Yöntem makalesi

Endojen nöral kök hücre etkinleştirme en az Medulla Spinalis Yaralanmalarında, fare modeli değerlendirmek için bir Neurosphere tahlil

DOI:

10.3791/57727

⸱

13 Eylül 2018

 ,  , 
1Institute of Medical Science, University of Toronto, 2Department of Surgery, University of Toronto, 3Institute of Biomaterials and Biomedical Engineering, University of Toronto

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, biz orta kanal niş konut endojen sinir kök hücreleri (NSCs) yedek bir yetişkin fare en az omurilik yaralanma modelinde performansını göstermek. Neurosphere tahlil harekete geçirmek ve yaralanma takip kesin ve ilkel NSCs geçirilmesi ölçmek için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sinir kök hücreleri (NSCs) Yetişkin memeli spinal kord nispeten mitotically sakin bir nüfus okudu vitro neurosphere tahlil kullanarak olabilir periventriküler hücre vardır. Bu koloni oluşturan tahlil NSCs cevaben bir tabak içinde eksojen faktörleri incelemek için güçlü bir araçtır; Ancak, bu aynı zamanda vivo içinde manipülasyonlar etkisi güçlü doğru anlayış ve tahlil sınırlamaları ile eğitim için kullanılabilir. Klinik ilgi bir manipülasyon yaralanma endojen NSC etkinleştirme üzerinde etkisi olduğunu. Medulla Spinalis Yaralanmalarında güncel modelleri ortak kontüzyonu, sıkıştırma ve transeksiyon modelleri şiddeti neden olarak kök hücre bulunduğu sitesinde yaralanma NSC niş imha bu çalışma için bir meydan okuma sağlar. Burada, Yetişkin fare omurilik alt torasik düzeyi (T7/8) Yüzeysel dorsolateral yüzeyde yerelleştirilmiş hasara neden olur en az yaralanma modeli açıklar. Bu yaralanma modeli yaralanma düzeyde merkezi kanal yedek ve yaralanma takip çeşitli zaman noktalarda lezyon düzeyinde bulunan NSCs analizine izin verir. İşte, nasıl neurosphere tahlil omurilik periventriküler bölge - ilkel ve kesin NSCs ikamet NSCs iki farklı ve lineally ilgili nüfus aktivasyonu çalışma için kullanılması gereken göstermektedir (pNSCs ve dNSCs, sırasıyla). Nasıl saptamak ve bu NSCs yaralanma ve beyaz madde yaralanma site düzeyinde periventriküler bölge kültür göstermektedir. Bizim ameliyat sonrası omurilik diseksiyonlarının artan sayıda pNSC ve dNSC elde edilen neurospheres periventriküler bölge yaralı iplerden denetimleri, onların harekete geçirmek yolu ile yaralanma konuşan göre göster. Ayrıca, yaralanma, dNSC elde edilen neurospheres yaralanma sitesinden ayrılmış olabilir — NSCs onların periventriküler niş yaralanma sitelere geçirme yeteneği gösteren.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Merkezi sinir sistemi kendi kendini yenileyerek, multipotent kök hücrelerin tüm farklı olgun sinir hücre türleri1,2,3,4' e çıkmasına kapasitesine sahip bir subpopulation içerir. Bu sinir kök hücreleri (NSCs) beyin ve omurilik özel niş yer alır ve çoğalırlar, göç ve olgun sinir hücrelerine ayırt etmek için yaralanma takip etkinleştirilebilir. NSCs ve onların Döl kortikal hasar modelleri5,6yaralanma sitedeki geçirilecek gösterilmiştir. Beyinde, NSCs nerede gliyal yara oluşumu7' ye katkıda astrocytes içine ayırt sitesine yaralanma lateral ventrikül geçirilecek gösterilmiştir. Omurilik, ancak, bu aynı endojen NSCs Medulla Spinalis Yaralanmalarında takip kurtarma tanıtmak için harnessed olabilir eğer sormak kaç çalışmalar yapılmıştır. Nitekim, şu anda bir tartışma olup doğrudan fiziksel zarar merkezi kanal8 astar periventriküler niş omurilik kök hücre havuzda aktivasyonu gerektirir veya spinal hasar (kök bırakarak parankimi kordon hücre niş olduğu gibi) endojen NSCs9etkinleştirmek yeterli olur.

