Yöntem makalesi

Ökaryotlarda transkripsiyon hataları genom çapında gözetim

DOI:

10.3791/57731

⸱

13 Eylül 2018

 ,  , 
1Center for Mitochondrial and Epigenomic Medicine, Children's Hospital of Philadelphia, 2Department of Cellular and Molecular Biology, University of Pennsylvania, 3Department of Biological Sciences, Mississippi State University, 4Center for Mechanisms of Evolution, Biodesign Institute, Arizona State University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu iletişim kuralı birden çok model organizmalar transkripsiyon kalitesini izlemek için araştırmacılar ile yeni bir araç sağlar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Doğru transkripsiyon genetik bilgi sadık ifade için gereklidir. Rağmen şaşırtıcı derecede az transkripsiyon kalitesini kontrol mekanizmaları hakkında bilinir. Bilimsel bilgi bu boşluğu doldurmak için biz son zamanlarda daire-sıralama tahlil Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogasterve Caenorhabditis transcriptome boyunca transkripsiyon hataları tespit etmek için en iyi duruma getirilmiş elegans. Bu iletişim kuralı böylece transkripsiyon kalitesini kontrol mekanizmaları benzersiz detay aydınlatılmamıştır ökaryotik hücrelerde transkripsiyon hataları peyzaj eşlemek için araştırmacılar ile yeni ve güçlü bir araç sağlar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Genom kesin bir biyolojik plan yaşam sağlar. Bu plan doğru çözümü için büyük bir kesinlikle transkripsiyonu genom önemlidir. Ancak, transkripsiyon hatasız olması pek mümkün değildir. Örneğin, RNA polimeraz hataya vitro1,2olmak uzun bilinmektedir ve son zamanlarda onlar3,5,6yanı sıra hataları vivo içinde işlemek gösterildi, zaman özellikle DNA hasar7,8,9,10ile karşı karşıya. Birlikte ele alındığında, bu gözlemler transkripsiyon hataları sürekli onlar mutasyona uğramış proteinlerin güçlü bir kaynak olabilir düşündüren tüm canlı hücrelerde meydana gösterir.

Transkripsiyon mutagenesis olarak adlandırılan bu işlem iki yolla klasik mutagenesis farklı. İlk olarak, DNA ikileşmesi üzerinde bağımlı oldukları değil gibi genetik mutasyonlar aksine mitotik ve sonrası Mitotik hücre, transkripsiyon hataları etkiler. Transkripsiyon kalitesini etki mekanizmaları eğitim bu nedenle, mitotik ve sonrası Mitotik hücre mutasyon yük içine değerli bilgiler sağlar. İlginçtir, transkripsiyon hataları son zamanlarda protein toplama11,12,13 promosyona karıştığı olmuştur ve her iki karsinojenezis10 ' a katkıda onaylanmadığına karar ve antibiyotik direnci bakteriler14geliştirilmesi.

İkinci olarak, genetik mutasyonlar aksine transkripsiyon doğada geçici hatalardır. Geçici varlıklarını özellikle zor çünkü transkripsiyon hataları tespit etmek son derece zor hale getirir. Birkaç labs değerli muhabir deneyleri transkripsiyon mutagenesis incelenmesi için tasarladılar, örneğin, bu deneyleri sadece sınırlı sayıda bağlamları ve model organizmalar4,15transkripsiyon hataları ölçmek mümkün iken. Bu sınırlamalarını aşmak için birçok araştırmacılar RNA sıralama teknolojisi (RNA-seq) teorik olarak herhangi bir tür transcriptome kaydedilecek transkripsiyon hataları sağlar için döndü. Ancak, bu çalışmalar kolayca Ters transkripsiyon hataları, PCR güçlendirme hataları ve kendisi sıralama hataya doğası gibi Kütüphane İnşaat yapılar tarafından şaşırmış. Örneğin, RNA polimeraz (RNAPs) her 300.000 bazlar5,6yalnızca bir hata yapmak için beklenen süre ters transcriptases her ~ 20.000 bazlar, yaklaşık bir hata işlemek. Hata oranı Ters transkripsiyon yalnız RNA polimeraz hücreleri içinde hata oranı cüceler çünkü geleneksel RNA-Seq veri ( Kütüphane hazırlanmasında neden eserler gerçek transkripsiyon hataları ayırmak neredeyse imkansız olduğunu Şekil 1a).

Bu sorunu çözmek için tahlil5,16daire sıralama (Cirseq veya C-seq bundan sonra) en iyi duruma getirilmiş bir sürümünü geliştirdik. Bu tahlil transkripsiyon hataları ve diğer nadir türevleri RNA transcriptome5algılamak Kullanıcı sağlar. Bu tahlil önemli bir adım RNA daireselleşmesi döner çünkü daire-sıralama tahlil bu adı taşır. RNA hedefler circularized sonra onlar çok sayıda aynı RNA şablonu kopyalarını içeren doğrusal cDNA molekülleri üretmek için bir haddeleme daire moda, transkripsiyonu ters gelir. Bir hata bu şablonlardan biri varsa, bu hata ayrıca cDNA molekül içinde yer alan her tek tekrar mevcut olacaktır. Buna ek olarak, Ters transkripsiyon, PCR güçlendirme veya sıralama tarafından tanıtılan hataları rastgele ortaya çıkan eğilimindedir ve bu nedenle yalnızca bir veya iki tekrarlar içinde mevcut olacaktır. Böylece, her cDNA molekül için bir fikir birliği sıra oluşturma ve rasgele hatalar tüm tekrarlar içinde oluşan hatalar dan ayırt etme, Kütüphane inşaat yapıları etkili gerçek transkripsiyon hataları (Şekil 1b) ayrılabilir.

