Venom toksinlerin Assassin böcek ve diğer Heteropteran böcekler hasat

Heteropteran zehirlerini kuvvetli biyoaktif maddeler¹vardır. Örneğin, kan besleme Heteroptera kissing böcekler (Triatominae) ve yatak hata (Cimicidae) gibi zehir/tükürük salgılarını kolaylaştırır hemostaz²kesintiye tarafından besleme. Bu zehirlerini toksinler koagülasyon, trombosit toplama ve vazokonstriksiyona yanı sıra ağrı da dahil olmak üzere birden çok yolları hedef ve yolları kaşınıyor. Diğer çoğu heteropteran tür zehirlerini kan besleme yerine predasyona kolaylaştırmak için uyarlanmış. Onların zehirlerini felç, ölüm ve omurgasızlar^3,4enjekte edildiğinde doku الرسالة neden. Omurgalılar enjekte edildiğinde onların venom aynı zamanda ciddi etkileri olabilir. Örneğin, omurgalıların içine assassin hata Holotrichius innesi zehir enjeksiyonu, ağrı, kas felci ve kanama neden olur; Fareler envenomated bu hata nedeniyle solunum felci⁵hızlı bir şekilde ölür.

Transcriptomic ve proteomik çalışmalar bazı heteropteran zehirlerini protein bileşimi ortaya çıkardı. Predaceous türlerin zehirlerini proteaz, diğer enzimler, peptidler ve proteinler bilinmeyen yapısı ve işlevi^6,7,8de zengindir. Kissing böcek zehiri üyeleri derinden etkileyen koagülasyon, trombosit toplama ve vazokonstriksiyona^2,9triabin protein ailesinden, zengindir. Ancak, hangi toksinler zehir çoğu bioactivities altında yatan bilinmemektedir. Örneğin, Triatoma infestans öpüşme böcek zehiri analjezik ve sodyum kanalları¹⁰inhibe bildirilmiştir, ama aydınlatılmamıştır için bileşenleri sorumlu kalır. Aynı şekilde, ne bileşenleri assassin böcek zehiri, felç veya ağrı neden bilinmemektedir. Belirli zehir bioactivities ve yapısı ve fonksiyonu romanı zehir toksinlerin karakterize sorumlu toksinler tanımlamak için bir ön koşul zehir almaktır.

Heteropterans elektrostimülasyon^{5,6,7,8,11,12,13}tarafından savunma araçları provokasyon zehir elde edilen yanıt-e doğru^4,8mekanik zehir bezleri^{8,17 dissekan Toraks12,14,15,16, sıkma, ,18,19,20,21,22}ve²³muscarinic asetilkolin reseptör agonistleri uygulanması. Potansiyel avantajları ve dezavantajları, herhangi bir yöntemin yargılamak karmaşık morfolojisi ile iki ayrı lümen, ön ana bezi (AMG) ve posterior ana bezi (PMG), ana bir bezi oluşur heteropteran zehir bezleri tarafından yanı sıra bir Aksesuar bezi (AG) ilişkili. Bu farklı bezi bölmeleri av yakalama, savunma ve ekstra oral sindirim^8,17gibi farklı biyolojik işlevi için özelleştirilmiş farklı protein salgıları üretmek. Peiratine ve ectrichodiine assassin hataları, AMG av yakalama ve ekstra oral sindirim¹⁷ile PMG ile ilişkili olduğu düşünülmektedir. AMG savunma zehir⁸salgılaması için olan ise ancak, içinde harpactorine hata Pristhesancus plagipennis PMG av yakalama ve sindirim için uzmanlaşmıştır. AG assassin hata⁸ ' küçük salgı işleve sahip veya proteaz depolama dev su böcekleri²³yılında büyük bir site olarak tarif edilmiştir. Açıkçası, daha fazla çalışma çeşitli heteropteran alt gruplar arasında her bezi bölmesi işlevini açıklığa kavuşturmak ve en zehir zehirli işlevini belirlemek için gereklidir. Bu raporu heteropterans bu hedefe doğru toksinlerin zehir hasat için protokolleri açıklamak.

