Yöntem makalesi

Pro-fibrotik sinyal bastırma faktörü-aracılı fare embriyonik fibroblastlar indüklenen Cardiomyocytes yeniden programlama Potentiates

7K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/57687

⸱

3 Haziran 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Cardiology, Department of Medicine, University of Colorado Anschutz Medical Campus, 2Department of Population Health Sciences, Medical College of Georgia, Augusta University

Bu makalede

Özet

Burada birincil embriyonik fibroblastlar içine fonksiyonel cardiomyocytes overexpression GATA4, Hand2, Mef2c, Tbx5, miR-1 ve miR-133, TGF-β sinyal inhibisyon yanında (GHMT2m) aracılığıyla yeniden programlamak için sağlam bir yöntem mevcut. Bizim iletişim kuralı dayak cardiomyocytes 7 gün sonrası iletim % 60 ile olduğu kadar erken oluşturur verimlilik.

Özet

Trans-bir somatik hücre türü başka bir farklılaşma modellemek ve insan hastalıkları tedavi etmek için büyük potansiyele sahiptir. Önceki çalışmalar göstermiştir bu fare embriyonik, dermal ve kardiyak fibroblastlar fonksiyonel indüklenen-cardiomyocyte-benzeri hücreler (ICMS) reprogrammed kardiyojenik transkripsiyon faktörleri de dahil olmak üzere GATA4, Hand2, Mef2c, overexpression ve Tbx5 vitro ve içinde vivo. Ancak, bu önceki çalışmalar nispeten düşük verimlilik göstermiştir. Yaralanma aşağıdaki kalp işlevi geri yüklemek için kalp yeniden programlama yöneten mekanizmaları verimliliği ve olgunlaşma ICMS artırmak için aydınlatılmamıştır gerekir.

Biz daha önce büyük ölçüde pro-fibrotik sinyal inhibisyon programlama verimliliği artar gösterdi. Burada, biz % 60 kadar programlama verimliliğini elde etmek için yöntemleri ayrıntılı olarak. Ayrıca, akış sitometresi, immünfloresan görüntüleme ve kalsiyum görüntüleme programlama verimliliği ve programlanmış fibroblastlar olgunlaşma ölçmek için de dahil olmak üzere çeşitli yöntemler açıklanmaktadır. Burada ayrıntılı iletişim kuralını kullanarak, mekanik çalışmaları kalp yeniden programlama, pozitif ve negatif düzenleyiciler belirlemek için üstlenilen. Bu çalışmalar programlama verimliliği ve olgunlaşma, roman hücre tedavilere insan kalp hastalığı tedavi etmek için neden olabilir tanıtmak için hedef sinyal yolları tespit edebilir.

Giriş

İskemik kalp hastalığı, Amerika Birleşik Devletleri1ölüm önde gelen nedenidir. Yaklaşık 800.000 Amerikalılar bir ilk veya yineleyen miyokard infarktüsü (mı) başına yıl1deneyim. MI, ölüm cardiomyocytes (CMs) ve kardiyak fibrozis, aktif kardiyak fibroblastlar tarafından tevdi zarar kalp fonksiyonu2,3. Kalp yetmezliği MI takip ilerlemesini büyük ölçüde yetişkin CMs4,5zavallı yeniden üretim kapasitesi nedeniyle edilemez. Geçerli klinik Tedaviler hastalığın ilerlemesini yavaşlatmak ve gelecekteki kardiyak olaylar6,7,8,9tehlikesini azaltmak iken, hiçbir Tedaviler hastalığın ilerleme yetersizlik nedeniyle ters CMs sonrası infarktüsü10yeniden. Roman hücre tedavileri MI. Disappointingly takip hastaları tedavi etmek için ortaya çıkıyor, klinik kök hücre MI şu ana kadar takip kalp teslim sonuçsuz rejeneratif potansiyel11,12, göstermiştir 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18.

İnsan kaynaklı indüklenmiş pluripotent kök hücre (hiPSCs) fibroblastlar tarafından overexpression ilk Takahashi & Yamanaka, tarafından gösterilen dört transkripsiyon faktörlerin nesil hücre terapisi19' yeni buluşlar için kapıyı açtı. Bu hücreler tüm üç germ katmanları19ayırt edebilir ve daha önce20,21gösterilen CMs çok sayıda oluşturmak için çeşitli yüksek verimli Yöntemler. CMs (kalça-CMs) HiPSC elde edilen cardiomyogenesis çalışmak için güçlü bir platform sunmaktadır ve yaralanma aşağıdaki kalp onarmak için önemli etkileri olabilir. Ancak, kalça-CMs Şu anda translasyonel Engelli teratoma oluşumu22kaygılar nedeniyle yüz ve olgunlaşmamış doğaları pro-Aritmojenik23olabilir. Fibroblastlar hiPSCs yeniden şekillendirmek için doğrudan fibroblastlar diğer hücre türleri yeniden şekillendirmek için ilgi yol açtı. Ieda ve ark. düşük verimlilik24de olsa bu overexpression GATA4, Mef2c ve Tbx5 (GMT) doğrudan kalp soy, yeniden programlama içinde fibroblastlar sonuçlarında gösterdi. Verimliliği yeniden programlama Hand2 (GHMT)25eklenmesi ile geliştirildi. Beri erken bu çalışmalar, birçok yayın programlama faktörü kokteyl ek transkripsiyon ile değiştirme26,27,28,29faktörler göstermiştir, Kromatin değiştiriciler30,31, mikroRNA32,33veya34 geliştirilmiş yol açan küçük moleküller verimliliği ve/veya indüklenen cardiomyocyte benzeri hücreler (ICMS olgunlaşma yeniden programlama ).

