Yöntem makalesi

Ökaryotlarda transkripsiyon hataları genom çapında gözetim

DOI:

10.3791/57731

⸱

13 Eylül 2018

 ,  , 
1Center for Mitochondrial and Epigenomic Medicine, Children's Hospital of Philadelphia, 2Department of Cellular and Molecular Biology, University of Pennsylvania, 3Department of Biological Sciences, Mississippi State University, 4Center for Mechanisms of Evolution, Biodesign Institute, Arizona State University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu iletişim kuralı birden çok model organizmalar transkripsiyon kalitesini izlemek için araştırmacılar ile yeni bir araç sağlar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Doğru transkripsiyon genetik bilgi sadık ifade için gereklidir. Rağmen şaşırtıcı derecede az transkripsiyon kalitesini kontrol mekanizmaları hakkında bilinir. Bilimsel bilgi bu boşluğu doldurmak için biz son zamanlarda daire-sıralama tahlil Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogasterve Caenorhabditis transcriptome boyunca transkripsiyon hataları tespit etmek için en iyi duruma getirilmiş elegans. Bu iletişim kuralı böylece transkripsiyon kalitesini kontrol mekanizmaları benzersiz detay aydınlatılmamıştır ökaryotik hücrelerde transkripsiyon hataları peyzaj eşlemek için araştırmacılar ile yeni ve güçlü bir araç sağlar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Genom kesin bir biyolojik plan yaşam sağlar. Bu plan doğru çözümü için büyük bir kesinlikle transkripsiyonu genom önemlidir. Ancak, transkripsiyon hatasız olması pek mümkün değildir. Örneğin, RNA polimeraz hataya vitro1,2olmak uzun bilinmektedir ve son zamanlarda onlar3,5,6yanı sıra hataları vivo içinde işlemek gösterildi, zaman özellikle DNA hasar7,8,9,10ile karşı karşıya.....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. hazırlık

  1. RNases omnipresent; Bu nedenle, çalışma alanını iyice o aşağı bir dekontaminasyon reaktif ile püskürtülerek temiz (Örneğin, RNase uzağa) ve % 70 etanol. Sprey herhangi bir Pipetler, kalem veya potansiyel kaynakları RNase kirlenme kaldırmak için tüp rafları aşağı.
  2. Daha fazla örnekler bulaşıcı RNases önlemek için deneme sırasında bir önlük ya da uzun kollu T-shirt giymek. Eldivenleri ve özellikle onları kutusu veya çanta alınırken kullanılacak herhangi bir tüpler içine arasında temasından kaçının.
  3. Önce ters transkripsiyon, eldiven sık sık değiştirin.
    Not: en iyi sonucu almak için önce ters transkrip....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gibi tüm kitlesel paralel sıralama yaklaşımlar, her C-seq deney bir hantal, büyük veri kümesi oluşturur. İlk kez kullananlar için bu veri kümeleri ele almak zor olabilir; Böylece, tüm kullanıcılar deneme önce deneyimli bir biyo-informatician başvurun salık vermek. Ortalama olarak, beklenti kullanıcıların yaklaşık 55-70 Giga baz (Gbases) çoğu kitlesel paralel sıralama platformlarda başına oluşturur olduğunu. Böylece her örnek için yaklaşık 2-6 Gbases satın alınan bu iletişim kuralı için ge.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, transkripsiyon hataları Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogasterve Caenorhabditis eleganstespiti için C-seq kitaplıkları hazırlanması için en iyi duruma getirilmiş bir protokol açıklayın. Bu iletişim kuralının varolan iletişim kuralları, aynı zamanda alternatif teknikleri üzerinde çok sayıda avantajı vardır.

Son 15 yılda çok sayıda gazeteci sistemleri bu luciferase7,8 veya transkripsiyon algı.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yayın (C. Fritsch) hibe T32ES019851 fon tarafından mümkün yapıldı, R01AG054641 ve AFAR genç araştırmacı (M. Vermulst) verin.

