Method Article

Split yeşil flüoresan Protein sistemi effectors görselleştirmek için bakteri enfeksiyonu sırasında teslim.

DOI:

10.3791/57719

⸱

May 24th, 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Plant Science, Plant Genomics and Breeding Institute, College of Agriculture and Life Science, Seoul National University, 2Department of Bioindustry and Bioresource Engineering, Sejong University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Floresan protein temelli yaklaşımlar konak hücrelere bakteriler tarafından salgılanan effectors izlemek için zor olan. Bu tip III salgı sistemi ve floresan proteinler arasındaki uyumsuzluk kaynaklanmaktadır. Burada, bir en iyi duruma getirilmiş split superfolder GFP sistemi ana bitki hücre bakteriler tarafından salgılanan effectors görselleştirme için kullanılır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bakteri, çeşitli bitki hastalıklarının en önemli etken ajanlarından biri efektör proteinler birtakım bitki bağışıklık sistemi yıkmak için ana bitki hücre salgılar. Enfeksiyon sırasında sitoplazmik effectors ana bilgisayar sitozol bir tip III salgı sistemi (T3SS) ile teslim edilir. Bitki hücre içine doğumdan sonra effector(s) ana hücre işlemleri için hayatta kalma ve çoğaltma patojenin modüle için belirli compartment(s) hedefler. Ortada olmasına rağmen biraz araştırma hücre altı yerelleştirme doğrudan enjekte bakterilerden effectors dinamikleri incelenmesi floresan proteinler, kullanarak patojenitesi içinde onların işlevini anlamak için ana bilgisayar hücrelerdeki efektör proteinlerin üzerinde T3SS ve floresan proteinler arasındaki uyumsuzluk nedeniyle zor oldu.

Burada, konak hücre içinde bakteriyel T3SS üzerinden teslim effectors lokalizasyonu görselleştirmek için en iyi duruma getirilmiş bölünmüş superfolder yeşil flüoresan protein sistemin (sfGFPOPT) bizim son yöntem açıklanmaktadır. SfGFP11 (11inci β-strand sfGFP)-tagged efektör T3SS salgılanan monte belirli organel hedef sfGFP1-10OPT (1-10th β-strand sfGFP) lideri ile floresan emisyon sitesinde için. Bu iletişim kuralı Sulandırılan sfGFP floresan sinyal Pseudomonas syringae Arabidopsis ve Nicotiana benthamiana tesislerinde belirli bir organel içinde bir efektör protein ile görselleştirmek için bir yordam sağlar.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bitkilerin bakteri, mantar, virüs, böcekler ve onların yaşam döngüsü boyunca nematodlar dahil olmak üzere çok sayıda işgal patojenler karşılaşma sesil organizmalardır. Phytopathogens arasında Pseudomonas spp. ve Ralstonia spp., gibi gram-negatif bakteriyel patojenlere bulaştırmak onların ana bitkiler yaralar veya stoma bantlı ve hydathode gibi doğal açıklıklar üzerinden girerek1. Başarılı bir şekilde ev sahibi bitkiler kolonize etmek bakteriyel patojenler virülans faktörleri2çeşitli geliştirmek için evrim geçirmiş. Ana bitki bakteri istila zaman onlar bir dizi virülans protein enjekte — effectors biline....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Not: Aksi belirtilmedikçe oda sıcaklığında tüm adımlar gerçekleştirilir.

1. bitki malzemeleri (4 hafta) hazırlanması

  1. İ. benthamiana bitkiler için hazırlık
    1. İ. benthamiana 2 tohumları üzerinde her pot toprak yüzeyine ekmek, plastik bir kubbe ile tepsi kapsar ve tohumları bir 25 ° C'de % 60 nem oranı büyüme odası 16/8-h açık/koyu photoperiod döngüsü ile çimlenme için olanak sağlar.
    2. İki hafta sonra dışarı almak ve her pot küçük fide atın ve çimlenme adım 1.1.1 için uygulanan bitkiler aynı büyüme koşullar altında büyümeye devam. İki günde 1 litre su tepsisi başına ekleyin.
      Not: Bitkiler büyüme ko....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