Burada ICMS fare embriyonik fibroblastlar (MEFs) ile yüksek verimlilik oluşturmak için ayrıntılı bir protokol sağlar. Biz daha önce kokteyl GHMT miR-1 ve miR-133 (GHMT2m) eklenmesi ile belirgin bir biçimde iyileştirilmiş ve daha fazla artırıldı pro-fibrotik büyüme faktörü β (TGF-β) sinyal dönüştürme de dahil olmak üzere yolları sinyal veya Rho ilişkili gösterdi Inhibe35protein kinaz (ROCK) sinyal yolları vardır. Bu iletişim kuralını kullanan, biz hücreleri yaklaşık % 60'ı kardiyak Troponin T (cTnT) hızlı, yaklaşık % 50 α-Aktinin hızlı ve dayak hücre sayısının yüksek olduğu gün 11 faktörler ve tedavi yeniden programlama, iletim takip erken görülebilir göstermek TGF-β ile ben reseptör inhibitörü A-83-01 yazın. Ayrıca, bu ICMS gap junction proteinler connexin 43 de dahil olmak üzere hızlı ve kendiliğinden kasılma ve kalsiyum geçişler sergilemek. Bu önceki çalışmalara göre verimliliği yeniden programlama düzelme işaretlenmiş CMs kalp sonrası infarktüsü kalır endojen hücre popülasyonlarının üzerinden yeniden oluşturmak için potansiyel gösteriyor.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm deneylerin hayvanlar gerektiren kurumsal hayvan bakım ve UC Denver Anschutz tıbbi kampüs kullanımı Komitesi tarafından kabul edildi.

1. MEFs yalıtım

  1. C57BL/6 hamile fareler E13, Satın almak. Gecede gemi.
  2. Onaylı IACUC protokolleri göre anne ötenazi (ex: ~1.3 hayvan ölü görünene kadar L/dak CO2 izledi tarafından servikal çıkığı)
  3. Annesi % 70 etanol ile sprey ve karın boşluğu açın. Embriyo içeren rahim boynuz kaldırmak ve steril PBS ile 10 cm çanak yerleştirin.
  4. Bir kesik embriyo embriyo serbest bırakmak için sac içinde olun. Steril PBS ile 10 cm çanak temizlemek için embriyo transferi. İyice durulayın.
  5. Karaciğer aşağıda vücut ve kafa ve üst vücut atın. İç organları çıkarmak ve atın. Biyogüvenlik seviye 1 ya da 2 kabine plaka aktarmak ve kalan doku steril PBS ile temiz 10 cm çanak transfer. Temiz, Kuru 10 cm çanak tüm embriyoların dokulardan birleştirin ve ince parçalar halinde kıyma.
  6. 6 mL % 0.25 tripsin/1 mM EDTA kıyılmış embriyolar için ekleyin. Doku kırmaya pipet tarafından birkaç kez triturate. 40 dk az % 5 CO237 ˚C için kuluçkaya.
  7. Büyüme orta (Tablo 1) hücrelerde resuspend. Medya hacmi hasat embriyo sayısına göre ayarlanır. Genel olarak, yaklaşık 25 mL büyüme medya 1.2 embriyo başına oranında kullanılır.
  8. Plaka 15 cm çanak resuspended hücrelerinin 25 mL. 24 saat sonra medya Aspire edin ve 25 mL taze büyüme ortamının her plaka için ekleyin.
  9. 72 saat sonra 2 mL % 0.25 tripsin/1 mm EDTA her 15 cm çanak ekleyin. Hücre kültür çanak ayırdığınızda, tripsin 15 mL büyüme orta ile devre dışı bırakın ve 50 mL polistren konik tüpler hücrelerde toplamak. Hücreler için 160 x g oda sıcaklığında, 3 dk santrifüj kapasitesi. Hücre Pelet büyüme orta ve filtre 70 µm gözenek hücre süzgeç aracılığıyla resuspend.
  10. Saymak bir hemasitometre kullanarak hücreleri ve 2 milyon hücre aliquots donma orta MEFs dondurmak (% 10 DMSO, %25 FBS içinde Dulbecco'nın modifiye kartal Orta (DMEM) / yüksek glikoz)-80 ° C'de Hücreler için sıvı azot transfer 24 h ve mağaza sonra kullanıma hazır kadar.
    Not: Bu iletişim kuralını kullanan RNA-sıralama tarafından izole MEFs küresel gen ifadesinde profilli (RNA-seq) hücre kimlik doğrulaması sağlamak için. MEF kodlamak hücrelerden RNA-seq veri NIH gen ifade Omnibus (GEO) katılım numarası GSE93454 ile indirilmiş. RNA-seq gen ifadesi verileri için bize tarafından kullanılan MEFs NIH GEO katılım numarası GSE71405 ile tevdi. Bu iki veri kümesi sık kullanılan gen simgeleri göre birleştirildi. İfade veri sonra günlük-dönüştürülmüş ve bizim MEFs ve kodla MEFs için ifade veri scatterplot oluşturulan ve bir doğrusal regresyon çizgisinin (Şekil 1A) ile uygun. Bu iletişim kuralını kullanan izole MEFs tatlı diğer labs tarafından izole benzer.

