Periferik koku doku için geliştirme hazırlanıyor moleküler ve immunohistokimyasal Drosophila analizde

Summary

Burada, sahne ve koku doku Drosophila türlerden geliştirme incelemek için bir protokol mevcut. Disseke doku daha sonra kantitatif RT-PCR (Ters transkripsiyon-polimeraz zincir reaksiyonu) veya (RNAseq), sıralama RNA gibi moleküler analizleri için in vivo analizleri immünhistokimya veya in situ gibi yanı sıra kullanılabilir hibridizasyon.

Abstract

Gelişimsel Nörobiyoloji, sistemleri neuroscience, yanı sıra Nörofizyoloji, davranış ve davranışsal evrim Drosophila koku alma sistemi yaygın olarak kullanılan bir sistemdir. Drosophila koku doku uçucu kimyasal cues hidro ve termo duyusal sinir hücreleri ek olarak algılayan koku reseptör nöronlar (ORNs) ev. Bu protokol için yetişkin Drosophila türlerin periferik koku doku geliştirme diseksiyon açıklar. İlk aşama ve Drosophila larva, antennal disk diseksiyon tarafından erken pupa aşamaları, orta-pupa aşamaları ve yetişkin anten diseksiyon tarafından takip ardından yaş nasıl açıklar. Ayrıca nerede hazırlıklar qRT-PCR, RNAseq veya immünhistokimya RNA ayıklama gibi moleküler teknikleri kullanılabilir yöntemleri gösterir. Bu yöntemler aynı zamanda diğer Drosophila türler species-specific pupa geliştirme sürelerinin ve ilgili aşamaları için uygun yaşlanma hesaplanır sonra uygulanabilir.

Introduction

Gelişimsel Nörobiyoloji, sistemleri neuroscience, yanı sıra Nörofizyoloji, davranış çalışmalar ve davranışsal evrim^{1,2,3 Drosophila koku alma sistemi yaygın olarak kullanılan bir sistemdir, 4}. Drosophila koku dokulara ek olarak hidro ve termo duyusal sinir hücreleri^1,5,6uçucu kimyasal ipuçlarını bulmak koku reseptör nöronlar (ORNs) ev. Bu makale genel amacı nasıl sahne ve pupa ve yetişkin koku doku Drosophila türlerin gel....

Protocol

Aşağıdaki iletişim kuralı Duke Üniversitesi Araştırma Etik Komitesi tarafından kurulan etik kuralları ile tutarlıdır.

1. doku hazırlık ve Drosophila melanogaster Pupa gelişimsel evreleme

1. İlk olarak, ne kadar çok sinek diseksiyon için gerekli olacaktır tanımlamak. RT-PCR ve RNAseq için 100-200 antennal diskler ve anten prepupal, 8 h APF, 40 h APF ve yetişkin aşamalarında gerekli olan bireyler toplamak. İmmünhistokimya için 10-20 kişi incelemek.
2. Diseksiyon yastıkları ve forseps, % 70 ile mendil kullanarak da dahil olmak üzere tüm malzemeler temiz alkol. Eğer disseke malzeme RNA çekimi için kullanılan, RNase NÖTRAL....

Results

Disseke gelişmekte olan koku doku RT-PCR tarafından takip RNA çıkarılması için gen ekspresyonu değerlendirmek için kullanılabilir veya onun ifade deseni ve genler alt hücrede yerleşimi belirlemek için immünhistokimya iletişim kuralları üzerinden alınan faiz. Bu bölümde, her iki protokolden temsilcisi sonuçları sunmak. Şekil 1 temsilcisi kantitatif RT-yüzey hücre reseptörü ve koku reseptör Gen transkripsiyonu vahşi-türü yetişkin anten gösterilen PCR var.

Discussion

Bu iletişim kuralı labs Drosophila Drosophila koku doku, hem de karşılaştırmalı analizi, bu programların geliştirilmesinde çalışma genetik ve transkripsiyon programları belirlenmesinde baktılar için yararlı bir kaynaktır bir tür. Gelecekteki çalışmaları için bir astar olarak farklı gelişim aşamalarında sistemleri düzeyi transkripsiyon profillerden gerekirse özellikle yararlıdır. Burada açıklanan protokol sahne ve dört anahtar gelişimin koku alma sistemi üzerinden ön desenlendirme için kullanılmak üzere.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10X Fosfat tamponlu Tuzlu Su	Gibco	70011-044	RNaz içermeyen suda 1X'e seyreltin
CO2 tank	Hava Gazı	CD R200
İki keskin forseps (Dumont #55)	Güzel Bilim Araçları	11255-20
Trizol	Invitrogen	15596-026	RNA izolasyon solüsyonları
Diseksiyon Mikroskobu
Buzlu
P20 ve P200 mikropipetleri ve uçları
1.7 mL Mikrofüj tüpleri			En iyi sonuçlar için nükleaz ücretsiz satın alın
0.2 mL PCR tüpleri
Paraformaldehit tozu	Polysciences	380
%10 Triton X-100	Teknova	T1105	1X PBS 2" petri kaplarında
55 mm filtre kağıdı	Whatman	1001-055	Su ile ıslatın ve pupaları nemli tutmak için bir petri kabına koyun
25 C inkübatörde
deiyonize H2O			Nükleaz içermeyen satın alın veya DEPC
Sylgard 184 Silikon Elastomer Kiti	Dow Corning		ile tedavi edinTerizaki plaka kapaklarından diseksiyon pedleri yapmak için kullanılır.
MicroWell Kapaklı Mini Tepsiler	Nunc	438733	Kapaklar silikon diseksiyon pedleri yapmak için kullanılabilir
Tavşan anti-GFP antikoru	MBL uluslararası corpor	PM005	birincil antikoru
Fare anti RAT CD2	AbD seroTec	MCA154RHDL	birincil antikoru
ADL195 (anti lamin, fare)	Dev çalışmaları hydoma ban	ADL195-s	birincil antikoru
Alexa Flor® 488 keçi anti-tavşan IgG (H + L)	invitrojen	A11008	İkincil antikor
Cy3 keçi anti-fare IgG	Jackson ImmunoResearch	115-166-003	İkincil antikor
Triton X-100, Protein Sınıfı Deterjan,% 10 Çözelti, Steril Filtreli	CALBIOCHEM	648463	deterjan
Lab Döndürücü	Termo bilimsel		Döndürücü Nükleaz
İçermeyen Su	Growcells.com	NUPW-0125	Su
Hafif Hizmet Doku Silecekleri	VWR	82003-822	Diseksiyon malzemelerini temizlemek için
Superscript II	invitrogen	18064014	Ters Transkriptaz
QIAshredder (50)	RNA ekstraksiyonu	QIAGEN	79654
Oligo(dT)12-18 Primer	RT	ömrü teknolojileri	18418012
RNeasy MinElute Temizleme Kiti (50)	RNA ekstraksiyonu	QIAGEN	74204
FASTSTART UNIV SG MASTER (5 ML)(500 RXN)	qPCR	Roche	04913850001
FASTSTART ESSENTIAL GREEN DNA MASTER	qPCR	Roche 06402712001
LIGHTCYCLER 480 - ÇOK KUYULU PLAKA 96	qPCR	Roche	04729692001
NEBNext Yüksek Kaliteli 2X PCR Master Karışımı	qPCR	NEB	M0541S