Omurilik yaralanma (SCI) modeller bir dizi akut ve kronik yaralanması Patofizyoloji eğitim için kullanılmaktadır. Bu modeller de neuroprotection, immunomodulation ve gelişmekte olan hücre nakli/değiştirme stratejileri10,11,13SCI tedavisinde potansiyel tedaviler test etmek için kullanılmıştır. Geçerli modelleri büyük ölçekli fonksiyonel açıkları yanı sıra geniş lezyonlar ve kavite kordon14,15' te neden sıkıştırma ve/veya kontüzyonu yaralanmaları içerir. Sonuç gliyal izleri genişliği/çevresi omurilik16çoğunluğu ile birlikte birkaç spinal segmentler yayılabilir. Böylece, bu modeller klinik olmakla birlikte, endojen NSCs yaralanma aşağıdaki yanıt eğitimi için önemli sorunlar paraları. Daha hafif formların merkezi kanal17yedek yaralanma neden için uyarlanmış yaralanma kimyasal modellerdir. Ancak, bu tür yaralanma SCI ile ilişkili demiyelinizasyon odaklanmak ve travmatik bilimleri ile ilişkili fiziksel ve/veya mekanik hasar klinik modeli değildir

Geçerli yaralanma modellerin sınırlarını adrese, orijinal fare9, bir yetişkin fare modeli uygulama için gelişmiş bir iğne parça en az SCI modeli, adapte olması. Adapte yaralanma modelimiz tutarlı bir lezyon fare omurilik dorsolateral bölgesinin oluşturabilir ve merkezi canal yaralanma seviyelerine adlı yedek. Bu modelin avantajı bu NSC kinetik çalışma ruhsatı mı yaralanma ve onların potansiyel radyal geçiş yaralanma siteye aşağıdaki. Bir fare modeli kullanımı da soy izleme endojen NSCs ve yaralanma takip onların Döl izin transgenik fareler kullanımına izin verir. NSCs özelliklerini daha da bu protokol için tanıttı vitro neurosphere tahlil değiştirilmiş bir formu kullanarak tespit edilebilir.

Neurosphere tahlil NSCs yalıtım mitogens huzurunda izin veren bir vitro koloni oluşturan tahlil olduğunu. Klonal kaplama yoğunlukları bireysel NSCs NSCs küçük bir subpopulation ve ataları18,19büyük bir çoğunluğu oluşan hücre serbest yüzer küresel sömürgelerine çıkmasına çoğalırlar. Bizim iletişim kuralında, spinal kord periventriküler bölgesinden iki farklı ve lineally ilgili NSCs yalıtım göstermek — temel koşullar altında ve ardından en az SCI modelimiz. Kesin sinir kök hücreleri (dNSCs) hızlı testin ve gliyal fibrillary asidik protein (GFAP'nin) ve epidermal büyüme faktörü (EGF), fibroblast büyüme faktörü (FGF) ve heparin (birlikte olarak adlandırdığı EFH)20huzurunda yetiştirilmektedir. Bu dNSCs için çok az neurospheres vitrosebebiyet veren saf spinal kord nadirdir. Ancak, biz dNSCs en az SCI, periventriküler bölge21kimden izole neurospheres sayıda genişleyen takip etkinleştirilir gösterir. İlkel sinir kök hücreleri (pNSCs) ters yönde nöral kök hücre soy dNSCs. pNSCs pluripotency işaretçiyi Oct4 düşük düzeyde son derece nadir, hızlı ve lösemi inhibitör faktörü (LIF) duyarlı22. pNSCs ne zaman yetişkin fare spinal kord miyelin temel protein (MBP) birincil kültür varlığı nedeniyle gelen izole neurospheres oluşturmaz; Ancak, pNSC neurospheres MBP eksik fareler izole olabilir ve genişletilmiş aşağıdaki yaralanma onların sayılardır — dNSCs21benzer. Son olarak, biz dNSC elde edilen neurospheres erken kez en az bilm takip yaralanma siteden izole olabilir göstermek Bu bulgular bizim yaralanma modeli ve deneyleri periventriküler NSCs yeteneklerini çoğalırlar ve yaralanma yanıt olarak göç gibi etkinleştirme özellikleri değerlendirebilir göstermektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu iletişim kuralı Toronto Üniversitesi, hayvan bakımı Komitesi tarafından kabul edildi ve "Kılavuzu için bakım ve kullanım, deneysel hayvan uygun olarak" (2nd Edition, hayvan bakımı, Kanada Konseyi 2017).

1. en az omurilik yaralanma cerrahi

Not: ameliyat öncesi tüm cerrahi aletler ve malzemeler uygun yöntemlerle (Şekil 1A) sterilize emin olun.