Uygun bir şekilde kullanıldığında, C-seq tahlil doğru RNA içinde herhangi bir tür transcriptome temel oyuncu değişikliği, eklemeler ve silmeler oranı tespit etmek için kullanılabilir (örneğin, çapraz ve Ochman17bakınız). Örneğin, bir tek temel çözünürlükte5 genom çapında ölçümleri ve transkripsiyon Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogasterve Caenorhabditis elegans hata hızı sağlamak için C-seq tahlil kullandık (yayınlanmamış gözlemler). Başlangıçta doğru RNA virüsü nüfus sıralamak için kullanılan, bu en iyi duruma getirilmiş sürümü, C-seq tahlil Kütüphane inşaat yapıları için katkıda sert koşullarına Kütüphane hazırlık sırasında en aza indirmek için düzenlenmiştir. Buna ek olarak, bir dizi ticari olarak mevcut kitleri kullanarak, tahlil-den geçerek büyük ölçüde, yanı sıra kendi user-friendliness artırıldı. Uygun bir şekilde kullanıldığında, bu tahlil doğru bir şekilde yapar, böylece önemli ölçüde önceki çalışmalar6tarihinde iyileştirilmesi başına transkripsiyon hataları binlerce algılayabilir. Genel olarak, bu yöntem transkripsiyon mutagenesis çalışmak için güçlü bir araç sağlar ve transkripsiyon organizmalar geniş bir alanda kalitesini kontrol mekanizmaları yeni anlayışlar kazanmak kullanıcının izin verir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. hazırlık

  1. RNases omnipresent; Bu nedenle, çalışma alanını iyice o aşağı bir dekontaminasyon reaktif ile püskürtülerek temiz (Örneğin, RNase uzağa) ve % 70 etanol. Sprey herhangi bir Pipetler, kalem veya potansiyel kaynakları RNase kirlenme kaldırmak için tüp rafları aşağı.
  2. Daha fazla örnekler bulaşıcı RNases önlemek için deneme sırasında bir önlük ya da uzun kollu T-shirt giymek. Eldivenleri ve özellikle onları kutusu veya çanta alınırken kullanılacak herhangi bir tüpler içine arasında temasından kaçının.
  3. Önce ters transkripsiyon, eldiven sık sık değiştirin.
    Not: en iyi sonucu almak için önce ters transkripsiyon deney durmaz.

2. hücre ve hayvan kültür ve koleksiyonu

  1. Saccharomyces cerevisiae büyüme ve koleksiyon
    1. C-seq kitaplığa Maya isterseniz, önce S. cerevisiae bir koloni orta içeren maya ekstresi, adenin, pepton ve Dekstroz (YAPD) 3 ml aşılamak ve gecede haddeleme davul 30 ° C'de kuluçkaya.
    2. Sabah, YAPD orta 0,1 bir optik yoğunluğunun (OD) 50 mL kültüründe yeniden aşılamak ve aşırı doz 0.5-0.7 (~ 7 x 106 hücre/mL) ulaşana kadar hücreleri büyümek.
    3. 50 mL konik tüp içinde tüm 50 mL Kültür (yaklaşık 350 x 106 hücreleri) toplamak ve 2100 x gde 3 min için hücreleri aşağı spin. Dikkatle YAPD orta kaldırmak ve Pelet kez 1 x PBS ile yıkayın.
    4. O zaman, Pelet 480 µL lizis arabelleği, 48 µL % 10 SDS ve fenol: kloroform: izoamil alkol (25:24:1), pH 6.8 480 µL'resuspend. Girdap örnek 5 s ve 1,5 mL vidalı kapak için tüp buz gibi zirkon boncuk (kiti ile birlikte) 750 µL ile transfer için maksimum hızda. Adım 3-hücre lizis ve toplam RNA ayıklama için bu protokolü devam edin.
      Not: Tüm adım 2.1.4 için gerekli reaktifler önerilen maya RNA ekstraksiyon kiti temin edilmektedir. Bu reaktifler eşit iş için Maya, solucanlar ve Maya (adım 2.1), solucanlar (adım 2.2) veya sinekler (adım 2.3) koleksiyon sonra Birleşik bir yaklaşım C-seq kitaplıkları (adım 3 – 10) oluşturmak için kullanılabilir böylece uçar.
  2. Caenorhabditis elegans kültür ve koleksiyon
    1. C-seq kitaplığa solucanlar isterseniz, OP50 bakteri ile benekli agar taze bir plaka üzerinde 30 yetişkin solucanlar Kasası.
      Not: Beş tabak 1 çoğaltma için yeterlidir.
    2. Solucanlar 4 gün boyunca kültür ve yavaşça 5 mL M9 medya ile tabak yıkayarak solucanlar toplamak ve solucanlar bir tek 50 mL konik tüp içine Havuzu.
    3. Spin aşağı solucanlar 100 x g bir Pelet oluşturmak 2 min için de. Santrifüj Pelet rahatsız etmek olası en düşük hızda yavaşlatmak.
    4. Yavaşça solucanlar 1,5 mL tüp içine taşımak, M9 medya iki kez 1.5 mL yıkar ve tüp 100 x g bakteri kaldırın ve solucanlar bir temiz 100 µL Pelet üretmek için 1 dakika için de santrifüj kapasitesi.
    5. Solucanlar 480 µL lizis arabelleği, 48 µL % 10 SDS ve 480 µL fenol: kloroform: izoamil alkol resuspend. Girdap örnek 5 s ve 1,5 mL vidalı kapak için buz gibi zirkon boncuk içeren 750 µL tüp transferi için maksimum hızda. Adım 3 Bu protokol solucanlar ve toplam RNA çıkarma lizis için devam edin.
  3. Drosophila melanogaster kültür ve koleksiyon
    1. C-seq kitaplığa sinekler isterseniz, dekstroz veya pekmez tabanlı orta içeren şişeleri sinekli 20 – 25 kültür. Aliquot sinekler üzerinde 3 şişe, ki her şişe yaklaşık 8 sinekler içerir.
    2. Sinekler toplamak için sinekler yatıştırıcı kadar şişe buz kovası koyun. Daha sonra onları bir 1,5 mL tüp fırçası ile toplamak. Sinekler tarafından CO2 tedavi toplamıyoruz.
    3. Oda sıcaklığında (RT) için sıcak sinekler izin ve hızlı bir şekilde 500 µL lizis arabelleği premade bir karışımı, 50 µL % 10 SDS ve fenol: kloroform: izoamil alkol 500 µL tüp ekleyin. Yaklaşık 15 vuruş havaneli tüp sonuna ulaştığında hareket büküm bir firma tarafından eşliğinde, Sinekli öğütmek için bir micropestle kullanın.
    4. Sinekler karışımı dökün ve lizis medya 1,5 mL vidalı kapak içine tüp içeren 750 µL buz gibi zirkon boncuk ve girdap bu maksimum hızda 5 s. devam etmek için adım 3-Bu protokol lizis için sinekler ve toplam RNA çıkarma.

