilen boru vasıl 800 x g oda sıcaklığında 2.5 dk santrifüj kapasitesi. Yavaşça süpernatant 1 mL pipet ile çıkarın.
  15. Pelet 10 mL HESC yalıtım medya resuspend.
  16. Vasıl 800 x g oda sıcaklığında 2.5 dk santrifüj kapasitesi. Süpernatant Aspire edin ve HESC medya ve pipet ileriye ve geriye doğru karıştırmak için 6 mL hücrelerde resuspend.
  17. Yavaş yavaş katmanda yoğunluk resuspended kalan kan hücreleri katmanları karıştırmak değil dikkatli olmak stromal hücrelerden ayrı hücrelere degrade medya 3 mL.
  18. 400 x g için oda sıcaklığında 30 dk de 15 mL polipropilen boru santrifüj kapasitesi.
  19. 5 mL süpernatant yeni 50 mL polipropilen tüp içinde de toplamak ve hücreleri resuspend için bir ek 5 mL HESC ortam ekleyin.
  20. Vasıl 800 x g süpernatant kaldırılması ve ek 6 mL HESC medya takip oda sıcaklığında 2.5 dk santrifüj kapasitesi. Girdap örnek 10 s ve pipetting tarafından mix için ileriye ve geriye doğru 5 kere.
  21. Yeniden askıya alınan hücrelerin hücre sayısı için 1.5 mL microcentrifuge tüp aliquot 10 µL.
  22. 10 µL %0,4 Trypan mavi leke aliquot hücre ve damlalıklı ile karışımı ekleyin. Aliquot 10 µL yük ve bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak.
  23. Uygun bir şişeye toplam hücre sayısı 15 mL HESC medya bağımlı hücreleri plaka.
    1. Hücre toplam sayısı 1 milyondan az ise, 25 cm balon bulunan bütün hücreler HESC medya ile 6 mL plaka. Hücre toplam sayısı 1 milyondan fazla ise, tüm hücrelerde 75 cm şişesi 15 mL HESC medya ile plaka.
  24. 37 ° C'de kuluçka %5 CO2 en az uygun hücre yapışma sağlamak ve medya HESC medyaya değiştirmek için 6 h hücre kültür.
  25. 3-%5 80-90 confluency kaplama bir balonun içinde elde bir monolayer hücreleri oluşana kadar günlük bir süre için 37 ° C'de % 5 CO2 kuluçka izole HESC kültür.
  26. HESC medya iki günde değiştirin.
    1. Sıcak HESC medya için 15-20 dk 37 ° C su banyosunda.
    2. Şişeye medyadan Aspire edin ve taze HESC medya için balonun ekleyin (çalışma birimi: 8 mL veya 16 mL 25 cm veya 75 cm şişe başına sırasıyla).
    3. % 80-90 confluency elde kadar şişeyi geri % 5 CO2 kuluçka 37 ° C'de yerleştirin.
  27. HESC hale sonra % 80-90 birleşmesi, hücreleri üç 75 cm şişeler için 25-cm 75 cm şişesi için veya bir 75 cm şişesi aktarın.
    Not: HESC donmuş ve gelecekteki deneyler için şu anda daha sonra kullanım için saklanır.