  1. Gazlı bez 4 – 5 karelerinin haddeleme ve onları birlikte gazlı bez sabit bir rulo elde etmek için ortada taping tarafından bir göğüs destek kemer oluşturmak.
  2. İndüksiyon odasında fareyi getirin ve anestezi ile %5 isoflurane işlemini başlatın. Devam etmeden önce yanı sıra prosedürü boyunca ayak çimdik refleks yokluğu onaylayın. Ameliyat-ebilmek almak 30 dk dan fazla tamamlamak için en az isoflurane maruz kalma (%5 5 dk) ve kalan zamanda da % 2-3 en iyi şekilde.
  3. % 2 – 3 isoflurane idame dozu, anestezik makineye bağlı bir burun konisi için fareyi aktarın. Saç kesme makineleri kürk deri ameliyat için geniş dikdörtgen bir alan ortaya çıkarmak için boyun/kulakları çok orta yedeklemek hayvandan patolojisi kaldırmak için kullanın.
  4. Fare burnu bağlı burun konisi yerleştirip kafatası kulak çubuklarla sabitleme stereotaksik bir araç olarak aktarın. Fare stereotaksik aygıtı güvenli bir kez isoflurane % 5 yerleşim kulak çubuklarının ve başa % 2 – 3 alt sırasında korumak.
  5. Ameliyat öncesi analjezik ilaçlar intraperitoneally yönetmek — Meloksikam (2.0 mg/kg). Cömertçe göz yağlama anestezi ne zaman altında kornea kuruma önlemek için açık fare gözleri üzerine uygulayın.
  6. Torasik destek kemer fare karın altında fare vücut ve omurga kuyruk temel alınarak hafifçe çekerek düzleştirme sırasında yerleştirin. Teyp etiketleme laboratuvar kuyruğu ve bir yıldız gibi pozisyon tüm genişletilmiş bacaklarda güvenliğini sağlamak için kullanın. Güvenli bir kez torasik destek kemer rostrally, üst toraks doğru fare karın üzerinden itmek — torasik omurga yukarı (Şekil 1B) desteklemek için.
  7. Steril Cerrahi alan povidone-iyot tarafından takip adım %1,3 70 etanol ile hazırlanan deri kürk Kırpılan alanı dezenfekte tarafından hazırlayın. İki kez tekrarlayın. Bir geniş steril tutmak bir steril cerrahi örtüsü uygulanır.
  8. #10 neşter bıçak kullanmadan, bir dikey kesi torasik omurga eğriliği için paralel hayvanın boyuna ekseni olarak her iki kürek kemikleri orta noktasından olun. Yumuşak doku ve omurga dağılımı (Şekil 1 c) duyurmak cilt geri çek.
  9. Supraskapular yağ yastığı (T4/5 vertebra düzeyi demarcates) alt kenarını tanımlamak. Aynı #10 bıçakla geri-kas tendon sütundan ayırmak için vertebra kemik T5-T8/9 her iki tarafında boyunca dikkatle ama bir güçle, kesin.
  10. Ekartör diş omurganın her iki tarafında kesi siteleri ekleyin. Yeterince omurga retrakte kas tabakaları (Şekil 1 d) üzerinde çok fazla yük koymadan yükseltmesine ekartör genişleterek pozlamayı ayarlayın.