Bu iletişim kuralı sorumlu bakım ve hayvanların kullanımı öğretim ve araştırma (PPL 4.20.11) yanı sıra ulusal sağlık ve tıbbi araştırma Konseyi Avustralya şifre için kaygı ve kullanımı içinde yola University in Queenslands İlkesi ile uyumludur. hayvanların bilimsel amaçlar için (8^th Edition 2013).

Dikkat: envenomated assassin hataları işlerken olmaması için dikkat ediniz. Zehir savunma tükürmek türler işlerken gözleri korumak için özen gösterin. Kendine iyi bak boyunca deneysel hayvan incitmek değil. Bu bağlar gibi lastik bantlar üzerinde baskı izleme ve hortum kırık değil sağlanması içerir.

Not: İsteğe bağlı olarak, CO₂ 0,5-2 için maruz hayvanlar uyuşturan min veya içinde zehir hasat öncesi 4-10 ° C'ye soğutma güvenli aktarımı ve kısıtlama kolaylaştırmak için 1-3 amaçlamaktadır. Anestezi kesinlikle gerekli değildir ancak güvenli kısıtlama çevik veya güçlü örneklerin kolaylaştırabilir. Ancak, hayvan zehir hasat izin vermek için uyanık olması gerekir. Aşağı akım uygulamaları proteaz inhibitörleri eklemek olup olmadığını karar verirken göz önünde bulundurun.

1. hasat zehir toksin elektrostimülasyon tarafından

1. Toksinler hasat edilecek canlı örnekleri edinin.
2. Kullanım önceden hazırlanmış plastik cımbız pozitif ve negatif elektrotlar ile her iki ucuna monte. Elektrikli cımbız bir electrostimulator veya gerilim ayarlanmasını sağlar sabit voltaj kaynağı bağlanın.
   1. Küçük (~ 10 mm) ve büyük (~ 25 mm) katil böcekler için en yüksek voltaj 15 ve 25 V sırasıyla kullanın.
   2. Dev su böcekleri gibi daha büyük heteropterans için 40 V kullanın.
3. Canlı hata onlara göğüs üzerinde bir lastik bant kullanarak bir platforma şeritleme dizginlemek.
4. Hortum ucu uygun bir toplama ucu yerleştirin. Assassin hatalar için P200 pipet ipucu kullanın. Dev su böcekleri için kapalı diyafram boyutunu artırmak için P200 bahşiş ekstremite kesti.
   1. Yavaşça hortum temiz cımbız kapalı bir çift ile Asansör ve hortum sonunda üzerinde toplama ucu açık diyafram itin.
   2. İstenirse, hortum toplama içine yerleştirerek önce µL ultrasaf su alımını ~ 5 ipucu. Hasat zehir seyreltilmiş rağmen bu ipucu içinde kalan zehir kayıplarını azaltır.
5. Elektrostimülasyon uygulanır. 2.5 M NaCl/50% gliserol gibi iletken jel uyarıcı elektrotlar daldırma. Elektrotlar Toraks için geçerlidir. Belostomatids için iki elektrot başın arka dorsal yüzeye uygulanır.
6. Autodegradation önlemek için zehir saklayın. Hızlı bir şekilde zehir kalıptan çekilmiş sonra bir tüp-20 ° C veya-60 ° C veya proteaz inhibitörü kokteyl içeren bir tüp aktarın.
7. 1,5 ve 1,6 yeterli zehir kazanılır veya başka hiçbir zehir gelecek kadar yineleyin.