4. dondurma ve çözme HESCs

  1. 75 cm şişeye medyadan Aspire edin ve tripsin-EDTA 2 mL ekleyin.
  2. Hücreleri şişeye çıkarmak kadar 2-3 dk 37 ° C'de % 5 CO2 kuluçka kuluçkaya.
  3. 7 mL ileriye ve geriye doğru HESC medya ve de pipetting tarafından karışımı ekleyin.
  4. Vasıl 800 x g 2.5 dk santrifüj kapasitesi ve süpernatant Aspire edin.
  5. Dondurucu tüpleri hücre kültürünü, tarihini ve geçiş numarası ile etiketleyin.
  6. Hücre Pelet medya dondurma 5 mL içinde yeniden askıya alma.
  7. -80 ° C dondurucu her tüp ve transfer tüpler için yeniden askıya alınmış HESC aliquot 1 mL.
  8. Tüpler için sıvı azot 24 saat içinde aktarın.
    Not: Eğer hücreler yakın gelecekte çözülme planlama, mağaza-80 ° C'de hücreler için bir ay donmuş.
  9. HESCs çözdürme için HESC medya için 20 dk önceden ısıtmak.
  10. Önceden ısıtılmış HESC medya 8 mL 25 cm şişesi için ekleyin.
  11. Dondurucu tüp sıvı azot tankı veya-80 ° C almak ve 37 ° C su banyosu için 1-2 dk hücreleri çözülme tüpte daldırın.
  12. Gecede 37 ° C'de % 5 CO2 kuluçka kuluçkaya ve HESC medya ile 25 cm şişesi çözdürülen HESC transfer
  13. Ertesi gün, HESC ortam değiştirmek ve 2-3 gün HESC konfluent olmak ve 75 cm şişesi aşağıda ayrıntılı olarak açıklandığı gibi iletişim kuralı 5 hücreleri transfer kadar bekleyin.
    1. Sıcak HESC medya için 15-20 dk 37 ° C su banyosunda.
    2. Şişeye medyadan Aspire edin ve taze HESC medya için balonun ekleyin (çalışma birimi: 8 mL veya 16 mL 25 cm veya 75 cm şişe başına sırasıyla).
    3. % 80-90 confluency elde kadar şişeyi geri % 5 CO2 kuluçka 37 ° C'de yerleştirin.

5. insan endometrium Stromal hücre (HESC) kültürü

Not: Bu Culturing yordam biyolojik güvenlik Kabin altında steril bir ortamda gerçekleştirilir.

  1. HESC medya ön bir su banyosu için 20-30 dk içinde 37 ° C'de ısı.
  2. Şişeye medyadan Aspire edin ve % 0.25 tripsin ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) (1 mL 25 cm şişesi veya 75 cm şişesi için 2 mL) ekleyin.
  3. Hücreleri çıkarmak kadar 37 ° C'de kuluçka %5 CO2 2-3 dakika için kuluçkaya.
  4. Kalan hücreleri çıkarmak için şişesi duvarlar hafifçe dokunun. 7 mL ileriye ve geriye doğru HESC medya ve de pipetting tarafından karışımı ekleyin.
  5. Damlalıklı 50 mL konik polipropilen boru ve 2.5 dakika oda sıcaklığında 800 x g, santrifüj içine hücre karışımı.
  6. Süpernatant Aspire edin ve hücre Pelet HESC medyada yeniden askıya alma.
    1. 15 mL 25 cm şişesi veya 75 cm şişesi (15 mL her) için 45 mL ekleyin.
  7. 5 mL veya 15 mL hücre süspansiyon her 25 cm veya 75 cm şişesi için sırasıyla ekleyin.
  8. 3-%5 80-90 confluency kaplama bir balonun içinde elde bir monolayer hücreleri oluşana kadar günlük bir süre için 37 ° C'de % 5 CO2 kuluçka izole HESC kültür.
  9. HESC medya iki günde değiştirin.
    1. Sıcak HESC medya için 15-20 dk 37 ° C su banyosunda.
    2. Şişeye medyadan Aspire edin ve taze HESC medya için balonun ekleyin (çalışma birimi: 8 mL veya 16 mL 25 cm veya 75 cm şişe başına sırasıyla).
    3. % 80-90 confluency elde kadar şişeyi geri % 5 CO2 kuluçka 37 ° C'de yerleştirin.

6. insan endometrium Stromal hücre (HESC) kaplama ve siRNA Transfection

Not: Bu transfection yordam biyolojik güvenlik Kabin altında steril bir ortamda gerçekleştirilir.