  11. Cerrahi mikroskop altında kalan kas ve diğer yumuşak doku vertebra kemik (Şekil 1E) ortaya çıkarmak için omurga örten dikkatle temizleyin. Vertebra spinöz proses ile dişli forseps clasping ve biraz yukarı hareket ettirerek kaldırılacak ve aşağı omurga tanımlayın.
    Not: Bu kimlik intervertebral eklemlerin izin ve faiz vertebra altında küçük açıklıklar (intervertebral foramina) ortaya çıkarmak.
  12. Maruz intervertebral deliği, eksize için vertebra lamina için kaudal her iki tarafındaki eğri körelmenin makas bir kafa yerleştirin ve çift taraflı bağlantı intervertebral eklem kesti.
  13. Lamina yukarı kaldırın ve lamina yalıtmak ve kemiği kaldırmak için üst eki kesti.
    Not: Bu omurilik (Şekil 1F) içeren sağlam dural kese geçirecek. Aşırı olabilir hangi-ebilmek var olmak güdümlü yanında duvar ilanı kanama 1 cm x 1 cm tül üzerine etkilenen bölgelere precut ve/veya yıkama ile steril PBS.
  14. Bir dönüm noktası hizmet veren dorsal orta hat ven ile orta çizgi her iki tarafında dorsolateral spinal kord (yaklaşık 1 mm derin), yaklaşık 0,5 mm lateral yüzeyine 45 ° bükülmüş şaft (ile iğne eğim yukarı bakacak şekilde) 30 G iğne ucu yerleştirin.
  15. Kablosunu iğneyi eğimi tüm uzunluğu eklenir böylece ~ 2 mm iğne kaudal rostral (paralel) orta hat olarak taşıyın. İğne girişi (Şekil 1G) yolu ile retracing tarafından kaldırın.
    Not: Kanama olmalı ancak spinal dokusunun şişmesi bu adımda görülebilir.
  16. Yarayı kapatmak için Retraktörü kaldırmak ve yaralanma 6-0 absorbe dikiş kullanarak midline birlikte her iki tarafında sırt kasları dikiş. 4-0 steril ipek dikiş örten cilt daha sonra kapatmak için kullanın.
  17. Antibiyotikli bir krem ameliyat sonrası enfeksiyon bir pamuklu çubukla ucu kullanarak önlemek için yüzeysel dikilmiş deri uygulamak. Post-operatif analjezik 0.1 mg/kg buprenorfin subkutan sıvı (1 mL lactated zil'ın çözeltisi) birlikte yönetmek.
  18. İsoflurane Buharlaştırıcı ve oksijen kapatın. Stereotaksik aygıt ve yer yok yatak takımları ile temiz bir kafeste fareyi kaldırın.
  19. İçinde belgili tanımlık kafes yaklaşık 30 cm uzakta a ısı lamba Kurtarma uyanma takip anestezi ve monitör çalışma biçiminden için fareyi getirin. Fare 5-10 dk içinde uyanıyorum ve hind-ekstremite fonksiyonu ile mümkün taraflidir ve/veya kuyruk zayıflık uyanma üzerine.
  20. Önümüzdeki birkaç gün içinde fare davranışı izlemek ve uygun ameliyat sonrası bakım ve analjezikler (yani, püre, lactated zil'ın çözüm sıvı subkutan, 0.1 mg/kg buprenorfin 2 x 2 – 3 gün ve uygun ağırlık kontrolü için subkutan günlük ) uygun olarak yerel hayvan tesisi düzenlemeleri ve bireysel olarak kurtarma olarak değişebilir.

