Bu iletişim kuralı birden çok model organizmalar transkripsiyon kalitesini izlemek için araştırmacılar ile yeni bir araç sağlar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Ökaryotlarda transkripsiyon hataları genom çapında gözetim
Bu makalede
Özet
Özet
Doğru transkripsiyon genetik bilgi sadık ifade için gereklidir. Rağmen şaşırtıcı derecede az transkripsiyon kalitesini kontrol mekanizmaları hakkında bilinir. Bilimsel bilgi bu boşluğu doldurmak için biz son zamanlarda daire-sıralama tahlil Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogasterve Caenorhabditis transcriptome boyunca transkripsiyon hataları tespit etmek için en iyi duruma getirilmiş elegans. Bu iletişim kuralı böylece transkripsiyon kalitesini kontrol mekanizmaları benzersiz detay aydınlatılmamıştır ökaryotik hücrelerde transkripsiyon hataları peyzaj eşlemek için araştırmacılar ile yeni ve güçlü bir araç sağlar.
Giriş
Genom kesin bir biyolojik plan yaşam sağlar. Bu plan doğru çözümü için büyük bir kesinlikle transkripsiyonu genom önemlidir. Ancak, transkripsiyon hatasız olması pek mümkün değildir. Örneğin, RNA polimeraz hataya vitro1,2olmak uzun bilinmektedir ve son zamanlarda onlar3,5,6yanı sıra hataları vivo içinde işlemek gösterildi, zaman özellikle DNA hasar7,8,9,10ile karşı karşıya.....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. hazırlık
- RNases omnipresent; Bu nedenle, çalışma alanını iyice o aşağı bir dekontaminasyon reaktif ile püskürtülerek temiz (Örneğin, RNase uzağa) ve % 70 etanol. Sprey herhangi bir Pipetler, kalem veya potansiyel kaynakları RNase kirlenme kaldırmak için tüp rafları aşağı.
- Daha fazla örnekler bulaşıcı RNases önlemek için deneme sırasında bir önlük ya da uzun kollu T-shirt giymek. Eldivenleri ve özellikle onları kutusu veya çanta alınırken kullanılacak herhangi bir tüpler içine arasında temasından kaçının.
- Önce ters transkripsiyon, eldiven sık sık değiştirin.
Not: en iyi sonucu almak için önce ters transkrip....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Gibi tüm kitlesel paralel sıralama yaklaşımlar, her C-seq deney bir hantal, büyük veri kümesi oluşturur. İlk kez kullananlar için bu veri kümeleri ele almak zor olabilir; Böylece, tüm kullanıcılar deneme önce deneyimli bir biyo-informatician başvurun salık vermek. Ortalama olarak, beklenti kullanıcıların yaklaşık 55-70 Giga baz (Gbases) çoğu kitlesel paralel sıralama platformlarda başına oluşturur olduğunu. Böylece her örnek için yaklaşık 2-6 Gbases satın alınan bu iletişim kuralı için ge.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Burada, transkripsiyon hataları Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogasterve Caenorhabditis eleganstespiti için C-seq kitaplıkları hazırlanması için en iyi duruma getirilmiş bir protokol açıklayın. Bu iletişim kuralının varolan iletişim kuralları, aynı zamanda alternatif teknikleri üzerinde çok sayıda avantajı vardır.
Son 15 yılda çok sayıda gazeteci sistemleri bu luciferase7,8 veya transkripsiyon algı.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar ifşa gerek yok.