3. Toplam RNA arıtma

Not: Bu noktada, tüm üç protokol yakınsama ve tek, birleştirilmiş bir yaklaşım C-seq kitaplıkları oluşturmak için kullanılabilir.

  1. Sıkı bir şekilde kapağı üstüne vidala ve tüp bir vortexer için adaptör ve yapışkan bant ile ekleyebilirsiniz. Girdap örnekleri koşullar için 10 dakika için maksimum hızda tüp. Sonra 16,100 x g organik çözücüler sulu faz ayırmak 5 min için de örnek santrifüj kapasitesi.
  2. Dikkatli bir şekilde beyaz, bulutlu Interphase bozmadan 400-500 µL sulu faz kaldırın ve bir 15 mL konik Tüp bağlama arabellek 1,9 mL içeren ekleyin. Onları vortexing tarafından iyice karıştırın.
  3. 1,25 mL % 100 etanol ve örnek vortexing tarafından karıştırın. Bir koleksiyon tüp içinde monte bir filtre kartuşu örnek 700 µL aktarmak ve tüm örnek geçirilir kadar kartuşun örneği 14.500 x g ' 30 s. tekrar için spin.
    Not: Bu noktada, biraz opak örnek dönüşebilir. Çok sayıda hücre, solucanlar veya sinekler lysed Eğer precipitates bu görünebilir filtreyi yapışmasına neden.
  4. Filtre yıkama çözüm 1 700 µL ile bir kez ve iki kez 500 µL yıkama çözüm 2 veya 3 ile yıkayın. Yıkama örnekleri 14.500 x g herhangi bir aşırı etanol kaldırmak 2 min için de iplik tarafından bitirmek.
  5. Filtre kartuşu 1,5 mL yunus tüp aktarmak ve 108 µL prewarmed elüsyon çözüm (65 ° C) ekleyin.
    Not: yapıyor yani sitozin transkripsiyon hataları ayırt etmek imkansız urasil deaminasyon olaylara tahrik edecek gibi asla RNA örnekleri Ters transkripsiyon önce 65 ° C daha yüksek sıcaklıklara maruz bırakmayın.
  6. İzole RNA DNA kirlenme bozulmasına yol açar (bkz: adımlar 2,1-3,4) 10 x ben tampon DNaz, 2 µL RNase inhibitörü ve DNaz 4 µL 11 µL ekleyerek ı (8 U) ve onları 30 dk 37 ° C'de kuluçkaya.
  7. Sindirim sonra 11 µL DNaz inactivation reaktif ekleyin. Girdap karışımı ve RT 5 min için oturmak izin. O zaman, 15.000 x g inactivation reaktif cips ve Pelet bozmadan süpernatant ile 110 µL toplamak için 3 dakika için de örnek santrifüj kapasitesi. Süpernatant 1,5 mL tüp aktarın.
    Not: DNaz inactivation reaktif düzgün damlalıklı için oldukça zor, bu yüzden pipet ucu pipetting her işlemin ardından bakarak kontrol edin. İnactivation reaktif damlalıklı için çok viskoz hale gelirse, 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) 1/5 kalan hacim olarak eşit ekleyin.
  8. (Kalite kontrol) Bir spektrofotometre kullanarak toplam RNA konsantrasyonu ölçmek. O zaman 1 µL toplam RNA'ın bir kenara ve 10 ng/µL nükleaz ücretsiz (NF) suda bir konsantrasyon oranında seyreltin. RNA uygun nükleotit analiz enstrüman RNA değil bozulmuş ve bir eRIN değeri en az 8,5 veya daha yüksek (Şekil 2B) olduğundan emin olun bir yüksek hassasiyet RNA bant ile çalıştırın.