....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
RiboPure RNA saflaştırma kitiThermoFisherAM1926Toplam RNA saflaştırma
Genelute mRNA saflaştırmakiti Sigma-AldrichMRN70-1KTmRNA saflaştırma
Nükleaz içermeyen SuAmbionAM9937Elüsyon ve seyreltme
Ambion RNase IIIThermoFisherAM2290RNA parçalanması
T4 RNA Ligaz 1 (ssRNA Ligaz)New England BiolabsM0204SRNA daireselleştirme
RibolockThermoFisherEO0381RNaz inhibitörü
SuperScript III Ters TranskriptazThermoFisher18080044Yuvarlanan daire ters transkripsiyon
10 mM dNTP karışımıThermoFisher18427013Yuvarlanan daire ters transkripsiyon
Rastgele heksamerler (50 ng/&mikro; L)ThermoFisherN8080127Yuvarlanan daire ters transkripsiyon
NEB İkinci İplik Sentez ModülüNew England BiolabsE6111Sİkinci İplik Sentezi
New England BiolabsE7370ScDNA kütüphanesi hazırlığıiçin NEBNext Ultra DNA Kütüphanesi Hazırlık Kiti
NEB Next indeks primerleriNEBE7335SMultipleks PCR primerleri
Oligo Temiz & YoğunlaştırıcıZymo ResearchD4061RNA ve DNA örneklerinin temizlenmesi
DynaMag-2 MıknatısThermoFisher12321DManyetik boncuk saflaştırma
AMPure XP boncuklarıBeckman CoulterA63881Manyetik boncuk saflaştırma
Eppendorf 5424 MikrosantrifüjFisherScientific05-403-93santrifüjleme
INCU-Shaker 10 LBenchmark BilimselH1010Hücre kültürü
T100 Termal DöngüleyiciBIO RAD1861096Orta ila Yüksek sıcaklık döngü koşulları
PTC-200 Termal DöngüleyiciGMI8252-30-0001 ve nbsp;Düşük sıcaklıkta çevrim koşulları
RNase AwayMoleküler Biyoürünler700S-11Sterilizasyon
50 mL Santrifüj TüpüCorning430290Nükleaz İçermeyen
15 mL Santrifüj TüpüCorning430052Nükleaz İçermeyen
Eppendorf tüpleriUSA Scientific1615-5500Nükleaz İçermeyen
4200 Tapestation SistemiAgilentG2991AARNA ve tek sarmallı DNA örneklerinin kalite kontrolü için nükleotid analiz cihazı
Yüksek Hassasiyetli RNA Ekran BandıAgilent5067-5579RNA ve tek sarmallı DNA örneklerinin kalite kontrolü
RNA ScreenTape Numune TamponuAgilent5067-5577RNA ve tek sarmallı DNA örneklerinin kalite kontrolü
RNA ScreenTape LadderAgilent5067-5578RNA ve tek sarmallı DNA örneklerinin kalite kontrolü
2100 Biyoanalizör CihazıAgilentG2939BAÇift sarmallı DNA kalite kontrolü
Yüksek Hassasiyetli DNA KitiAgilent5067-4626Çift sarmallı cDNA örnekleri için kalite kontrol
Su BanyosuVWR462-0244İnkübasyon
NanoDrop 2000/2000C SpektrofotometreThermoFisherND-2000CRNA konsantrasyonunun belirlenmesi
Illumina

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kireeva, M. L., et al. Transient reversal of RNA polymerase II active site closing controls fidelity of transcription elongation. Molecular Cell. 30, 557-566 (2008).
  2. Walmacq, C., et al.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Dairesel Dizileme DeneyiRNA Polimeraz SadakatiSaccharomyces cerevisiaeDrosophila melanogasterCaenorhabditis elegansRNA Fragman Daireselle tirmeT4 RNA LigazTers Transkripsiyonkinci Zincir SenteziAdapt r LigasyonuManyetik Boncuk ile Boyut Se imiPCR AmplifikasyonuK t phane Temizleme

İlgili makaleler