  1. 75 cm şişeye ortamdan HESC Aspire edin ve 2 mL % 0.25 tripsin-EDTA çözeltisi ekleyin.
  2. Hücreleri çıkarmak kadar % 5 CO2 kuluçka 37 ° C'de 2-3 dk kuluçkaya.
  3. Hücreleri balonun yerinden sonra HESC Media 7 mL ekleyin ve karışımı yavaşça ileri pipetting ve 5 kez ters.
  4. Damlalıklı 50 mL konik polipropilen boru ve 2.5 dakika oda sıcaklığında 800 x g, santrifüj içine hücre karışımı. Süpernatant Aspire edin ve hücre Pelet 10 mL HESC medya yeniden askıya alma.
    Not: birden fazla şişeye hücrelerden kaplama, sade bir şekilde HESC ortam birimi artırın.
  5. Bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak.
    1. Aliquot 10 µL 1.5 mL microcentrifuge tüp içine yeniden askıya alınan hücre.
    2. 0,4 Trypan mavi hücresine aliquot leke ve geriye doğru ve ileri pipetting tarafından mix % 10 µL ekleyin.
  6. 6-şey plakaları bir kuyu başına plaka 0.8 x 105 hücre. İki gün sonra hücrelerin % 60-70 birleşmesi için en uygun transfection olmalıdır.
  7. Her siRNA transfection örnek için kompleksleri siRNA (60 nanomoles) için transfection reaktif kullanarak hazırlayın.
  8. İndirimli serum ücretsiz medya 150 µL transfection reaktif 5 µL sulandırmak ve 5 min için kuluçkaya.
  9. İndirimli serum ücretsiz medya 100 µL siRNA 60 nanomoles sulandırmak ve 5 min için kuluçkaya.
  10. 5 dakika sonra seyreltilmiş siRNA seyreltilmiş transfection reaktif çözüm ile birleştirmek ve karışımı yavaşça ileri pipetting tarafından ve 5 kez ters.
    Not: bir veya daha fazla siRNA birden çok Wells transfecting, 10 mL ana karışımda polistren tüpler hazırlamanız.
  11. SiRNA-transfection reaktif kompleksleri, oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya.
  12. Bu kuluçka sırasında her şey değişim medya 1 mL ekleyin.
  13. Kuluçka 5 dk sonra 500 x g çözüm toplamak ve siRNA-transfection reaktif kompleksleri 250 µL her şey hücreleri ve medya içeren eklemek 2 min için de tüpler santrifüj kapasitesi.
  14. Yavaşça Rock yaparak mix ve 5 h için % 5 CO2 kuluçka 37 ° C'de hücreler kuluçkaya.
  15. 5 h sonra medya HESC medya için değiştirin.
  16. %5 CO2 kuluçka 37 ° C'de hücreler bir vitro decidualization tahlil için hazırlık 2 gün kuluçkaya.

7. Vitro Decidualization tahlil

Not: Bu tahlil biyolojik güvenlik Kabin altında steril bir ortamda gerçekleştirilir.

  1. Vitro decidualization tedavi Camden ve ark. içinde açıklandığı gibi başlatma öncesinde EPC ortam hazırlamak 3 (1,6 bakın).
  2. HESC transfected hattı 6,16 adımından inkübe post-48 saat medyadan Aspire edin.
  3. EPC medya 2 mL her kuyuya ekleyin.
    Not: bir denetim, bir hücre kümesi EPC medya ile tedavi edilmezse bırakın. Bunun yerine, 2 mL HESC medya denetim wells için ekleyin.
  4. %5 CO2 kuluçka 37 ° C'de hücreler için 6 gün kuluçkaya.
    1. EPC medya 48 saatte değiştirin.
      1. Sıcak ve EPC medya bir 37 ° C su banyosunda 15-20 dk için hazırlamak.
      2. Kuyu medyadan Aspire edin ve taze EPC medya ekleyin.
      3. Plaka %5 CO2 kuluçka 37 ° C'de geri yerleştirin
  5. Altıncı gün sonra stromal hücre decidualization ELISA ve qRT-PCR ile ölçüde (aşağıda açıklandığı gibi) analiz.

8. kantitatif gerçek zamanlı PCR (qRT-PCR) kullanılarak In Vitro Decidualization doğrulama

Not: daha önce Kommagani ve ark10içinde açıklandığı gibi qRT-PCR tamamlanır.