4. mRNA zenginleştirme

  1. Bir mRNA miniprep ile mRNA zenginleştirme gerçekleştirmek ( Tablo malzemelerigörmek) kit. NF su 140 µL 250 µL toplam hacmi için örnek ekleyin. Daha sonra bağlama arabellek x 2 250 µL ekleyin, örnek iyice vortexing tarafından mix ve oligo (dT) boncuk 15 µL ekleyin.
  2. Yukarı ve aşağı pipetting tarafından örnek mix ve 65 ° c 2 min için kuluçkaya. Daha sonra örnek RT 10 dakikadır yer. Son olarak, 16,100 x g boncuk: mRNA kompleksleri cips 2 min için de örnek santrifüj kapasitesi.
  3. Süpernatant atın ve Pelet yıkama çözüm 500 µL içinde resuspend. Çözüm bir spin sütuna aktarmak ve 15.000 x g, 1 dk. için sıralayacağız. Akışı aracılığıyla atın ve örnek ek bir 500 µL yıkama çözüm ile yıkayın. Daha sonra örnek, herhangi bir fazla etanol spin filtrelerinden kaldırmak için 15.000 x g 2 min için spin.
  4. Spin filtre bir yunus tüp aktarmak ve 80 µL prewarmed elüsyon çözüm (65 ° C) ve sütununu Pelet resuspend. Örnek 1,5 dk 65 ° c için kuluçkaya ve 15.000 x g, 1 dk. için iplik tarafından elute.
  5. Arıtılmış RNA spektrofotometre veya RNA konsantrasyon ve kalite miktar için sağlar benzer aracını kullanarak konsantrasyonu ölçmek.

5. RNase III parçalanma ve RNA temizlik

Not: (Önemli) dairesel RNA molekülleri C-seq kütüphaneler, üretmek için uygun hazırlamak için RNA uzunluğu yaklaşık 60 – 80 üslerini birleştirilmesi gerekir. Önceki yöntemler parçası RNA kimyasal bir parçalanma kullanmış iken, kimyasal parçalanma ağır metaller ile hasar sırasında son tahlilde transkripsiyon hataları olarak algılanacak RNA örnekleri tanıtır. Bu sorunu aşmak için bunun yerine üzerinde bir parçalanma küçük parçaları oluşturmak için RNase III kullanarak güveniyor. Ek bir avantaj enzimatik bu yaklaşımın uyumlu uçlara ligasyonu, sonra kimyasal parçalanma bir son onarım için gerek obviating için gerekli oluşturur olduğunu.

  1. RNA parçalanma tepki arıtılmış RNA'ın kadar 1 µg ile ayarla, reaksiyon arabelleği 10 µL 5 µL RNase III, su ve yeterli NF birimin en fazla 100 µL getirmek için (bkz. Tablo malzeme). Enzim son ekleyin ve karışımı yukarı ve aşağı en az 10 kez pipette karıştırmak için. Örnek uzunluğu yaklaşık 60-80 üsleri RNA parçaları üretmek eğilimi 25 min için 37 ° C'de kuluçkaya.
  2. Tepki hemen ile bir oligo 25 dk kuluçka işlemi tamamlandıktan sonra temizlemek temizlik ve yoğunlaştırıcı herhangi bir daha fazla sindirim önlemek için kit ( Tablo malzemelerigörmek). Örnek oligo-bağlayıcı arabelleğe 200 µL vortexing tarafından iyice karıştırın ve 800 µL % 100 etanol ekleyin ekleyin. Örnek vortexing tarafından mix ve bir koleksiyon tüp sağlanan spin sütununda aktarın.
  3. 10.000 x g 30 s ve yıkama için de örnek santrifüj kapasitesi 750 µL RNase III kaldırmak için yıkama arabelleği bununla. Santrifüj kapasitesi 10.000 x g 30 için de örnek s, akışı sayesinde atmak ve yukarıda açıklandığı gibi örnek bir kez daha 750 µL yıkama arabelleği ile yıkayın. Sonra ikinci akışı aracılığıyla iptal edildi, herhangi bir aşırı etanol kaldırmak 2 dak için 15.000 x g adresindeki sütun santrifüj kapasitesi.
  4. Sütun bir taze 1,5 mL tüp aktarmak ve NF su 24 µL örnekte 10.000 x g 1 dk. için de iplik tarafından elute.
  5. Kalite kontrol: 2 µL arıtılmış RNA parçaları almak ve 2'ye katlanmış seyreltik 2 µL NF su ekleyerek. Parçalanmış RNA parçalanmış RNA uzunluğu (Şekil 2 c) 50-100 üsleri yelpazesi içinde olduğundan emin olmak için ekran teyp çalıştırın.