2. retrovirüsü ve MEFs iletim imalatı

Not: Bir Biyogüvenlik düzeyi 2 dolapta bu bölümdeki tüm adımlar yapılmalıdır. Bu iletişim kuralı retroviral iletim kullanır beri tüm için en az 20 dk. Şekil 1B bakın yeniden programlama için bir zaman çizelgesi için % 10 çamaşır suyu ile viral medya içeren atık tedavi de dahil olmak üzere önlemler alınır o güvenliğini sağlamak.

  1. Platin E (PE) hücre satırı kullanarak retrovirüsü imalatı
    1. Gag- ifade sağlamak için PE Orta (Tablo 1) içeren blasticidin ve puromisindir seçim işaretleri piyasada bulunan PE hücreleri korumak için verimli retroviral parçacık üretim36pol ve env gen . Her iki günde 1:4 ya da 1:5 geçiş hücreleri. Bu retroviral üretim verimleri azaltabilir gibi hücrelerinin aşırı kalabalık önlemek için dikkat ediniz.
    2. Gün -1, transfection önce yaklaşık 10 cm çanak büyüme orta (Tablo 1) 16-20 h başına 5 x 106 hücre tohum ( Tablo 2 yoğunluğu diğer standart hücre kültür çanak boyutları için kaplama için bakınız). Yavaşça ileri geri birkaç kez yemekleri rock ve dikkatle bir 37 ° C, % 5 CO2 kuluçka makinesi bile kaplama dağıtım sağlamak için yer ( Şekil 1 c en uygun kaplama yoğunluk transfection önce için bakınız).
      Not: plaka PE hücreleri Orta seçim işaretlerinin transfection oluşturulan retroviral parçacıkları içeren orta MEFs öldürmek değil emin olmak için önce ücretsiz için dikkat ediniz.
    3. Gün 0, DNA transfection için hazır olun. 10 cm çanak transfection için programlama her faktör 2 µg Ekle — GATA4, Hand2, Mef2c, Tbx5, miR-1 ve miR-133 (GHMT2m) — bir 1,5 mL tüp için.
      Not: diğer standart hücre kültür çanak boyutları transfect için gereken DNA miktarını ölçmektir Tablo 2 için bakın.
    4. Bir ayrı 1,5 mL tüp içinde 360 µL düşük serum medya ekleyin. O zaman 36 µL transfection reaktif doğrudan düşük serum ortamına Ekle. Yavaşça tüp fiske ve 5 min için oda sıcaklığında kuluçkaya.
      Not: azaltılmış transfection verimliliği önlemek için dikkatli bir şekilde transfection reaktif doğrudan düşük serum medya ekleyin.
    5. İndirimli serum medya/transfection reaktif karışımı GHMT2m DNA kokteyl ekleyin. Yavaşça tüp fiske ve 15 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya. Değil girdap yapmak.
    6. Reaksiyon karışımı dropwise PE hücrelere ekleme, yavaşça medya için 10-15 s girdap ve bir 37 ° C, % 5 CO2 kuluçka yerleştirin.
      Not: üreticiye göre ortalama bir titresi 10 PE hücreler üretmek6 -107 bulaşıcı adet/mL. Bu iletişim kuralı yaklaşık 2 x 106 adet enfeksiyondan adet/mL 24 saat ve 6 x 106 adet enfeksiyondan birimleri/mL ortalama 4 MOI 48 h oluşturur. GFP/DsRed transfection, istenirse transfection/iletim verimliliği için bir vekil olarak da kullanılabilir; transfection verimliliği % 90 48 h (Şekil 1 c) aşması bekleniyor.
  2. MEFs iletim
    1. Gün 0, yemekleri kollajen ve yer bir 37 ° C'de % 5 CO2 kuluçka için en az 2 h ile kat.
    2. MEFs sıvı azot ve tezcan çıkarın. 60 mm çanak büyüme orta başına plaka 0.2 x 106 hücre. Yavaşça emin olmak için rock plakaları bile kaplama dağıtım ve yer da kuluçka makinesine ( Şekil 1 c en uygun kaplama yoğunluğu ve Tablo 2 için yoğunluğu diğer standart hücre kültür çanak boyutları için kaplama için bakınız).
      Not: Bu kaplama yoğunlukları izole MEFs birden çok toplu işlem üzerinde test edilmiştir; MEFs görüntü önemli ölçüde canlılık tehlikeye sürece hücre yoğunluğu tohum ayarlama gerekli değildir.
    3. 1 gün, 24 saat sonrası transfection, bir 30 mL şırınga retroviral orta PE hücreleri tarafından oluşturulan toplamak için kullanın. Orta 50 mL konik tüp içine 0,45 µm gözenek boyutu filtreden geçmek. Hexadimethrine bromür transfection reaktif 6 µg/mL nihai bir konsantrasyon için ekleyin. Dikkatle 10 mL taze büyüme orta duvar deplasman hücre önlemek için kültür yemeğin üzerine pipetting medya tarafından PE hücrelere ekleme.
    4. MEFs ortamından Aspire edin ve 4 mL taze hasat retroviral orta her yemek için ekleyin. MEFs Kuluçka Gelişim makinesi için dönmek. Retroviral parçacıklar nötrleştirmek için viral orta temas tüm malzemeler için % 10 çamaşır suyu ekleyin.
    5. Günde 2, 48 saat sonrası transfection, 2.2.2 ve 2.2.3 adımları yineleyin. PE hücreleri retroviral Orta 2nd topluluğu takip atılır.
      Not: atılan PE hücreler için istenmeyen retrovirüsü nötralize etmek en az 20 dk % 10 çamaşır suyu ekleyin.
    6. Gün 3, orta MEFs gelen Aspire edin ve doldurmak 0.5 µM içeren 4 mL ICM ile orta (Tablo 1) A-83-01, TGF-β tip ı reseptör inhibitörü. A-83-01 2 günde içeren ICM orta doldurmak.
      Not: GFP iletim denetimi olarak kullanılıyorsa, ifade % 90'ı aşan bu zaman noktası (Şekil 1 c) tarafından bekleniyor.