  1. Piyasada bulunan bir RNA izolasyon kiti protokolü kullanan HESC üzerinden toplam RNA yalıtmak.
    1. RNA miktarı ve saflık (bir260/A280) Garcia-Elias ve ark15' te açıklandığı gibi bir NanoDrop veya benzer metodoloji kullanarak analiz.
  2. Piyasada bulunan Ters transkripsiyon kiti protokolü üzerinden toplam RNA'ın 1 µg üzerinden cDNA sentez.
  3. QRT-PCR reaksiyon bir piyasada bulunan qRT-PCR kiti protokolünde açıklandığı gibi çalıştırın.
    1. Piyasada bulunan bir gerçek zamanlı PCR Master Mix kullanarak tepki gerçekleştirmek ve gen belirli probları ile birlikte iç sistem denetimleri (18s, PRLve IGFBP1).

9. ELISA kullanılarak In Vitro Decidualization doğrulama

  1. Piyasada bulunan bir prolaktin ELISA kiti kullanarak doku kültürü ortamdan salgılanan Prolaktin düzeyleri ölçmek.

10. Phalloidin boyama kullanılarak In Vitro Decidualization doğrulaması.

  1. Steril coverslips 12 iyi plaka her kuyunun içine yerleştirin.
  2. 6.1-6,5 olan adımları yineleyin.
  3. 12 iyi plaka kuyu başına plaka 0.8 x 105 hücre.
  4. %5 CO2 kuluçka 37 ° C'de hücreler için 2 gün kuluçkaya.
  5. Medya Aspire edin.
  6. 7.3-7,4 adımları yineleyin.
  7. %4 paraformaldehyde (PFA) hücrelerde fosfat tamponlu tuz (PBS), oda sıcaklığında 30 dk için fix.
  8. Fiksasyon çözüm Aspire edin ve 3 kez PBS 1 mL 5 dakika yıkayın.
  9. % 0.1 iyonik olmayan yüzey aktif Polietilen glikol tert-Oktil fenil eter PBS içinde 5 min için geçirgenlik artırmak için sabit hücrelere ekleme.
  10. 3 kez PBS 1 mL 5 dakika yıkayın.
  11. Phalloidin çözüm coverslip başına 100 µL ekleyin ve 90 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya.
    1. 1: 100 seyreltme PBS içinde 5 µL başına 1 adet içinde bir phalloidin hisse senedi çözüm kullanarak hazırlayın.
  12. 3 kez PBS 1 mL 5 dakika yıkayın.
  13. Slaytları 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole içeren montaj ile orta (DAPI) bağlayın.
  14. Confocal mikroskop kullanarak hücreleri gözlemlemek.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HESC kültür decidualization