6. RNA daireselleşmesi ve haddeleme daire Ters transkripsiyon

  1. RNA parçaları circularize için ısı-örnek 1 dk 65 ° C'de 20 µL tabiatını ve buz 2 min için hemen yerleştirin. Daha sonra 10 T4 RNA ligaz tampon, 10 mM ATP, RNase inhibitörü 1 µL, NF su 1 µL 4 µL x 4 µL ve 8 µL % 50 Polietilen glikol (PEG) ekleyin.
  2. Örnek vortexing tarafından iyice karıştırın, sonra 10 U/µL T4 RNA ligaz ı. Mix 2 µL örnek yeniden pipetting tarafından ekleyin ve 25 ° c 2 h 30 ° C'de ayarla kapak sıcaklığı ile thermocycler için kuluçkaya
  3. 2 h sonra örnek için 10 µL NF su ekleyin ve üreticinin belirtimlerine göre bir oligo temizlik ve konsantrasyon seti ile örnek temizlemek. NF su 20 µL örnekte elute.
  4. Tersine çevirmek için dairesel RNA molekülleri uyarlamak, 10 mM dNTPs 4 µL, 50 ng/µL rasgele hexamers 4 µL ve NF su 9 µL RNA'ın 9 µL ekleyin. Her şeyi iyice karıştırın pipetting tarafından 65 ° C için 1 dk da örneğine tabiatını ve yedekleme olarak kalan RNA buz 2 dk. mağaza için yerleştirin.
  5. 5 x ilk iplikçikli sentez arabelleğinin 8 µL, 0.1 mm DTT 2 µL ve 200 U/µL transkriptaz 4 µL ve her şeyi pipetting tarafından karıştırın. Örnek 10 dk 42 ° C'de 20 dk Kuluçka kuluçka sıcaklık yüksek 5 ° C'de ayarla kapaklı ardından, 25 ° C'de kuluçkaya.
    Not: Transkriptaz strand deplasman yetenekleri ile bu adımda bir haddeleme daire Ters transkripsiyon için izin vermek için kullanılması gerekir.
  6. Örnek için 10 µL NF su ekleyin ve üreticinin önerilerini göre oligo temizlik ve konsantrasyon seti ile temizle. 42 µL elüsyon çözüm örnek elute.
  7. Kalite kontrol: NF su 2 µL tek iplikçikli cDNA 2 µL sulandırmak ve bu örnek bir nükleotit analiz cihazda yüksek hassasiyet RNA bandı ile çalıştırın. Ters transkripsiyon düzgün, kitaplığa cDNA moleküllerin yaradıysa, uzunluk, kabaca üsleri 60-1500 arasında değişen görünür olmalıdır. İdeal olarak, çoğu cDNA 500 – 1000 üsleri (Şekil 2B) aralığında olduğunu.

7. ikinci Strand cDNA sentezi ve son onarım

  1. İkinci bir iplikçik sentez kiti bir çift iplikçikli cDNA Kütüphanesi oluşturmak için kullanın. Örnekleri buza koyun ve 30 µL NF su örneğinizi 38 µL için ekleyin. O zaman, 10 ikinci Strand arabellek x 8 µL ve ikinci Strand enzim 4 µL ekleyip, kuluçka için 2,5 h 16 ° C'de önce nazik pipetting tarafından örnek karıştırın.
  2. Oligo örnekleriyle kadar temiz temizlik ve konsantrasyon üreticinin önerilerini 100 µL tepkiler göre kit ve 38 µL NF su örneklerinde elute.
  3. Son onarım tepki kadar 20 µL NF su ekleyerek çift iplikçikli cDNA 35,5 µL, sonunda tamir tepki arabelleği 6.5 µL ve son hazırlık enzim karışımı 3 µL ayarlayın. Dikkatle tepki arabellek beyaz precipitates için kontrol edin ve onları el-varsa ısınma tarafından çözülür.
  4. Son onarım tepki pipetting tarafından mix ve 30 dk 65 ° C'de ikinci bir 30 dk kuluçka ardından, 20 ° C'de kuluçkaya Thermocycler kapak sıcaklık 5 ° c kuluçka sıcaklık yüksek ayarlayın.

8. adaptör ligasyonu ve boyut seçimi hazırlanan kütüphanelerin

  1. Bir çok adım Kütüphane hazırlık modülü ( Tablo malzemelerigörmek) son Kütüphane hazırlıkları için kullanın. İlk olarak, yeni nesil 10 kat sıralama için adaptörler seyreltik 1,5 µM, son konsantrasyonu 10 mM Tris-HCl içinde. O zaman, seyreltilmiş bağdaştırıcısının 2.5 µL ve 1 µL ligasyonu artırıcı, her örnek için ve onları vortexing tarafından karıştırın.
  2. Pipetting tarafından mix ve 15 dakika 20 ° C'de kuluçkaya Blunt/TA ligaz Master Mix 15 µL ekleyin. Daha sonra 3 µL urasil özgü eksizyon reaktif enzim ekleyin ve 15 dakika 37 ° C'de kuluçkaya. Tüp ligasyonu tamamlandıktan sonra 100 µL toplam hacmi için örnek için 13.5 µL NF su ekleyin ve boyut seçimi devam edin.
    Not: En iyi uzunluğu 600-800 üslerinin arasındadır cDNA molekülleri için boyut seçin. Parçalanmış RNA molekülleri uzunluğu yaklaşık 60 – 80 üsleri olsaydı, 600-800 baz uzunluğu olan moleküller için seçerek seçili moleküllerin çoğu aşağı akım işleme için ideal olan en az üç tandem tekrarlar, içerir sağlayacaktır ve analiz.
  3. 600-800 bp uzunluğu olan moleküller için seçin (bkz. Tablo reçetesi) resuspended manyetik boncuklar 30 µL iklime alıştırılacağı RT her örnek ve pipetting tarafından mix, ekleyin. Örnek bir 1,5 mL tüp aktarmak ve 5 min için RT kuluçkaya.
  4. Örnek boncuk süpernatant ayırmak 5 min için manyetik bir stand üzerine yerleştirin. Yeni 1,5 mL tüp ve (Bu büyük cDNA moleküllerine bağlıdır) manyetik boncuklar imha için (istenen cDNA molekülleri içeren) süpernatant aktarın.
  5. Her örnekleri için manyetik boncuklar 15 µL taze bir aliquot ekleyin, pipetting tarafından iyice karıştırın ve RT. yerde 5 min için manyetik bir raf üzerinde örnekleri kuluçkaya ve onları RT., 5 min için kuluçkaya Sonra dikkatle çıkarın ve boncuk rahatsız değil emin supernatants atın.
    Not: şimdi istenen hedef cDNA içeren manyetik boncuklar atmayın.
  6. 200 µL % 80 taze hazırlanmış etanol her örneklerin pelleted manyetik boncuklar bozmadan eklemek ve etanol için 30 s. atma kuluçkaya ve örnekler bir kez daha % 80 etanol ile yıkayın. Sonra tam olarak etanol herhangi bir iz örnekleri kaldırmak ve 5 min için boncuk kuruması ama boncuk aşırı kuru değil dikkatli olun. Boncuk overdried, çatlaklar granül içinde görünür.
  7. Boncuk örnekleri elute için manyetik standından tüpler kaldırın ve 10 mm Tris 19 µL ekleyin-HCl. yukarı ve aşağı birden çok kez boncuk resuspended ve örnekleri RT., 5 min için kuluçkaya damlalıklı Boncuk overdried Eğer, onlar için kuluçkaya > 10 dak.
  8. Örnekleri manyetik sandalyesine koyun ve onları boncuk süpernatant ayırmak 5 min için kuluçkaya. Dikkatle ve taze 1,5 mL tüp transfer, tüpler arıtılmış, boyutu seçili cDNA kitaplıklardan içeren süpernatant 15 µL çıkarın.