3. akış sitometresi kalp işaretleri

  1. Aspiratı orta gün 9 MEFs ve yıkama (1 x) 1 x PBS ile ölü hücreleri ve enkaz kaldırmak için programladım.
  2. 1 mL % 0.25 tripsin/EDTA 5 min için 37 ˚C ekleyin. Hafif bir mikroskop kullanarak hücreleri denetleyin ve çanak sallamak; hücreleri bağlı kalırsa, hücreleri ayırmak kadar 5 daha fazla dk 37 ˚C az kuluçkaya.
  3. 1 x PBS %5 FBS ve filtre 70 µm gözenek hücre süzgeç aracılığıyla içeren hücrelerde yıkayın.
  4. 160 x g 3 dakika oda sıcaklığında ve Pelet aspiratı sıvı, santrifüj kapasitesi.
    Not: hücre verim artışı yaklaşık 50 µL sıvı hücre Pelet yukarıda bırakın.
  5. Hücreleri % 1 BSA içeren 500 µL 1 x PBS ile yıkayın.
  6. 0.2 mL/1 milyon hücrelerle hücreler fiksasyon çözüm 20 dk için buza düzeltmek.
  7. 1 mL 1 x buz gibi perma/yıkama arabellek ekleyin.
    Not: Üreticinin 10 x çözümdür.
  8. Hücreleri, 160 x g 4 ° C'de 5 dakika santrifüj kapasitesi ve süpernatant Aspire edin.
  9. Ek bir süre 3,7 ve 3,8 adımları yineleyin. 2nd yıkama sonra doğrudan bir sonraki adıma geçin veya gecede 4 ° C'de hücreler tutmak.
  10. 100 µL % 5 keçi serum ve eşek serum perma/yıkama arabellek, oda sıcaklığında 30 dakika x 1 ile engelleyin.
  11. Seyreltilmiş birincil antikor 100 µL ekleyin.
    Not: Bu iletişim kuralı için fare ile Troponin T (1: 200) hücreleri etiketli ve kardiyak sarcomere temel bileşenleri için olumlu fare α-yüzdesini ölçmek için Aktinin (1: 200) hücreleri. Oda sıcaklığında 1 h için birincil antikor kuluçkaya.
  12. 160 x g 4 ° C'de 5 m için hücreleri santrifüj kapasitesi, süpernatant Aspire edin ve 2 x buz gibi perma/yıkama arabellek ile yıkayın.
  13. Seyreltilmiş ikincil antikor 100 µL ekleyin.
    Not: Bu iletişim kuralı için anti-fare 647 nm ikincil antikor ile (1: 200) hücreleri etiketli. Üzerinde bir sıra üzerinde tüp rotator oda sıcaklığında 45 dk için ikincil antikor kuluçkaya. Hücreleri ışıktan tüpler folyo sarma tarafından korumak.
  14. Hücreleri, 160 x g 4 ° C'de 5 dakika santrifüj kapasitesi, süpernatant Aspire edin ve 2 x buz gibi perma/yıkama arabellek ile yıkayın.
  15. 1 mL %1 BSA PBS içinde ekleyin ve FACS hemen gerçekleştirin.
    Not: hücrelerin ilk FACS gerçekleştirirken kapı için ileri dağılım vs yan dağılım çizim oluşturur. Alternatif olarak, hücre sabitleme önce piyasada bulunan canlı/ölü hücre leke canlı tanımlamak ve ölü hücre nüfus için kullanın.