Yalıtım, insan endometrium stromal hücreler için monolayer oluşumu ile % 80-90 confluency kültürlü ve vitro decidualization için 10 nM E2, 1 µM MPA ve 50 µM kampı ile tedavisi ile indüklenen (EPC). Vitro decidualization ile ilişkili morfolojik vardiya Şekil 1A' görüntülenir. Decidualization HESCs uzun, fibroblastic hücrelerinden hücre is...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kadın üreme adet döngüsü progesteron seviyeleri luteal faz boyunca böylece ESC decidualization yuvarlak, epitel benzeri salgı hücreleri3,8inducing bir artış ile karakterizedir. Decidualization inisiyasyon bağımlı türüdür. Fareler blastosist varlığı10,11gerektirir, ancak insanlarda decidualization progesteron konsantrasyon, yükselişi kendiliğinden oluşur. Decidualization bu tutarsızlık insan hücre hatların...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu eser ulusal kurumları sağlık (NIH den) finansman tarafından desteklenen / Ulusal Enstitüsü Çocuk Sağlığı ve insan geliştirme (NICHD) hibe (R00 HD080742) ve Washington Üniversitesi Tıp Fakültesi start-up yazar için fon Washington Üniversitesi doğurganlık klinik endometrium biyopsi örnekleri sağlamak için teşekkür etmek istiyorum.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa gerek yok.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Opti-MEM I (1X) Azaltılmış Serum OrtamıGibco31985-070Desidualizasyon ortamı için
DMEM / F12 (1: 1) (1X)Gibco11330-032
Tripan Mavi Leke (% 0.4)Gibco15250-061Hücre sayımı için
PureLink RNA Mini KitiInvitrogen12183018ARNA İzolasyonu / Saflaştırma
için TaqMan 2X Universal PCR Master MixUygulamalı Biyosistemler4304437
Yüksek Kapasiteli cDNA Ters Transkripsiyon KitiUygulamalı Biyosistemler
4319413EqPCR iç kontrolü için
TaqMan Gen Ekspresyon Testi Prolaktin ProbuqPCR iç kontrolü içinUygulamalı Biyosistemler4331182
TaqMan Gen İfadesi qPCR iç kontrolü için IGFBP1 ProbuUygulamalı Biyosistemler4331182
Testi Phalloidin-iFluor 488 Reaktifi - CytoPainterAbcamab176753
İnsan Prolaktin ELISA KitiInvitrogenEHIAPRL
%16 ParaformaldehitAlfa Aesar30525-89-4Fiksatif
Lipofektamin RNAiMAXİnvitrojen13778150Transfeksiyon Reaktifi
InvitrogenP36935ile Altın antifade reaktifi
%0.25 Tripsin-EDTA (1X)Gibco25200-056
Penisilin StreptomisinGibco15140-122
Kömür Soyulmuş Fetal Sığır SerumuSigmaF6765-500ML
Sodyum Bikarbonat (% 7.5)Gibco25080-094
Ficoll-Paque PLUS Reaktifi FisherScientific45001749
Clostridium histolyticum Sigma'dan KollajenazC0130-1G
Sığır pankreasından DeoksiribonükleazI SigmaDN25-100MG
Medroksiprogesteron 17-asetatSigmaM1629-1GEPC Media
EstradiolSigmaiçinEPC Media için E1024-1G
cAMPSigmaA6885-100MGEPC Media için
İnce düz dikiş makasıGüzel Bilim Araçları15396-00
TaqMan Gen Ekspresyon Testi NCOA2 ProbuUygulamalı Biyosistemler4351372
Fetal Sığır Serumu, ısıyla inaktiveedilmiş Gibco10-082-147
Antibiyotik-antimikotikTermo Bilimsel15240062
Hank' s Dengeli Tuz Çözeltisi Corning21-021-cv
50 mL konik polipropilen Falcon tüpCorning352098
Dumont #5/45 ForsepsGüzel Bilim Araçları11251-35
100 x 15 mm Cam Petri kabıVWR75845-546
40 mikron hücre süzgeciMidsci229481
Isotemp 215 Su banyosuFisher ScientificFS-215
LSE Santrifüj Corning6755
İnsan NCOA2 siRNA DharmaconL-020159-00Gene spesifik qPCR probu
Steri-döngüsü i160 CO2 İnkübatörü RNA
NanoDrop 2000Thermo ScientificND-2000
Fosfat Tamponlu Salin Fisher Scientific50146771
75 cm Eğimli Boyun Hücre Kültürü şişesiCorning430641U
6 kuyulu Pirojenik Olmayan Hücre Kültürü PlakasıCorning3506
Pipet Kontrol Cihazı UltraCorning4099
PhotoshopAdobe19.0.1.334
25 cm Eğimli Boyun Hücre Kültürü şişesiCorning7200876
Triton X-100SigmaX100-1L
15 mL konik polipropilen Falcon tüpCorning352099
10 mL ŞırıngaBD302995
1300 Serisi A2 Biyolojik Güvenlik BaşlığıThermo Scientific1377
accuspin Micro17 santrifüjFisher Scientific13100675
7500 Hızlı gerçek zamanlı PCR sistemiUygulamalı Biyosistemler3052632
EVOS FL İmmünofloresan MikroskobuYaşam Teknolojileri01414-155G-291
Leica Ters Işık MikroskobuLeicaDMi1
IllrustratorAdobe22.0.1.253
Excel Elektronik TablolarMicrosoft2016
Deckglaser 18 mm kapak camlarıNeuVitroGG-18
Reichert Parlak Çizgi HematitometreSigmaZ359629-1EA
2-merkaptoetanolFisher BioreagentsBP176-100RNA lizis tamponu için
1.2mL Dış Dişli Polipropilen Kriyojenik FlakonCorning430658HESC hücrelerini dondurmak için 
Ortamı dondurmak içinDimetil Sülfoksit (DMSO)SigmaD2650-100mL
Ökaryotik 18S rRNA Endojen Kontrol Yaşam Teknolojileri 4374967 ProLong DAPI kantitasyonu için Thermo Scientific 51030301