2. Neurosphere tahlil diseksiyon

Not: uygun steril doku kültürü yordamları izleyin.

  1. Enzimatik solüsyona hazırlık
    1. 32 mL, Earle ün dengeli tuz çözüm (EBSS) albümin ovomucoid inhibitörü içeren cam şişe ve yavaşça eriyene kadar girdap ekleyin.
    2. EBSS 5 mL önceden alakart papain cam şişe ekleyin ve çözülmeye 37 ° C su banyosu içinde yer. Çözüm olacak (Çözüm 1) temizleyin.
    3. EBSS 500 µL alıp önceden alakart DNaz konsantrasyonu 1 mg/mL (Çözüm 2) elde etmek için şişe cam ekleyin. Şişeyi ileri geri eğerek hafifçe karıştırın ve bu karışımı 250 µL çözüm 1'e ekleyin.
      Not: tüm çözümleri (Çözüm 1 ve 2) yapılan doku iki adet işlenmesi için yeterlidir. Eğer daha fazla doku parçaları işleme, daha fazla çözüm hazırlık ile karşılamak.
  2. Doku hazırlık ve diseksiyonu
    1. Yer laboratuvar mendil isoflurane fare kafes içine batırılmış ve 2-3 dk buharlar tamamen fare anestezi için izin verir. Aşağıdaki nakavt, fare kafesinden çıkarmak ve bir ayak parmağı-çimdik refleks yokluğu onaylayın.
    2. Metal körelmiş (yani, metal kafes kartı) Hayvan ötenazi yapmak ile servikal çıkığı gerçekleştirin. Sprey cömertçe % 70 etanol ile orta arka için onun boynundan hayvan euthanized.
    3. Kafatası tabanında makas kafasını kesti ve bir biyo torbaya atmak için kullanın. İçinde belgili tanımlık deri kas ve vertebra kemik dağılımı (Şekil 2A) ortaya çıkarmak için geri tüm uzunluğu boyunca bir ensizyon olun.
    4. Her kürek kemiği medial yönünü kaldırın (i.e., kürek kemiği — yağ yastığı örten tarafından tanımlanan) ve uzak (arasında scapulae ve omurga) yumuşak doku kesmek için makas kullanın. Ayrı tamamen temel vertebral sütunun ortaya çıkarmak için.
    5. Omurga eğriliği, makas aynı çifti üst göğüs diyafram yerleştirin ve vertebral sütunun uzakta ekli kaburga, kas ve iç organlarda (Şekil 2B) keserek ayırmak.
    6. Makas kaudal vertebra deliği/ataşını ve lamina (dorsal yüzeyi) her iki tarafında intervertebral eklem kesti. Sağlam kablonun zarar vermemesi için belirli kendine iyi bak. İstenen seviyeye kadar bu işleme devam edin ve/veya kablonun uzunluğunu maruz kalmaktadır.
    7. Dikkatle yanal kordon spinal kord doku içine bir petri düzenli yapay serebrospinal sıvı ile aktarma önce uzanan spinal nerve(s) kesin. Örnek buz (Şekil 2C) üzerinde tutun.
    8. Diseksiyon mikroskop altında ~ 2 mm rostral ve kaudal yaralanma siteye eklemek omurilik doku kes. Forseps iki çift yavaşça kordon boyuna dorsal ve ventral çatlaklar boyunca 2 yarıya içine ayırmak için kullanın (Şekil 2C').
    9. Microscissors ile yaralı dorsolateral beyaz madde kesmek. 15 mL konik tüp içine yerleştirin.
    10. Bir tane tuttuğunu forseps ile omurilik yarısı alay ve beyaz madde istenen periventriküler bölge yalıtmak için spinal kord rostrocaudal ölçüde bir çift daha iyi forseps kullanarak kaldırın. Spinal kord diğer yarısı için yineleyin.
    11. Periventriküler doku parçaları ayrı 15 mL konik tüpler içine yerleştirin. Hafifçe konik tüpler duvara karşı doku kıyma ve microscissors kullanın.
      Not: Doku ayrılma değişiklikler Papain ayrılma sistemi Protokolü23 ve yukarıda açıklanan doku hazırlık işlemleri24vardır.
    12. Yeni çözüm 1 (adım 2.1.3) 2.5 mL için doku örneği ekleyin ve bir rock'çı 30 dk 37 ° C'de yerleştirin.
    13. Yavaşça 1.000 µL pipet ucu ile çözümde doku triturate. 300 x g RT., 5 min için de bulutlu hücre süspansiyon santrifüj kapasitesi