4. programlanmış MEFs Immunostaining

  1. Gün 14 aspiratı ortamından MEFs ve yıkama (1 x) ile 1 mL 1 x buz gibi PBS programladım.
    Not: immunostaining için yeniden programlama antikor çözüm birimleri en aza indirmek için 12 iyi levha gerçekleştirildi. 24 iyi tabaklar da kullanılabilir; sadece yarısı tüm birimleri takip.
  2. Aspire hücreleri ile ve 500 µL % 2 paraformaldehyde oda sıcaklığında 10 dakika için düzeltin.
  3. Aspire edin ve hücreleri 3 kez 1 mL 1 x PBS (yıkama, oda sıcaklığında başına 5 dk) ile yıkayın.
  4. Hücreleri 500 µL % 0,2 permeabilization reaktif PBS içinde oda sıcaklığında 15 dakika ile permeabilize.
  5. Aspire edin ve serumda 500 µL % 10 at PBS içinde oda sıcaklığında 30 dk için blok.
  6. Aspire edin ve oda sıcaklığında 1 h için seyreltilmiş birincil antikor 500 µL ile kuluçkaya.
    Not: Bu iletişim kuralı için hücreleri fare Troponin T veya α-Aktinin (her 1: 400) ile etiketli ve ben (1: 400) Co etiketli Connexin 43 (1: 400) ya da Troponin ile.
  7. Birincil antikor Aspire edin ve 1 mL 1 x PBS (yıkama, oda sıcaklığında başına 5 dk) ile üç kez yıkayın.
  8. Aspire edin ve oda sıcaklığında 1 saat 500 µL seyreltilmiş ikincil antikor kuluçkaya.
    Not: Troponin T veya α-Aktinin tanımak için anti-fare 555 nm ikincil antikor (1:800) ve Connexin 43 ya da Troponin ı. Ayrıca tanımak için anti-tavşan 488 nm ikincil antikor (1:800) ile hücreleri bu iletişim kuralı için etiketli, çekirdekleri ile lekeli Höchst (1:10, 000). Hücreleri ışık karanlıkta kuluçka tarafından korumak.
  9. İkincil antikor Aspire edin ve 1 mL 1 x PBS (yıkama, oda sıcaklığında başına 5 dk) ile üç kez yıkayın. Plaka folyo ışıktan hücreleri korumak ve 4 ° C'de depolamak için şal
  10. Üç kanallı epifluorescence mikroskobu kullanarak görüntü.

5. kalsiyum görüntüleme

Not: 10 X büyütme oranında Imaging, standart hücre kültür yemekleri ve plakaları kalsiyum görüntüleme için uygundur. Görüntüleme yüksek büyütmede hücreleri cam coverslips ya da cam alt yemekleri üzerinde kaplama gerekir.