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Maruyama, T., Yoshimura, Y. Molecular and cellular mechanisms for differentiation and regeneration of the uterine endometrium. Endocrine Journal. 55, 795-810 (2008).
  2. Yu, J., et al. Endometrial Stromal Decidualization Responds Reversibly to Hormone Stimulation and Withdrawal. Endocrinology. 157, 2432-2446 (2016).
  3. Ahn, J. I., et al. cAMP-Response Element-Binding 3-Like Protein 1 (CREB3L1) is Required for Decidualization and its Expression is Decreased in Women with Endometriosis. Current Molecular Medicine. 16, 276-287 (2016).
  4. Gellersen, B., Brosens, J. J. Cyclic decidualization of the human endometrium in reproductive health and failure. Endocrine Reviews. 35, 851-905 (2014).
  5. Telgmann, R., Gellersen, B. Marker genes of decidualization: activation of the decidual prolactin gene. Human Reproduction Update. 4, 472-479 (1998).
  6. Camden, A. J., et al. Growth regulation by estrogen in breast cancer 1 (GREB1) is a novel progesterone-responsive gene required for human endometrial stromal decidualization. Molecular Human Reproduction. 23, 646-653 (2017).
  7. Kommagani, R., et al. The Promyelocytic Leukemia Zinc Finger Transcription Factor Is Critical for Human Endometrial Stromal Cell Decidualization. PLoS Genetics. 12, e1005937(2016).
  8. Large, M. J., DeMayo, F. J. The regulation of embryo implantation and endometrial decidualization by progesterone receptor signaling. Molecular and Cellular Endocrinology. 358, 155-165 (2012).
  9. Zhang, X. H., et al. The mesenchymal-epithelial transition during in vitro decidualization. Reproductive Sciences. 20, 354-360 (2013).
  10. Kommagani, R., et al. Acceleration of the glycolytic flux by steroid receptor coactivator-2 is essential for endometrial decidualization. PLoS Genetics. 9, e1003900(2013).
  11. Ramathal, C. Y., Bagchi, I. C., Taylor, R. N., Bagchi, M. K. Endometrial decidualization: of mice and men. Seminars in Reproductive Medicine. 28, 17-26 (2010).
  12. Tamura, I., et al. Novel Function of a Transcription Factor WT1 in Regulating Decidualization in Human Endometrial Stromal Cells and Its Molecular Mechanism. Endocrinology. 158, 3696-3707 (2017).
  13. Vinketova, K., Mourdjeva, M., Oreshkova, T. Human Decidual Stromal Cells as a Component of the Implantation Niche and a Modulator of Maternal Immunity. Journal of Pregnancy. , 8689436(2016).
  14. Wu, D., et al. Chronic endometritis modifies decidualization in human endometrial stromal cells. Reproductive Biology and Endocrinology. 15, 16(2017).
  15. Garcia-Elias, A., et al. Defining quantification methods and optimizing protocols for microarray hybridization of circulating microRNAs. Scientific Reports. 7, 7725(2017).
  16. Brosens, J. J., et al. Human endometrial fibroblasts immortalized by simian virus 40 large T antigen differentiate in response to a decidualization stimulus. Endocrinology. 137, 2225-2231 (1996).
  17. Koukouritaki, S. B., Margioris, A. N., Gravanis, A., Hartig, R., Stournaras, C. Dexamethasone induces rapid actin assembly in human endometrial cells without affecting its synthesis. Journal of Cellular Biochemistry. 65, 492-500 (1997).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Stromal H cre zolasyonusiRNA TransfeksiyonuGen SusturmaHormon TakviyesiYo unluk GradyanKollagenaz SindirimiProlaktin EkspresyonuH cresel skelet Yeniden D zenlenmesi

İlgili makaleler