9. PCR güçlendirme ve son boncuk arıtma

  1. 5 µL evrensel astar ve bir benzersiz dizin astar 5 µL ekleyin (tablo malzemeleri görmek) her cDNA Kütüphanesi saflaştırılmış ve pipetting tarafından onları iyice karıştırın. Dikkatle polimeraz ana karıştırmak için kristalleri ve diğer precipitates kontrol ve precipitates erimesi kadar ana karışımı el ile sıcak.
    1. Örnek, polimeraz ana karışımı 25 µL onları pipetting tarafından mix ve PCR güçlendirme için aşağıda Bisiklet koşullarını takip ekleyin. 30 98 ° C'de ilk denatürasyon çalıştırın s ve sonra bir çift PCR reaksiyon denaturating tarafından 98 ° C'de örnekleri için 10 adımıysa s ve tavlama/uzantı PCR ürünleri 75 65 ° C'de 65 ° c 5 min için son bir uzantısı ardından s (12 x), ve 4 ° C'de belirsiz bir tutun
  2. Temiz kadar 45 µL PCR reaksiyon için doğrudan resuspended manyetik boncuklar ekleyerek son kütüphaneleri, onlar tarafından pipetting, mix ve onlara RT 5 dk. Transfer için örnek bir 1,5 mL tüp için kuluçkaya ve manyetik bir stand yerleştirin. 5 min için kuluçkaya süpernatant atmak ve taze hazırlanmış %80 etanol için 30 ile iki kez yıkayın s.
  3. İkinci yıkama sonra tam olarak etanol örneğinden kaldırmak ve 5 min için boncuk Pelet kurumasına ve 0.1 x TE 35 µL içinde elute. Boncuk pipetting tarafından resuspend ve onları örnek manyetik stand ve 5 dk sonra 5 dk. yer RT kuluçkaya, taze 1,5 mL tüp süpernatant ile 30 µL transfer. -80 ° C'de kitaplık depolamak
  4. Kalite kontrol: NF su 9 µL son kütüphanede 1 µL sulandırmak ve yüksek-duyarlı çip ile adanmış bir DNA analizi cihazda örnek çalıştırın; cDNA çoğunluğu 600-800 bp uzunluğu (Şekil 2e) aralığında olmalıdır.
  5. Elüsyon sonra örnekleri sıralama 250 bp eşleştirilmiş uç okuma veya 300 bp tek taraflı kenar okuma kullanarak bir kitlesel paralel sıralama platformda için yolla.

10. veri sıralama daire biyo-Bilişim Analizi

Not: Analiz ve C-seq tahlil ham verileri yorumlama adanmış bir biyo-Bilişim ardışık düzeni gerektirir. Bizim analizleri için kullanılan boru hattı şeması Şekil 3' te tasvir edilir. Bu boru hattında https://github.com/LynchLab/MAPGD indirin.