GFP β-varil yapısını ve onbir β iplikçikleri oluşur iki parçaları, 1-10th iplikçik (GFP1-10OPT) ve 11inci (GFP11) strand ayrılır. İki parçaları yakın (Şekil 1A) bulunduğunda iki parçaları kendileri tarafından floresan hiçbiri rağmen kendi kendine monte sfGFP floresan yayarlar olabilir. Bu sistemde, sfGFP1-10OPT- Arabidopsis veya i. benthamiana ifade bitkiler öğesini sfGFP11 efektör taşıyan Pseu.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada açıklanan protokol ana bilgisayar bitki hücre üzerine enfeksiyon Bakteriyel T3SS tarafından enjekte efektör proteinlerin doğru yerelleştirme izlenmesi için kullanılır. Daha önce split GFP sistemi bir araç olarak hücre altı yerelleştirme memeli proteinler23,36, Salmonella T3E yerelleştirme ve Agrobacterium VirE2 teslim T4SS ile çalışmak için kullanılan bitki hücreleri37. Bitki hücreleri bu sistemi uygulamak için yap.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar hiçbir ifşa etmek çıkar çatışması var.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu araştırma temel bilim araştırma programı aracılığıyla Ulusal Araştırma Vakfı, Kore (Bilim Bakanlığı, ICT ve etki alanı denetleyicisinin gelecekteki planlama (NMK-2018R1A2A1A05019892) ve () bitki moleküler ıslah merkezi bir hibe tarafından desteklenen NMK) tarafından desteklenmiştir PMBC) EP için Kırsal Kalkınma İdaresi (PJ013201) sonraki nesil Biogreen 21 programı Görüntüleme Merkezi Ulusal araçları merkezi filme confocal mikroskop sağlamak çevre yönetim için teşekkür ediyoruz.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Arabidopsis transgenik çizgileriPark, E., Lee, H.Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, SP Pseudomonas syringae efektörlerinin bölünmüş floresan protein fragmanları kullanılarak tip III sekresyon yoluyla uzay-zamansal izlenmesi. Bitki hücresi. 29 (7), 1571-1584 (2017)
CYTO-sfGFP1-10ABRCCS69831
NU-sfGFP1-10ABRCCS69832
PT-sfGFP1-10ABRCCS69833
MT-sfGFP1-10ABRCCS69834
PX-sfGFP1-10ABRCCS69835
ER-sfGFP1-10ABRCCS69836
GO-sfGFP1-10ABRCCS69837
PM-sfGFP1-10ABRCCS69838
Organel hedefli sfGFP1-10OPT plazmidPark, E., Lee, HY, Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, SP Pseudomonas syringae efektörlerinin bölünmüş floresan protein fragmanları kullanılarak tip III sekresyon yoluyla uzay-zamansal izlenmesi. Bitki hücresi. 29 (7), 1571-1584 (2017)
CYTO-sfGFP1-10Addgene97387
NU-sfGFP1-10Addgene97388
PT-sfGFP1-10Addgene97389
MT-sfGFP1-10Addgene97390
PX-sfGFP1-10Addgene97391
ER-sfGFP1-10Addgene97392
GO-sfGFP1-10Addgene97393
PM-sfGFP1-10Addgene97394
ER-sfCherry1-10Addgene97403
ER-sfYFP1-10Addgene97404
CYTO-sfCFP1-10Addgene97405
<>strongsfGFP11 etiketli T3SS tabanlı efektör dağıtım sistemi için ağ geçidi uyumlu vektörPark, E., Lee, H.Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, SP Pseudomonas syringae efektörlerinin bölünmüş floresan protein fragmanları kullanılarak tip III sekresyon yoluyla uzay-zamansal izlenmesi. Bitki hücresi. 29 (7), 1571-1584 (2017)
pBK-GW-1-2Addgene98250pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Kanamisin (25 ug / ml)
pBK-GW-1-4Addgene98251pAvrRpm1: GW: HA-2xsfGFP11: AvrRpm1t'ye dayanıklı; Kanamisin (25 ug / ml)
pBK-GW-2-2Addgene98252pAvrRpm1: AvrRPM1sp: GW: HA-sfGFP11: AvrRpm1t'ye dayanıklı; Kanamisin (25 ug / ml)
pBK-GW-2-4Addgene98253pAvrRpm1: AvrRPM1sp: GW: HA-2xsfGFP11: AvrRpm1t'ye dayanıklıdır; Kanamisin (25 ug / ml)
pBG-GW-1-2Addgene98254pAvrRpm1: GW: HA-sfGFP11: AvrRpm1t'ye dayanıklı; Gentamisin (25 ug / ml)