2. zehir toksin tarafından taciz hasat

1. Hayvanlar zehir hasat için hazırlamak ve alt bölümleri 1.1 ve 1.3-1.4 açıklandığı gibi bir koleksiyon giriş hortum ucu yerleştirin.
2. Zehir kendiliğinden kalıptan çekilmiş, 2.3 adıma gidin. Eğer değilse, hayvanların zehiri üretilen kadar yavaşça bu bacaklar, karın ve anten cımbız ile dokunmak tarafından taciz.
3. Hızlı bir şekilde zehir bir tüp-20 ° C-60 ° C veya bir tüp içeren proteaz inhibitörü kokteyl, istenirse aktarın.

3. hasat tarafından taciz "Türler tükürme" Venom zehir toksinlerin

1. Uyuşturan veya kısmen uyuşturan, böcek herhangi bir erken savunma tükürme önlemek için onun muhafaza--dan çıkarmadan önce.
2. Davranış tükürme zehir kışkırtmak. İçeren ve bir standart 90 x 16 mm Petri kabına derin kapağını kullanarak böcek yeniden konumlandırmak. Kapak biraz arka ve 1-4 cm uçuş önlemek için böcek yukarıda tutun. Çoğu böcek birkaç kez, genellikle hızlı bir şekilde tükürmek. Tüm zehir çanak alt toplanan emin olun.
3. Venom 10 µL ultrasaf su ile durulama tarafından Petri kabına alt toplamak. Hızlı bir şekilde bir tüp-20 ° C veya-60 ° C veya proteaz inhibitörü kokteyl içeren bir tüp aktarın.

4. hasat zehir toksin bezi diseksiyon tarafından

1. Hayvanlar kurban. Ağır uyuşturan veya öldürmek kullanarak Hayvanlar > 5 dk pozlama CO₂. Saf CO₂ doğrudan air-deliklere hayvanın konut bariyer boru.
2. Diseksiyon tepsi için PIN böcek. Assassin hatalar için menfez yüzey (4.3) incelemek. Dev su böcekleri için sırt yüzey (4.4) incelemek.
3. Ventral diseksiyon
   1. Üç pimleri böcek zehiri bezleri Delme olmadan basılı posterior karın içine takın.
   2. Kısa bir ensizyon minyatür neşter kullanarak karın ventral yüzeyde kesti. Minyatür makas Ensizyon exoskeleton sadece kesip iç yapıları zarar vermemeye dikkat çekici kafaya anteriorly genişletmek için kullanın.
   3. İç yapıları ortaya çıkarmak için Ensizyon böcek tarafına uzanan birden çok yan kesim yapmak. Sonra her flep iç yapıları ortaya çıkarmak için ventral ezilecektir pin.
   4. Büyük katil böcekler için dört yan kesik, orta Karin, ön karın, birinci ve ikinci bacak arasına ve ilk ayağı önünde olun.
4. Dorsal diseksiyon
   1. Kanatları üssü yakınlarında kaldırın. Üç pimleri böcek zehiri bezleri Delme olmadan basılı posterior karın içine takın.
   2. Bir ensizyon baş minyatür makas ve neşter, exoskeleton sadece kesip iç yapıları zarar vermemeye dikkat çekici kullanarak karın kesme.
   3. Böcek iki yarısını ayrı zorlamak. Yanal iç boşluğu maruz bırakmak böcek uzunluğu boyunca birkaç iğne yerleştirin.
   4. Cımbız kullanarak uçuş kasları kaldırın.
5. Diseksiyon tepsi sel. Hata iç yapıları yukarı yüzer ve olmak izin vermek için batık kadar PBS daha kolayca görselleştirildiği ekleyin.
6. Cımbız ve mikro-makas kullanarak, bağ ve sinir dokusu ve trakea dikkatli bir şekilde çıkarın. Zehir bezleri, yarı saydam yapıları kurbanın kanal her kenarı boyunca uzanan uzamış gibi görünür.
   1. Ana bezi tarafından anterior ve posterior LOB ve iki kanalları hilus toplantı ile karakteristik görünümünü tanımlayın.
   2. İstenirse, Aksesuar bezi kanal üzerinden hilus izini sürerek tanımlayın. Ana bezi hilus yayılan iki boru kesim tarafından ücretsiz.
7. İstenen bezi Lümen hasat. Bezinin bir microcentrifuge için PBS veya PBS 30 µL içeren buza aktarım proteaz inhibitörü kokteyl artı. Temiz keskin iğne ile bezleri lance.
   1. 10 s ve bezi Lümen boşaltmak için santrifüj (1 dk, 5000 × g, 4 ° C) için girdap. Glandüler doku cımbız kullanarak kaldırın.
8. Toksin özü netleştirmek. Santrifüj (5 dk, 17.000 × g, 4° C) süpernatant istinat ve Pelet atarak herhangi bir katı parçacıkları kaldırmak için. -20 ° C veya autoproteolytic yıkımı önlemek için-60 ° C saklayın.