    14. Earle ün dengeli tuz solüsyonu, ovomucoid inhibitörü çözüm (adım 2.1.1) 300 µL 2.7 mL ile çözüm 3 hazırlamak ve 150 µL DNaz, ben çözüm (adım 2.1.3).
    15. Süpernatant adım (adım 2.2.13) iptal et ve önceki adımdaki (adım 2.2.14) çözüm 3 1.5 ml resuspend.
    16. Bu yeni hücre süspansiyon (adım 2.2.15) 5 mL ovoimucoid inhibitörü çözeltisi (adım 2.1.1) kesintili yoğunluğu gradyan oluşturmak için yeni bir 15 mL tüp konik üst katman. Dik, 5 min için 300 x g , santrifüj
    17. Süpernatant atın ve 2 mL neurobasal medya resuspend. 3 dk RT. az için 300 x g , santrifüj
    18. Süpernatant atın ve 1 mL neurobasal medya resuspend. 4 mL 5 mL toplam hacmi için medyanın ardından 20 µm hücre süzgeç kullanarak süspansiyon filtre.
  3. Kaplama
    1. Neurobasal medya ile epidermal büyüme faktörü (20 ng/mL) ilave tarafından neurosphere büyüme için kültür ortamı hazırlamak / fibroblast büyüme faktörü (20 ng/mL) / heparin (2 µg/mL) [için kesin NSCs] veya [için ilkel NSCs] leukemina inhibitör faktörü (10 ng/mL). Her iki medya 10 mL 25 mL doku kültürü şişesi ekleyin.
    2. Bir hemasitometre ve Trypan mavi boya süspansiyon (adım 2.2.18)25hücrelerde sayısını hesaplamak için kullanın. Bir kez hesaplanır, doku kültürü şişeler (adım 2.3.1) hazırlanan hücreleri eklemek klonal yoğunluğunun eklenen hücreleri ile 10 hücre/µL ve yer doku kültürü şişesi içine kuluçka makinesi 24 h (37 ° C, % 95 nem oranı, % 5 CO2) için.
      Not: Sayım tekniği örneği aşağıdaki gibidir: Trypan mavi boya 10 µL ile hücre süspansiyon ve mix al 10 µL. Bu karışımdan 10 µL bir hemasitometre ekleyin. 10 X ışık mikroskobu altında canlı hücreleri sayı ve 4 / 4 x 4 çeyrek dairelerin içinde sayılan tüm hücreleri toplayın. Formülünü kullanın: 100.000/[(X cells/4) x 2 x 10 x 1.000] hücre süspansiyon her 25 mL doku kültürü şişeye klonal yoğunluğu (10 hücre/µL) sağlamak için kaplama hacmi vermek.
    3. 24 h sonra yavaşça şişeye girdap ve içeriği 15 mL konik tüp içine dökün. Dik, 5 min için 300 x g , santrifüj
    4. Süpernatant atın ve 1-2 mL taze neurobasal medya hücrelerde yeniden askıya alma.
    5. 2.3.2 500 µL her onların anılan sıraya göre mitojenle takıma medya (EFH kesin NSC büyüme için) ve ilkel NSC büyüme için LIF içeren bir 24-iyi doku kültürü plaka klonal yoğunluğu, süspansiyon ve plaka hücrelerde hücre sayısını saymak için adımları yineleyin.
      Not: x 2 x 10 x 1.000 adapte formülü (5000 / [hücre/4 X) kullanın) her şey 500 µL medya içeren kaplama için hücre süspansiyon hacmi hesaplamak için.
    6. 7 gün boyunca da kuluçka (37 ° C, % 95 nem oranı, % 5 CO2) büyümeye hücreleri içeren tabak koyun.
  4. Sayma
    1. 7 gün içinde kültür plakaları kaldırmak ve ışık mikroskop altında görüntüleyin. Neurospheres olan küresel kolonileri sayarak ölçmek > dNSCs kültürler için çapı 80 µm ve > 50 µm çapı pNSCs kültürler için.
      Not: arzu edilirse, neurospheres daha fazla pasajlı26 olabilir veya Ayrıştırılan. Hücreleri artık gerekiyorsa, orta renk sarı döner böylece hızlandırılmış hidrojen peroksit wells (yaklaşık 1 mL) 20 dk için ekleyerek atın. Sonra atın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ameliyat, kuyruk ve olası hind-bacak taraflidir için en fazla 24 saat içeren en az motor açıkları fareler deneyim gerekir. Bu saatten sonra fareler hiçbir hind-felç ve/veya taraflidir ve minimal değişiklikler yürüyüş deneyim gerekir.