  1. Önce kaldır bağdaştırıcısı dizileri ve cutadapt1820 bir kalite puanı eşiği kullanma ile düşük kaliteli temel aramalar için okuma Böl.
  2. O zaman, herhangi bir tekrarlar ile 30 nükleotit en az boyutu algılamak için uygun bir algoritma kullanarak concatemerized RNA molekülü tarafından kodlanmış tekrarlar tanımlamak ve18en fazla 2 uyuşmazlıklar arasında yinelenir. Bir fikir birliği sıra--dan bu tekrarlar türetmek ve tüm temel aramalar ve ilişkili kalite puanları her pozisyonda izlemek.
    Not: Ters transkripsiyon circularized RNA molekülü üzerinde herhangi bir konuma başlayabilirsiniz Çünkü tekrar Başlat mutlaka parçalanmış RNA molekülü (bundan sonra ligasyonu noktası olarak anılacaktır) 5'ucuna karşılık gelmiyor. Buna göre fikir birliği sıra sürekli ligasyonu noktası tanımlaması gerektiren karşılık gelen transcriptome karşı harita değil.
  3. Tüp ligasyonu noktası tanımlamak için bir concatemer fikir birliği sırası patlama benzeri hizalama araç (kaba)19kullanarak başvuru transcriptome karşı eşleyin.
    1. Eşlenen sıra en az bir tam kesintisiz tekrarı ile ilk RNA parça dizisi içerdiğinden emin olun için fikir birliği sırası iki örneğini bir arada. Sonra uzlaşma işleminin öngörülen ligasyonu noktası konumuna başlamasına döndürün.
  4. Döndürülmüş fikir birliği dizileri zanaat20 kullanarak genom karşı eşleştirebilir ve hizalamaları transkripsiyon hataları için yanlış olabilir herhangi bir tek nükleotid polimorfizmleri (SNPs) algılamak için kullanabilirsiniz.
  5. Transkripsiyon hataları eşlenen döndürülmüş uzlaşma dizileri ara ve aday hataları dört ek testler pass olup olmadığını test.
    1. Öncelikle, bir transkripsiyon hatası (tipik bir gereklilik en az 20 defa okundu belirli bir temel ve Hayır daha okuma sayısı % 5 alternatif bir temel aramayı desteklemiyor olabilir karşılamak ihtiyaç vardır) bir SNP ile örtüşmediğinden emin olun.
    2. İkinci olarak, fikir birliği sıra her biri aynı baz çifti çağırır en az 3 tandem tekrar türetilmiştir kontrol edin; ve üçüncü olarak, o konuma kalite puanları toplamı 100'den fazla olmalıdır emin olun.
  6. Dördüncü ve son kontrol, tüm olası kombinasyonları (tüp ligasyonu noktasının tüm olası pozisyonlar simülasyonu) fikir birliği sırayla döndürmek ve her sürüm zanaat kullanarak başvuru genom karşı harita.
    Not: bir döndürülmüş sıralarının genom mükemmel bir eşleşme bulursa, karşılık gelen tüp ligasyonu noktası şimdi doğru bir kabul edilir ve transkripsiyon hata arama reddetti.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gibi tüm kitlesel paralel sıralama yaklaşımlar, her C-seq deney bir hantal, büyük veri kümesi oluşturur. İlk kez kullananlar için bu veri kümeleri ele almak zor olabilir; Böylece, tüm kullanıcılar deneme önce deneyimli bir biyo-informatician başvurun salık vermek. Ortalama olarak, beklenti kullanıcıların yaklaşık 55-70 Giga baz (Gbases) çoğu kitlesel paralel sıralama platformlarda başına oluşturur olduğunu. Böylece her örnek için yaklaşık 2-6 Gbases satın alınan bu iletişim kuralı için ge...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, transkripsiyon hataları Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogasterve Caenorhabditis eleganstespiti için C-seq kitaplıkları hazırlanması için en iyi duruma getirilmiş bir protokol açıklayın. Bu iletişim kuralının varolan iletişim kuralları, aynı zamanda alternatif teknikleri üzerinde çok sayıda avantajı vardır.

Son 15 yılda çok sayıda gazeteci sistemleri bu luciferase7,8 veya transkripsiyon algı...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yayın (C. Fritsch) hibe T32ES019851 fon tarafından mümkün yapıldı, R01AG054641 ve AFAR genç araştırmacı (M. Vermulst) verin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
RiboPure RNA saflaştırma kitiThermoFisherAM1926Toplam RNA saflaştırma
Genelute mRNA saflaştırmakiti Sigma-AldrichMRN70-1KTmRNA saflaştırma
Nükleaz içermeyen SuAmbionAM9937Elüsyon ve seyreltme
Ambion RNase IIIThermoFisherAM2290RNA parçalanması
T4 RNA Ligaz 1 (ssRNA Ligaz)New England BiolabsM0204SRNA daireselleştirme
RibolockThermoFisherEO0381RNaz inhibitörü
SuperScript III Ters TranskriptazThermoFisher18080044Yuvarlanan daire ters transkripsiyon
10 mM dNTP karışımıThermoFisher18427013Yuvarlanan daire ters transkripsiyon
Rastgele heksamerler (50 ng/&mikro; L)ThermoFisherN8080127Yuvarlanan daire ters transkripsiyon
NEB İkinci İplik Sentez ModülüNew England BiolabsE6111Sİkinci İplik Sentezi
New England BiolabsE7370ScDNA kütüphanesi hazırlığıiçin NEBNext Ultra DNA Kütüphanesi Hazırlık Kiti
NEB Next indeks primerleriNEBE7335SMultipleks PCR primerleri
Oligo Temiz & YoğunlaştırıcıZymo ResearchD4061RNA ve DNA örneklerinin temizlenmesi
DynaMag-2 MıknatısThermoFisher12321DManyetik boncuk saflaştırma
AMPure XP boncuklarıBeckman CoulterA63881Manyetik boncuk saflaştırma
Eppendorf 5424 MikrosantrifüjFisherScientific05-403-93santrifüjleme
INCU-Shaker 10 LBenchmark BilimselH1010Hücre kültürü
T100 Termal DöngüleyiciBIO RAD1861096Orta ila Yüksek sıcaklık döngü koşulları
PTC-200 Termal DöngüleyiciGMI8252-30-0001 ve nbsp;Düşük sıcaklıkta çevrim koşulları
RNase AwayMoleküler Biyoürünler700S-11Sterilizasyon
50 mL Santrifüj TüpüCorning430290Nükleaz İçermeyen
15 mL Santrifüj TüpüCorning430052Nükleaz İçermeyen
Eppendorf tüpleriUSA Scientific1615-5500Nükleaz İçermeyen
4200 Tapestation SistemiAgilentG2991AARNA ve tek sarmallı DNA örneklerinin kalite kontrolü için nükleotid analiz cihazı
Yüksek Hassasiyetli RNA Ekran BandıAgilent5067-5579RNA ve tek sarmallı DNA örneklerinin kalite kontrolü
RNA ScreenTape Numune TamponuAgilent5067-5577RNA ve tek sarmallı DNA örneklerinin kalite kontrolü
RNA ScreenTape LadderAgilent5067-5578RNA ve tek sarmallı DNA örneklerinin kalite kontrolü
2100 Biyoanalizör CihazıAgilentG2939BAÇift sarmallı DNA kalite kontrolü
Yüksek Hassasiyetli DNA KitiAgilent5067-4626Çift sarmallı cDNA örnekleri için kalite kontrol
Su BanyosuVWR462-0244İnkübasyon
NanoDrop 2000/2000C SpektrofotometreThermoFisherND-2000CRNA konsantrasyonunun belirlenmesi
Illumina