  1. Orta Aspire edin ve 2 mL (6 de plaka için) değişiklik Tyrode'nın çözüm (140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1.8 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM glikoz, 10 mM HEPES, % 0,1 BSA ve % 1 pyruvate, pH 7,4) eklemek 5 mikron içeren AM Fura-2 ve % 0,1 Pluronic (D14 t dayak için F-127 o D20) ICMS. 37 ° C'de 30 dakika kuluçkaya
    Not: hücreleri floresan göstergesi Şoklama önlemek için ışıktan korumak.
  2. Hücreler 2 mL Tyrode'nın çözüm Fura-2 de-esterleşme izin vermek için oda sıcaklığında 30 dakika içinde yıkayın AM.
  3. Disk confocal mikroskobu, 340 iplik ile görüntünün nm ve 380 nm düşsel bilgisayar yazılımı Slidebook 5.5 Ca2 + kullanarak. Oda sıcaklığında görüntüleme gerçekleştirmek.
  4. Kalsiyum geçişler 340 floresan yoğunluğu oranı kullanılarak hesaplanır nm 380 floresans yoğunlukta üzerinde nm.
  5. İstenirse, ICMS 1 veya 2 µM isoproterenol veya 10 µM ile tedavi nifedipin temel kalsiyum geçişler görüntüleme sonra işleme kalsiyum işlemek için. Bileşenleri yerel olarak hücreleri ve görüntü ekleyin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Yukarıda ve Şekil 1Bözetlenen programlama stratejisi kullanarak, biz ICMS yaklaşık p kardiyak Troponin T ifade hücre ve kardiyak α-Aktinin, akış sitometresi gün 9 tarafından sayısal ifade hücreleri yaklaşık % 55'i ile oluşturulan GHMT2m iletim takip (Şekil 2A ve B). Ayrıca, Hızlı hücre çoğunluğu kardiyak Troponin T, Troponin ı ve kardiyak α-Aktinin yanı sıra gün 14 iletim (Şekil 2C v...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu da çalışmanın doğrudan fibroblastlar teslim GHMT2m pro-fibrotik sinyal yolları bastırılması ile kombine faktörlerin yeniden programlama yoluyla fonksiyonel ICMS içine yeniden programlamak için yüksek verimli strateji özetliyor. Kullanarak akış sitometresi, immünfloresan görüntüleme, görüntüleme ve hücre sayımları, bu protokol için hücreleri çoğunluğu gösterdiğimiz yenerek kalsiyum başarılı yeniden programlama gösterip CM lineage kader. Biz daha önce anti-fibrotik ek maddeler ve birleşimler ki TGF-β türü de dahil olmak...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Bu araştırma fonları programdan Boettcher Vakfı'nın Webb Waring Biyomedikal araştırma, Amerikan Kalp Derneği Bilim adamı kalkınma hibe (13SDG17400031), Colorado Üniversitesi Tıp üstün erken kariyer bölümü tarafından desteklenen Akademik Program, University of Colorado bölümü Kardiyoloji Barlow Nyle bağış ve NIH R01HL133230 (KS için). Fibrozis araştırma ve çeviri (CFReT) için A.S.R NIH/NCATS Colorado CTSA Grant numarası TL1TR001081 ve Colorado Üniversitesi Konsorsiyumu bir önceden Doktora Bursu tarafından desteklenmiştir. Bu araştırma da kanser merkezi destek Grant (P30CA046934), cilt hastalıkları araştırma çekirdek Grant (P30AR057212) ve akış sitometresi özünde Colorado Üniversitesi Anschutz tıbbi kampüs tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
C57BL / 6 FarelerCharles River'ın Laboratuvarı027MEF izolasyonu için
Platin E (PE) Hücreleri HücreBiolabs, INCRV-101Retrovirüs üretimi için
DMEM Yüksek GlikozGibcoSH30022. iCM, PE ve Büyüme ortamının FS Bileşeni
Orta 199Yaşam Teknolojileri11150-059iCM ortamının
Fetal Sığır Serumuİkizler100106iCM, PE ve Büyüme ortamının
Donör At Serumuİkizler100508 500iCM ortamının
MEM Esansiyel Amino Asitler, 50XYaşam Teknolojileri11130051iCM Bileşeni medya
Sodyum Piruvat Çözeltisi, 100XLife Technologies11360070iCM ortamının bileşeni ve kalsiyum görüntüleme için
MEM Esansiyel Olmayan Amino Asitler, 100XLife Technologies11140050iCM ortamının bileşeni
MEM Vitamin Çözeltisi, 100XLife Technologies11120-052iCM ortamının
İnsülin-Transferrin-SelenyumGibco41400045iCM ortamının bileşeni
B27Gibco17504-044iCM ortamının bileşeni
Penicilin-StreptomisinGibco15140-122iCM, PE ve Büyüme ortamının