Şekil 3 5 gün en az Medulla Spinalis Yaralanmalarında temsilcisi neurosphere tahlil sonuçlarını gösterir. DNSC elde edilen neurospheres (EFH içinde yetiştirilen) kesin ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cerrahi işlem sırasında nerede araştırmacı belirli en iyi sonuçları elde etmek ve hayvanlar arasında değişkenlik en aza indirmek için özen birkaç önemli adımlar vardır. Anestezi nöroprotektif etkileri uzun süre maruz27olduğu gösterildiği gibi (isoflurane) inhale anestezi ile ameliyat sırasında özen göstermelidir. Buna göre omurilik yaralanma takip yeniden üretim kapasitesini okurken kadar hızlı ve verimli karıştırıcı değişkenleri önlemek için mümkün olduğunca ameliyat için çaba göster. Aynı isoflu...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu eser (çalışma hibe CMM) Krembil Vakfı tarafından finanse edilmektedir. WX Carlton Marguerite Smith Öğrenci Ödülü alıcı oldu. NL bir Ontario lisansüstü öğrenim bursu aldım.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Agricola EkartörGüzel Bilim Araçları17005-04
Moria Vannas-Wolff Yaylı Makas (Kavisli)İnce Bilim Araçları15370-50Körelmiş uçlar almak için sipariş verirken özelleştirin
Graefe Forseps (Düz, 1 x 2 Diş)Güzel Bilim Araçları11053-10
Ekstra İnce Graefe Forseps (Kavisli, Tırtıklı)Güzel Bilim Araçları11152-10Veya Hartman Hemostats'ı dikmek için başka herhangi bir forseps
(Düz)Güzel Bilim Araçları13002-10Veya
Neşter Sapı #3Güzel Bilim Araçları10003-12Veya başka herhangi bir uygun
Saç kesme makinesiamazon.cahttps://www.amazon.ca/Wahl-Professional-8685-Classic-Clipper/dp/B00011K2BAveya başka herhangi bir uygun
Stereotaksik enstrümanStoeling51500veya başka herhangi bir uygun
Buprenorfinveya hayvan bakım tesisim
Meloxicamtarafından onaylanmış herhangi bir uygun uygun yaptırım uygulanmıştır
.Alconhttps://www.amazon.ca/Alcon-Tear-Gel-Liquid-Eye-Gel/dp/B00HHXGUXEveya başka herhangi bir uygun
IsofluraneBaxter International Inc, DIN 02225875veya anestezi için uygun olan herhangi bir
başka Q-tips, Cottom Swabsamazon.ca
Pamuklu Gazlı BezFisher Scientific13-761-52
30 G İğnelerBecton Dickinson305106Yaralanma İçin
25 G İğnelerBecton Dickinson305122İlaç enjeksiyonları için
İlaç enjeksiyonları için1 mL ŞırıngaBecton Dickinson3090659
3 mL ŞırıngaBecton Dickinson309657sıvı enjeksiyonları için
4-0 Sütüruoftmedstore.com2297-VS881cilt dikişi için
6-0 Sütüruoftmedstore.comVS889dikişi için
Polisporin merhemamazon.ca 102051
İzofluran BuharlaştırıcıVetEquip901806
15 mL konik tüplerThermoFisherHerhangi bir uygun
Petri KabıThermoFisherherhangi bir uygun
Tripan BlueThermoFisherHerhangi bir
HemositometreThermoFisherHerhangi bir uygun
SantrifüjThermoFisherHerhangi bir
uygun Standart Diseksiyon AletiGüzel Bilim Aletleri
Diseksiyon MikroskobuZeissStemi 2000
Sayma MikroskobuOlympusCKX41
Nöral Bazal-A Ortaİnvitrojen10888-022
B27İnvitrojen17404-044
Penisilin- StreptomisinGibco15070
L- GlutaminGibco25030
DMEMİnvitrojen12100046
F12İnvitrojen12700075
% 30 GlikozSigmaG61521 M, 100 mL dH'de 9.01 g dH2< / sub>O
1 M Glikoz
% 7.5 NaHCO3SigmaS5761155 mM, 100 mL dH'de 1,30 g2O
155 mM NaHCO3
1 M HEPESSigmaH3375100 mL dH'de 23,83 g2O
Apo-TransferrinR& D Sistemleri3188-AT
Putrescine SigmaP7505
İnsülinSigmaI5500
SelenyumSigmaS9133
ProgesteronSigmaP6149
Papain Ayrışma Sistemi Worthington Biochemical CorporationPDS1 flakon papain 2 numune için kullanılabilir
Epidermal Büyüme FaktörüInvitrogenPMG8041 Tozu,1 mL Hormon Karışımı ile sulandırılır ve dondurucuda saklanmak üzere 20uL şişelere alikote
Fibroblast Büyüme FaktörüİnvitrojenPHG0226 Tozu,0.5 mL Hormon Karışımı ile yeniden oluşturulur ve 20 & mu'ya aliquoted edilir; Dondurucuda saklanacak L şişeleri
HeparinSigmaH3149
Lösemi İnhibitör FaktörEv İçi
Tripan Mavi
Hemositometre
24 kuyulu PlakalarNUNC
2 M NaClSigmaS5886100 mL dH2O'da 11.69 g
1 M KCLSigmaP5405100 mL dH2O'da 7,46 g
1 M MgCl2SigmaM2393100 mL dH2O
108 mM CaCl2Sigma C7902100 mL dH2O'da 1,59 g
veya hayvan bakım tesisi Tears Naturale P.M. , https://www.amazon.ca/Q-Tips-Cotton-Swabs-500-Count/dp/B003M5UO6U/ref=pd_lpo_vtph_194_bs_tr_img_1/140-7113119-8364127?_encoding=UTF8&psc=1&refRID=JC16N542KVRF2N62N3DS kas edilir,