Teşekkürler
Bu yayın (C. Fritsch) hibe T32ES019851 fon tarafından mümkün yapıldı, R01AG054641 ve AFAR genç araştırmacı (M. Vermulst) verin.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| RiboPure RNA saflaştırma kiti | ThermoFisher | AM1926 | Toplam RNA saflaştırma |
| Genelute mRNA saflaştırma | kiti Sigma-Aldrich | MRN70-1KT | mRNA saflaştırma |
| Nükleaz içermeyen Su | Ambion | AM9937 | Elüsyon ve seyreltme |
| Ambion RNase III | ThermoFisher | AM2290 | RNA parçalanması |
| T4 RNA Ligaz 1 (ssRNA Ligaz) | New England Biolabs | M0204S | RNA daireselleştirme |
| Ribolock | ThermoFisher | EO0381 | RNaz inhibitörü |
| SuperScript III Ters Transkriptaz | ThermoFisher | 18080044 | Yuvarlanan daire ters transkripsiyon |
| 10 mM dNTP karışımı | ThermoFisher | 18427013 | Yuvarlanan daire ters transkripsiyon |
| Rastgele heksamerler (50 ng/&mikro; L) | ThermoFisher | N8080127 | Yuvarlanan daire ters transkripsiyon |
| NEB İkinci İplik Sentez Modülü | New England Biolabs | E6111S | İkinci İplik Sentezi |
| New England Biolabs | E7370S | cDNA kütüphanesi hazırlığı | için NEBNext Ultra DNA Kütüphanesi Hazırlık Kiti |
| NEB Next indeks primerleri | NEB | E7335S | Multipleks PCR primerleri |
| Oligo Temiz & Yoğunlaştırıcı | Zymo Research | D4061 | RNA ve DNA örneklerinin temizlenmesi |
| DynaMag-2 Mıknatıs | ThermoFisher | 12321D | Manyetik boncuk saflaştırma |
| AMPure XP boncukları | Beckman Coulter | A63881 | Manyetik boncuk saflaştırma |
| Eppendorf 5424 Mikrosantrifüj | FisherScientific | 05-403-93 | santrifüjleme |
| INCU-Shaker 10 L | Benchmark Bilimsel | H1010 | Hücre kültürü |
| T100 Termal Döngüleyici | BIO RAD | 1861096 | Orta ila Yüksek sıcaklık döngü koşulları |
| PTC-200 Termal Döngüleyici | GMI | 8252-30-0001 ve nbsp; | Düşük sıcaklıkta çevrim koşulları |
| RNase Away | Moleküler Biyoürünler | 700S-11 | Sterilizasyon |
| 50 mL Santrifüj Tüpü | Corning | 430290 | Nükleaz İçermeyen |
| 15 mL Santrifüj Tüpü | Corning | 430052 | Nükleaz İçermeyen |
| Eppendorf tüpleri | USA Scientific | 1615-5500 | Nükleaz İçermeyen |
| 4200 Tapestation Sistemi | Agilent | G2991AA | RNA ve tek sarmallı DNA örneklerinin kalite kontrolü için nükleotid analiz cihazı |
| Yüksek Hassasiyetli RNA Ekran Bandı | Agilent | 5067-5579 | RNA ve tek sarmallı DNA örneklerinin kalite kontrolü |
| RNA ScreenTape Numune Tamponu | Agilent | 5067-5577 | RNA ve tek sarmallı DNA örneklerinin kalite kontrolü |
| RNA ScreenTape Ladder | Agilent | 5067-5578 | RNA ve tek sarmallı DNA örneklerinin kalite kontrolü |
| 2100 Biyoanalizör Cihazı | Agilent | G2939BA | Çift sarmallı DNA kalite kontrolü |
| Yüksek Hassasiyetli DNA Kiti | Agilent | 5067-4626 | Çift sarmallı cDNA örnekleri için kalite kontrol |
| Su Banyosu | VWR | 462-0244 | İnkübasyon |
| NanoDrop 2000/2000C Spektrofotometre | ThermoFisher | ND-2000C | RNA konsantrasyonunun belirlenmesi |
Kaynaklar
- Kireeva, M. L., et al. Transient reversal of RNA polymerase II active site closing controls fidelity of transcription elongation. Molecular Cell. 30, 557-566 (2008).
- Walmacq, C., et al.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