GlutaMAX (L-Glutamin Takviyesi)Gibco35050-061iCM, PE ve Büyüme ortamının
Blasticidin-HClLife TechnologiesA11139-03PE ortamının bileşeni
Puromisin dihidroklorürYaşam TeknolojileriA11138-03PE ortamının bileşeni
%0,25 Tripsin/EDTAGibco25200-056Hücreleri kültür kaplarından ayırmak için
A-83-01R& D Systems - Tocris2939/10TGF-&beta'yı inhibe etmek için hücreleri tedavi edin; sinyalizasyon - yüksek verimli yeniden programlamayı teşvik eder. 0.5 & mikro'da kullanın; M
DMSOThermo Scientific85190A-83-01 ve Donma Ortamı SureCoat
CellutronSC-9035için Tabakları plakaya kaplamak için MEF'ler
FuGENE 6 Transfeksiyon ReaktifiPromegaE2692Transfeksiyon Reaktifi
Opti-MEM Azaltılmış Serum OrtamıGibco11058-021Transfeksiyon Reaktifi
pBabe-X Myc-GATA4Yeniden programlama faktörü içeren Plazmid
pBabe-X Myc-Hand2Yeniden programlama faktörü içeren Plazmid
pBabe-X Myc-Mef2cYeniden programlama faktörü içeren Plazmid
pBabe-X Myc-Tbx5Yeniden programlama faktörü içeren Plazmid
pBabe-X miR-1içeren Plazmid yeniden programlama faktörü
pBabe-X miR-133Yeniden programlama faktörü içeren plazmid
pBabe-X GFPYeniden programlama faktörü içeren plazmid
Polibren (Heksadimetrin bromür)SigmaH9268-5GViral indüksiyon için. 6 & mikro konsantrasyonda kullanın; g / mL
Vakum Filtresi + şişeler (0.22 & mikro; m gözenekler)Nalgene  569-0020 Medyayı filtrelemek için
ŞırıngalarBd Vacutainer Labware 309654Viral filtrasyon
için 0.45 & m FiltrelerCelltreat229749Viral filtrasyon için
70 & m hücreli süzgeçlerFalcon 352350MEF izolasyonu ve Akış Sitometrisi için
Cytofix/Cytoperm SolüsyonuBD554722Akış sitometrisi perma/yıkama tamponu için hücrelerin fiksasyonu ve geçirgenliği için
 BD554723Akış sitometrisi için hücreleri yıkamak için
DPBS 1XGibco14190-250Hücreleri yıkamak için
Sığır Serum AlbüminiVWR0332-100gAkış sitometrisi ve kalsiyum görüntüleme için
KeçiSerumu Sigma G9023Akış Sitometrisi için hücreleri bloke etmek için
Eşek SerumuSigmaD9663-10mgAkış Sitometrisi için hücreleri bloke etmek için
Fare Troponin TThermo Scientificms-295-p1:400 IF, 1:200 Akış Sitometrisi
Fare α-aktininSigmaA7811L1:400 IF, 1:200 Akış Sitometrisi
Tavşan Connexin 43Sigma C62191:400 IF
Tavşan Troponin IFosfoÇözeltiler2010-TNI1:400 IF
HoechstYaşam Teknolojileri622491:10000 IF
Alexa 488, tavşanYaşam TeknolojileriA-110341:800 IF
Alexa 555, fareYaşam TeknolojileriA-214221:800 IF
Alexa 647, fareYaşam TeknolojileriA-315711:200 Akış Sitometrisi
27 renkli ZE5 Akış Sitometresi FACS ParaformaldehitBio-RAD
Triton X-100PromegaH5142için hücrelerin geçirgenliği için
; FL Renkli Görüntüleme SistemiIF
NaClRPIS23020-5000Kalsiyum görüntüleme için
KClVWR395Kalsiyum görüntüleme için
CaCl2< / sub>FisherC614-500Kalsiyum görüntüleme için
MgCl2< / sub>VWR97061-352Kalsiyum görüntüleme için
glikozsigmaG7528-250gKalsiyum görüntüleme için
HEPESsigmaH4034-500gKalsiyum görüntüleme için
Fura-2Life TechnologiesF1221Kalsiyum görüntüleme için
Fluronic F-127SigmaP2443-250gKalsiyum görüntüleme için
NifedipinSigmaN7634-1GiCM'lerde kalsiyum geçişlerini bozmak için - 10 & mikro; M
IsoproterenolsigmaI6504-1giCM'lerde kalsiyum geçici olaylarının sayısını artırmak için - 1-2 & mikro'da kullanın; M
Marianas İplik Diski Konfokal mikroskop3iKalsiyum görüntüleme
etanoliçin Decon Laboratories2801
çamaşır suyuClorox
50 mL konik tüplerGREINER BIO-ONE
15 mL konik tüplerGREINER BIO-ONE
15 cm hücre kültürü kaplarıFalcon
10 cm hücre kültürü kaplarıFalcon353003
60 mm hücre kültürü kaplarıGREINER BIO-ONE628160
6 kuyulu hücre kültürü plakalarıGREINER BIO-ONE657160 
12 kuyulu hücre kültürü plakalarıGREINER BIO-ONE665180 
24 kuyulu hücre kültürü plakalarıGREINER BIO-ONE662160 
bileşeni bileşeni bileşeni bileşeni bileşeni bileşeni bileşeninin seyreltilmesi ve saklanması sigma P6148-500mg için IF için hücreleri sabitlemek için IF EVOS ve ticaret için Thermo Scientific AMEFC4300 227261 188271 353025