Harpactorine P. plagipennis ve reduviine Platymeris rhadamanthus, bazı heteropteran türlerin büyük miktarlarda (5-20 µL) zehir elektrostimülasyon (Tablo 1) karşılık olarak, güvenilir bir şekilde verim. Genel olarak, çoğu peiratine, reduviine ve harpactorine böcek zehiri yanıt olarak bu yöntem verim. Stenopodaine böcek arasında elektrostimülasyon zehir Oncocephalus sp. ama sp Thodelmus elde edildi. Örnek holoptiline ve emesine hatalar önemli zehir (örneğin yeteri kadar kütle spektrometresi göre analiz için) yanıt olarak elektrostimülasyon vermemiştir. Elektrostimülasyon zehir belostomatid hata ve yırtıcı stinkbugs hasat için kullanılabilir. Ancak, elektrostimülasyon su akrepler (Nepidae) zehir gelen hortum yerine serbest bırakmak-in içeriği yalnızca, Sefalik bezlerinin indüklenen. Başarısızlık elektrostimülasyon bazı türler tarafından zehir hasat için zehir bezleri ve zehir8sürümü denetleme fizyolojik mekanizma morfolojik karmaşıklığı nedeniyle olabilir.

Zehir elektrostimülasyon, P. plagipennis, Havinthus rufovariusreduviids, P. rhadamanthus ve belostomatid Lethocerus distinctifemur, nedeniyle kendiliğinden serbest ek olarak gelen hortum zehir dışarı atmak işleme sırasında. Böyle zehir fırlatma tarafından savunma görüntüler sık sık eşlik ediyor. P. rhadamanthus da tükürür zehir savunma4, yılan24 ve örümcekler25 ama hangi biz herhangi bir diğer reduviid türler farkında değildir, oluşan bir davranış.

SDS-sayfa ve proteomik deneyler hasat elektrostimülasyon ve taciz tarafından zehirlerini protein açısından zengin6,7,8göstermek. Ayrıca zehirlerini inorganik iyonlar ve diğer maddeler içeren büyük olasılıkla olsa proteinler malzeme mevcut büyük bir kısmı için hesap. Assassin böcek zehiri elektrostimülasyon ve taciz tarafından genellikle elde üzerinde bir yüz peptidler ve proteinler (Resim 1, Resim 2) içerir. Belostomatid zehir lysophospholipids13' te zengin olmak daha önce bildirilmiştir. Kızılötesi Absorbans spectra zehir belostomatine su hata Diplonychus eques , protein ve lysophospholipids içeriği ile tutarlıdır. Lethocerine L. distinctifemuriçin sadece protein ve değil lysophospholipids6için kanıt bulundu.