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kireeva, M. L., et al. Transient reversal of RNA polymerase II active site closing controls fidelity of transcription elongation. Molecular Cell. 30, 557-566 (2008).
  2. Walmacq, C., et al. Rpb9 subunit controls transcription fidelity by delaying NTP sequestration in RNA polymerase II. The Journal of Biological Chemistry. 284, 19601-19612 (2009).
  3. Strathern, J., et al. The fidelity of transcription: RPB1 (RPO21) mutations that increase transcriptional slippage in S. cerevisiae. The Journal of Biological Chemistry. 288, 2689-2699 (2013).
  4. Irvin, J. D., et al. A genetic assay for transcription errors reveals multilayer control of RNA polymerase II fidelity. PLoS Genetics. 10, e1004532(2014).
  5. Gout, J. F., et al. The landscape of transcription errors in eukaryotic cells. Science Advances. 3, e1701484(2017).
  6. Gout, J. F., Thomas, W. K., Smith, Z., Okamoto, K., Lynch, M. Large-scale detection of in vivo transcription errors. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 110, 18584-18589 (2013).
  7. Viswanathan, A., You, H. J., Doetsch, P. W. Phenotypic change caused by transcriptional bypass of uracil in nondividing cells. Science. 284, 159-162 (1999).
  8. Bregeon, D., Doddridge, Z. A., You, H. J., Weiss, B., Doetsch, P. W. Transcriptional mutagenesis induced by uracil and 8-oxoguanine in Escherichia coli. Molecular Cell. 12, 959-970 (2003).
  9. Saxowsky, T. T., Doetsch, P. W. RNA polymerase encounters with DNA damage: transcription-coupled repair or transcriptional mutagenesis. Chemical Reviews. 106, 474-488 (2006).
  10. Saxowsky, T. T., Meadows, K. L., Klungland, A., Doetsch, P. W. 8-Oxoguanine-mediated transcriptional mutagenesis causes Ras activation in mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 105, 18877-18882 (2008).
  11. Vermulst, M., et al. Transcription errors induce proteotoxic stress and shorten cellular lifespan. Nature Communications. 6, 8065(2015).
  12. van Leeuwen, F. W., Burbach, J. P., Hol, E. M. Mutations in RNA: a first example of molecular misreading in Alzheimer's disease. Trends in Neurosciences. 21, 331-335 (1998).
  13. van Leeuwen, F. W., et al. Frameshift mutants of beta amyloid precursor protein and ubiquitin-B in Alzheimer's and Down patients. Science. 279, 242-247 (1998).
  14. Morreall, J. F., Petrova, L., Doetsch, P. W. Transcriptional mutagenesis and its potential roles in the etiology of cancer and bacterial antibiotic resistance. Journal of Cellular Physiology. 228, 2257-2261 (2013).
  15. Strathern, J. N., Jin, D. J., Court, D. L., Kashlev, M. Isolation and characterization of transcription fidelity mutants. Biochimica et Biophysica Acta. 1819, 694-699 (2012).
  16. Acevedo, A., Andino, R. Library preparation for highly accurate population sequencing of RNA viruses. Nature Protocols. 9, 1760-1769 (2014).
  17. Traverse, C. C., Ochman, H. Genome-Wide Spectra of Transcription Insertions and Deletions Reveal That Slippage Depends on RNA:DNA Hybrid Complementarity. mBio. 8, (2017).
  18. Martin, M. Cutadapt Removes Adapter Sequences From High-Throughput Sequencing Reads. EMBnet.journal. 17 (1), 10-12 (2011).
  19. Kent, W. J. BLAT--the BLAST-like alignment tool. Genome Research. 12, 656-664 (2002).
  20. Kim, D., et al. TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biology. 14, R36(2013).
  21. Zhou, Y. N., et al. Isolation and characterization of RNA polymerase rpoB mutations that alter transcription slippage during elongation in Escherichia coli. The Journal of Biological Chemistry. 288, 2700-2710 (2013).
  22. Reid-Bayliss, K. S., Loeb, L. A. Accurate RNA consensus sequencing for high-fidelity detection of transcriptional mutagenesis-induced epimutations. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 114, 9415-9420 (2017).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Dairesel Dizileme DeneyiRNA Polimeraz SadakatiSaccharomyces cerevisiaeDrosophila melanogasterCaenorhabditis elegansRNA Fragman Daireselle tirmeT4 RNA LigazTers Transkripsiyonkinci Zincir SenteziAdapt r LigasyonuManyetik Boncuk ile Boyut Se imiPCR AmplifikasyonuK t phane Temizleme

İlgili makaleler