Kaynaklar

  1. Benjamin, E. J., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2017 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 136 (20), (2017).
  2. Laflamme, M. A., Murry, C. E. Regenerating the heart. Nat. Biotechnol. 23 (7), 845-856 (2005).
  3. Mercola, M., Ruiz-Lozano, P., Schneider, M. D. Cardiac muscle regeneration: lessons from development. Genes & Development. 25 (4), 299-309 (2011).
  4. Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science. 324 (5923), 98-102 (2009).
  5. Senyo, S. E., et al. Mammalian heart renewal by pre-existing cardiomyocytes. Nature. 493 (7432), 433-436 (2013).
  6. Nabel, E. G., Braunwald, E. A tale of coronary artery disease and myocardial infarction. N Engl J Med. 366 (1), 54-63 (2012).
  7. Packer, M., et al. Effect of carvedilol on the morbidity of patients with severe chronic heart failure: results of the carvedilol prospective randomized cumulative survival (COPERNICUS) study. Circulation. 106 (17), 2194-2199 (2002).
  8. The CAPRICORN Investigators. Effect of carvedilol on outcome after myocardial infarction in patients with left-ventricular dysfunction: the CAPRICORN randomized trial. The Lancet. 357 (9266), 1385-1390 (2001).
  9. Marangou, J., Paul, V. Current attitudes on cardiac devices in heart failure: a review. Clin Ther. 37 (10), 2206-2214 (2015).
  10. Xin, M., Olson, E. N., Bassel-Duby, R. Mending broken hearts: cardiac development as a basis for adult heart regeneration and repair. Nat Rev Mol Cell Bio. 14 (8), 529-541 (2013).
  11. Wollert, K. C., et al. Intracoronary autologous bone-marrow cell transfer after myocardial infarction: the BOOST randomized controlled clinical trial. Lancet. 364 (9429), 141-148 (2004).
  12. Schachinger, V., et al. Intracoronary bone marrow-derived progenitor cells in acute myocardial infarction. N. Engl. J. Med. 355 (12), 1210-1221 (2006).
  13. Huikuri, H. V., et al. Effects of intracoronary injection of mononuclear bone marrow cells on left ventricular function, arrhythmia risk profile, and restenosis after thrombolytic therapy of acute myocardial infarction. Eur. Heart J. 29 (22), 2723-2732 (2008).
  14. Janssens, S., et al. Autologous bone marrow-derived stem-cell transfer in patients with ST-segment elevation myocardial infarction: double-blind, randomised controlled trial. Lancet. 367 (9505), 113-121 (2006).
  15. Lunde, K., et al. Intracoronary injection of mononuclear bone marrow cells in acute myocardial infarction. N. Engl. J. Med. 355 (12), 1199-1209 (2006).
  16. Hirsch, A., et al. Intracoronary infusion of autologous mononuclear bone marrow cells or peripheral mononuclear blood cells after primary percutaneous coronary intervention: rationale and design of the HEBE trial - a prospective, multicenter, randomized trial. Am. Heart J. 152 (3), 434-441 (2006).
  17. Hirsch, A., et al. Intracoronary infusion of mononuclear cells from bone marrow or peripheral blood compared with standard therapy in patients after acute myocardial infarction treated by primary percutaneous coronary intervention: results of the randomized controlled HEBE trial. Eur. Heart J. 32 (14), 1736-1747 (2011).
  18. Karantalis, V., et al. Autologous mesenchymal stem cells produce concordant improvements in regional function, tissue perfusion, and fibrotic burden when administered to patients undergoing coronary artery bypass grafting: The Prospective Randomized Study of Mesenchymal Stem Cell Therapy in Patients Undergoing Cardiac Surgery (PROMETHEUS) trial. Circ Res. 114 (8), 1302-1310 (2014).
  19. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  20. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc Natl Acad Sci. 109 (27), E1848-E1857 (2012).
  21. Loh, K. M., et al. Mapping the Pairwise Choices Leading from Pluripotency to Human Bone, Heart, and Other Mesoderm Cell Types. Cell. 166 (2), 451-467 (2016).
  22. Yoshida, Y., Yamanaka, S. iPS cells: A source of cardiac regeneration. J. Mol. Cell. Cardiol. 50 (2), 327-332 (2011).
  23. Shiba, Y., et al. Allogeneic transplantation of iPS cell-derived cardiomyocytes regenerates primate hearts. Nature. 538, 388-391 (2016).
  24. Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142 (3), 357-386 (2010).
  25. Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485, 599-604 (2012).
  26. Hirai, H., Katoku-Kikyo, N., Keirstead, S. A., Kikyo, N. Accelerated direct reprogramming of fibroblasts into cardiomyocyte-like cells with the MyoD transactivation domain. Cardiovasc Res. 100 (1), 105-113 (2013).
  27. Qian, L., Berry, E. C., Fu, J., Ieda, M., Srivastava, D. Reprogramming of mouse fibroblasts into cardiomyocyte-like cells in vitro. Nat Protoc. 8 (6), 1204-1215 (2013).
  28. Addis, R. C., et al. Optimization of direct fibroblast reprogramming to cardiomyocytes using calcium activity as a functional measure of success. J Mol Cell Cardiol. 60, 97-106 (2013).
  29. Ifkovitz, J. L., Addis, R. C., Epstein, J. A., Gearhart, J. D. Inhibition of TGFβ signaling increases direct conversion of fibroblasts to induced cardiomyocytes. PLoS One. 9 (2), e89678(2014).
  30. Zhou, Y., et al. Bmi1 Is a Key Epigenetic Barrier to Direct Cardiac Reprogramming. Cell Stem Cell. 18 (3), 382-395 (2016).
  31. Christoforou, N., et al. Transcription factors MYOCD, SRF, Mesp1 and SMARCD3 enhance the cardio-inducing effect of GATA4, TBX5, and MEF2C during direct cellular reprogramming. PLoS One. 8 (5), e63577(2013).
  32. Jayawardena, T. M., et al. MicroRNA induced cardiac reprogramming in vivo: evidence for mature cardiac myocytes and improved cardiac function. Circ Res. 116 (3), 418-424 (2015).
  33. Jayawardena, T. M., et al. MicroRNA-mediated in vitro and in vivo direct reprogramming of cardiac fibroblasts to cardiomyocytes. Circ Res. 110 (11), 1465-1473 (2012).
  34. Cao, N., et al. Conversion of human fibroblasts into functional cardiomyocytes by small molecules. Science. 352 (6290), 1216-1220 (2016).
  35. Zhao, Y., et al. High-efficiency reprogramming of fibroblasts into cardiomyocytes requires suppression of pro-fibrotic signalling. Nature Communications. 6, 1-15 (2015).
  36. Morita, S., Kojima, T., Kitamura, T. Plat-E: an efficient and stable system for transient packaging of retroviruses. Gene Therapy. 7, 1063-1066 (2000).
  37. Zhou, H., Dickson, M. E., Kim, M. S., Bassel-Duby, R., Olson, E. N. Akt1/protein kinase B enhances reprogramming of fibroblasts to functional cardiomyocytes. Proc Natl Acad Sci. 112 (38), 11864-11869 (2015).
  38. Zhou, H., et al. ZFN281 enhances cardiac reprogramming by modulating cardiac and inflammatory gene expression. Genes & Dev. 31, 1770-1783 (2017).
  39. Mohamed, T. M., et al. Chemical Enhancement of In Vitro and In Vivo Direct Cardiac Reprogramming. Circulation. 135, 978-995 (2017).
  40. Qian, L., et al. In vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes. Nature. 485, 593-598 (2012).
  41. Mathison, M., et al. In situ reprogramming to transdifferentiate fibroblasts into cardiomyocytes using adenoviral vectors: Implications for clinical myocardial regeneration. J Thorac Cardiovasc Surg. , 329-339 (2017).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Kardiyak Yeniden ProgramlamaAk Sitometrisimm nofloresan G r nt lemeKalsiyum G r nt lemeRetroviral Transd ksiyonTGF Beta nhibisyonuGHMT2M KokteyliGap Junction Olu umu

İlgili makaleler