Örümcek zehirlerini26için rapor gibi heteropteran böcekler hasat zehir konsantrasyon ve kompozisyon, kullanılan böcek ve hangi tarafından hasat edilir yöntemi bağlı olarak değişir muhtemeldir. UV spektroskopi seyreltilmiş zehir örnekleri için su katılmamış zehir, ~ 50-250 yüksek protein konsantrasyonu ile tutarlı (10 mm yol uzunluğu) 50-250 itibaren Absorbans değerleri (bir280) öneriyor mg/mL7,12,19. Av yoksunluğu zehir konsantrasyon ve felç olası3 hem de pH27art arda gelen düşüşler art arda gelen artışa neden bildirilmiştir. Ancak, uzun süreli açlık durumu ve ölüm kaybolmasına neden olacaktır. Konsantrasyon yanı sıra, hangi tarafından zehir heteropterans hasat edilir yöntemi kompozisyonunu etkileyebilir. Assassin hata P. plagipennis zehir toksin bileşimi belirgin olup elektrostimülasyon ya da taciz8tarafından bağlı olarak hasat farklıydı. P. plagipennissöz konusu olduğunda, bu taciz AMG içeriğini vermiştir, ancak PMG içeriğini oluşturan elektrostimülasyon nedeniyle olduğu gösterilmiştir. Zehir elektrostimülasyon ama değil taciz, kuvvetli felçli yırtıcı böcekler (şekil 3) elde. Ancak, belli değildir ne ölçüde bu sonucu diğer Reduviidae veya diğer Heteroptera jeneralize.

Venom zehir bezlerinin diseksiyon tarafından doğrudan hasat glandüler doku (venom sigara) proteinler ile kirlenme pahasına atlatılabilirdi için zehir bezlerinin denetimi düzenekleri sağlar. Ne olursa olsun, özleri disseke malzemeden elde bioactivity/toksisite deneyleri için kullanılabilir. Örneğin, özleri PMG, AMG ve P. plagipennisyukarıdaki protokolü kullanılarak hazırlanmış, AG sıvı Kromatografi/tandem kütle spektrometresi8kullanarak analiz edildi. Bu işlem Toplam 182, 114 ve bunların 45, 51 ve 12 ile sözde temizlik proteinleri olarak sınıflandırılmış diğer proteinler amino asit dizisi özelliklerine göre sözde zehir proteinler olarak sınıflandırılmış, Toplam 71 proteinleri tespit. PMG, fakat AMG veya AG, özleri böcekler içine enjeksiyon felç ve ölüm8' sonuçlandı.

Tablo 1: Takson özgüllük zehir heteropterans dan hasat için kullanılan bir yöntem.

Resim 1 : LC-MS/MS analizi 2D SDS-sayfa noktalar ve HPLC kesirler zehir tarafından algılanan proteinler toplanan P. plagipennis elektrostimülasyon (iletişim kuralı 1) tarafından, bol proteaz, yavrusu-etki alanı proteinler ve heteropteran zehir aile 1 proteinler gösterilen. (A)2D SDS-sayfa jel ham protein aileler jel noktalar LC-MS/MS tarafından tanımlanan gösterilen P. plagipennis zehir. (B) HPLC Kromatografik ayırma P. plagipennis zehir, protein aileler tarafından toplanan kesirler LC-MS/MS analizini tespit gösterilen üzerinden. İzni7ile çoğaltılamaz. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Resim 2 : Zehiri her büyük protein sınıfta ait sıraları oranda P. plagipennis. İzni7ile çoğaltılamaz. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 3 : P. plagipennis elektrostimülasyon ama taciz değil, elde edilen zehir böcekler felç ediyor. (A)etkisi elektrostimülasyon taciz ya da su, kriket kaçış tarafından elde edilen zehir enjekte etme. Her zehir koşul için 0.17 µL zehir eşdeğer karın ve bir kalkık petri kabına kapak kaçmak için zaman enjekte ettiler (en fazla 300 s, s, ortalama ± SD) atan oldu. (B) doz-yanıt P. plagipennis elektrostimülasyon tarafından elde edilen zehir tarafından kaçış başarı inhibisyonu için eğri. İzin8ile çoğaltılamaz. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Yazarlar ifşa gerek yok.