pBG-GW-1-4Addgene98255pAvrRpm1: GW: HA-2xsfGFP11: AvrRpm1t'ye dayanıklı; Gentamisin (25 ug / ml)
pBG-GW-2-2Addgene98256pAvrRpm1: AvrRPM1sp: GW: HA-sfGFP11: AvrRpm1t'ye dayanıklı; Gentamisin (25 ug / ml)
pBG-GW-2-4Addgene98257pAvrRpm1: AvrRPM1sp: GW: HA-2xsfGFP11: AvrRpm1t'ye dayanıklı; Gentamisin (25 ug / ml) dirençli
Bakteriyel suşlar< / güçlü >
Agrobacterium tumefaciens < / em >GV3101Csaba Koncz ve Jeff Schell, TL-DNA geni 5'in promotörü, yeni bir Agrobacterium ikili vektör türü tarafından taşınan kimerik genlerin dokuya özgü ekspresyonunu kontrol eder. Mol Gen Genet. 204,383-396 (1986); Gentamisin (50 ug / ml) ve rifampisine (50 ug / ml) dirençli
Pseudomonas syringae< / em> pv. Domates< / em> CUCPB5500efektörler arasında fonksiyonel örtüşmeyi ortaya koymaktadır. PLoS Pathog. 5 (4) (2009).; Rifampisine dayanıklı (100 ug / ml)
< güçlü > Medya bileşenleri< / güçlü >
< güçlü > Bitki çimlenme ortamı< / güçlü >2.165g / L Murashige & Skoog tozu, suya 10 g / L sükroz. PH 5.8'e ayarlayın ve 2.2 g / L fitajel ekleyin. Otomatik buzağı.
Murashige & Vitaminleri içeren Skoog ortamıDuchefa BiochemieM0222° C'de saklayın.
SükrozDuchefa BiochemieS0809
PhytagelSigma-AldrichP8169
LB mediaSuya 10 g/L tripton, 5 g/L maya özütü, 10 g/L NaCl ekleyin. Katı ortamlar için 15 g/L mikro agar ekleyin. Otoklav.  Çözeltinin 55 ° C'ye soğumasına izin verin; C ve gerekirse antibiyotik ekleyin.
TriptonBD Bioscience211705
Maya özüBD Bioscience212750
NaClDuchefa BiochemieS0520
Mikro agarDuchefa BiochemieM1002
King's B media10 g/L proteaz pepton #2, 1.5 g/L susuz K2HPO4, suya 15 g/L agar. Otoklav. 55 ° C'ye kadar soğutun; C ve ortama steril 15 ml / L gliserol, 5 ml / L MgSO4< / sub> ekleyin. Gerekirse antibiyotik ekleyin.
Proteoz peptonBD Biyobilim212120
Susuz K2< / sub>HPO4< / sub>Sigma-Aldrich1551128 USP
GliserolDuchefa BiyokimyaG1345
MgSO4< / sub>Sigma-AldrichM7506
Bacto AgarBD Biyobilim214010
< güçlü > Mannitol-Glutamat (MG) sıvı ortam < / güçlü >suya 10 g / L mannitol, 2 g / L L-glutamik asit, 0.5 g < > < / alt > PO < >< / > G / L NaCl ve 0.2 g / L MgSO4< / sub> ekleyin. pH 7'ye ayarlayın
MannitolDuchefa BiochemieM0803
L-glutamik asitDuchefa BiochemieG0707
KH2< / sub>PO 4< / sub>Sigma-AldrichNIST200B
Sızma tamponu10 mM MES (2- (N-morfolino)-etan sülfonik asit), 10 mM MgCl2, 150 &mikro; M asetosiringon. pH 5.6; Kullanmadan önce yeni bir tampon hazırlayın.
MESDuchefa BiochemieM1503Suda 100 mM (pH 5.6) stok hazırlayın. Filtre sterilize eder.
MgCl2Sigma-AldrichM8266Suda 100 mM stok hazırlayın. Otoklav.
AsetosiringonSigma-AldrichD134406DMSO'da 150 mM stok hazırlayın.
Konfokal mikroskop ekipman/malzemeleri
710 lazer taramalı konfokal sistemCarl Zeiss
Axio gözlemci Z1 ters mikroskopCarl Zeiss
Propidium iyodürThermoFisherP1304MP
Kvitko, BH ve ark. Pseudomonas syringae pv. domates DC3000 tip III sekresyon efektör genleri, 4

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Melotto, M., Underwood, W., He, S. Y. Role of stomata in plant innate immunity and foliar bacterial diseases. Annu Rev Phytopathol. 46, 101-122 (2008).
  2. Melotto, M., Underwood, W., Koczan, J., Nomura, K., He, S. Y. Plant stomata function in innate immunity against bacterial invas....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Split GFP SystemEffector Protein DeliveryType III Secretion SystemConfocal MicroscopyPseudomonas SyringaeArabidopsis ThalianaNicotiana BenthamianasfGFP11 TagOrganelle TargetingFluorescence Reconstitution

Related Articles