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Johansson, C. B., et al. Identification of a neural stem cell in the adult mammalian central nervous system. Cell. 96 (1), 25-34 (1999).
  2. McKay, R. Stem cells in the central nervous system. Science. 276 (5309), 66-71 (1997).
  3. Gage, F. H. Mammalian neural stem cells. Science. 287 (5457), 1433-1438 (2000).
  4. Temple, S., Alvarez-Buylla, A. Stem cells in the adult mammalian central nervous system. Current Opinion in Neurology. 9 (1), 135-141 (1999).
  5. Zhang, R., et al. Activated neural stem cells contribute to stroke-induced neurogenesis and neuroblast migration toward the infarct boundary in adult rats. Journal Of Cerebral Blood Flow And Metabolism. 24 (4), 441-448 (2004).
  6. Komitova, M., Mattsson, B., Johansson, B. B., Eriksson, P. S. Enriched environment increases neural stem/progenitor cell proliferation and neurogenesis in the subventricular zone of stroke-lesioned adult rats. Stroke. 36 (6), 1278-1282 (2005).
  7. Faiz, M., et al. Adult neural stem cells from the subventricular zone give rise to reactive astrocytes in the cortex after stroke. Cell Stem Cell. 17 (5), 624-634 (2015).
  8. Ren, Y., et al. Ependymal cell contribution to scar formation after spinal cord injury is minimal, local and dependent on direct ependymal injury. Science Reports - UK. 7, (2017).
  9. Mothe, A. J., Tator, C. H. Proliferation, migration, and differentiation of endogenous ependymal region stem/progenitor cells following minimal spinal cord injury in the adult rat. Neuroscience. 131 (1), 177-187 (2005).
  10. Thuret, S., Moon, L. D., Gage, F. H. Therapeutic interventions after spinal cord injury. Nature Reviews Neuroscience. 7 (8), 628-643 (2006).
  11. Bethea, J. R., et al. Systemically administered interleukin-10 reduces tumor necrosis factor-alpha production and significantly improves functional recovery following traumatic spinal cord injury in rats. Journal of Neurotrauma. 16 (10), 851-863 (1999).
  12. Donnelly, D. J., Popovich, P. G. Inflammation and its role in neuroprotection, axonal regeneration and functional recovery after spinal cord injury. Experimental Neurology. 209 (2), 378-388 (2008).
  13. Cummings, B. J., et al. Human neural stem cells differentiate and promote locomotor recovery in spinal cord-injured mice. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 102 (39), 14069-14074 (2005).
  14. Beattie, M. S., Hermann, G. E., Rogers, R. C., Bresnahan, J. C. Cell death in models of spinal cord injury. Progress in Brain Research. 137, 37-47 (2002).
  15. Metz, G. A., et al. Validation of the weight-drop contusion model in rats: a comparative study of human spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 17 (1), 1-17 (2000).
  16. Faulkner, J. R., et al. Reactive astrocytes protect tissue and preserve function after spinal cord injury. Journal of Neuroscience. 24 (9), 2143-2155 (2004).
  17. Cheriyan, T., et al. Spinal cord injury models: a review. Spinal Cord. 52 (8), 588-595 (2014).
  18. Deleyrolle, L. P., Reynolds, B. A. Isolation, expansion, and differentiation of adult Mammalian neural stem and progenitor cells using the neurosphere assay. Neural Cell Transplantation: Methods and Protocols. , 91-101 (2009).
  19. Singec, I., et al. Defining the actual sensitivity and specificity of the neurosphere assay in stem cell biology. Nature Methods. 3 (10), (2006).
  20. Mignone, J. L., Kukekov, V., Chiang, A. S., Steindler, D., Enikolopov, G. Neural stem and progenitor cells in nestin-GFP transgenic mice. The Journal of Comparative Neurology. 469 (3), 311-324 (2004).
  21. Xu, W., et al. Myelin basic protein regulates primitive and definitive neural stem cell proliferation from the adult spinal cord. Stem Cells. 35 (2), 485-496 (2017).
  22. Sachewsky, N., et al. Primitive neural stem cells in the adult mammalian brain give rise to GFAP-expressing neural stem cells. Stem Cell Reports. 2 (6), 810-824 (2014).
  23. Worthington Biochemical Corporation. Papain Dissociation System. , Available from: http://www.worthington-biochem.com/PDS/default.html (2018).
  24. Mothe, A., Tator, C. H. Isolation of neural stem/progenitor cells from the periventricular region of the adult rat and human spinal cord. Journal of Visualized Experiments. (99), (2015).
  25. Absher, M. Hemocytometer counting. Tissue Culture. , 395-397 (1973).
  26. Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay. Journal of Visualized Experiments. (45), (2010).
  27. Xiong, L., et al. Preconditioning with isoflurane produces dose-dependent neuroprotection via activation of adenosine triphosphate-regulated potassium channels after focal cerebral ischemia in rats. Anesthesia and Analgesia. 96 (1), 233-237 (2003).
  28. Metz, G. A., Merkler, D., Dietz, V., Schwab, M. E., Fouad, K. Efficient testing of motor function in spinal cord injured rats. Brain Research. 883 (2), 165-177 (2000).
  29. Hamers, F. P., Koopmans, G. C., Joosten, E. A. CatWalk-assisted gait analysis in the assessment of spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 23 (3-4), 537-548 (2006).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

N ral K k H crelerPeriventrik ler B lgePrimitif N ral K k H crelerDefinitif N ral K k H crelerDoku DiseksiyonuH cre K lt rCerrahi ModelMerkezi Kanal

İlgili makaleler