Burada, Ala97Ser, en yaygın endemik mutasyon Tayvan, örnek olarak kullanarak nokta mutasyon kalıtsal transthyretin amiloidoz tanısı için varlığını doğrulamak için bir protokol mevcut.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Kalıtsal Transthyretin Ala97Ser genetik analizini amiloidoz ile ilgili
Bu makalede
Özet
Özet
Genetik test kalıtsal transthyretin en güvenilir sınava amiloidoz ilgili ve transthyretin Amiloidoz (ATTR) çoğu durumda yapılmalıdır olduğunu. ATTR heterojen fenotipleri ile nadir ama ölümcül bir hastalıktır; Bu nedenle, tanı bazen gecikir. İle artan ilgi ve erken belirtileri ATTR yanı sıra gelişmekte olan tedaviler üzerinde daha geniş tanıma, transthyretin (TTR) genetik de dahil olmak üzere uygun Diagnostik araştırmalar, türleri onaylamak için test etmek ve bu nedenle ATTR türevleri vardır prognoz geliştirmek için temel. Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) yöntemleri ile Genetik analizlerle onaylamak TTR nokta mutasyonlar varlığı çok daha hızlı ve daha güvenli Güney leke gibi geleneksel yöntemleri. Burada, biz ATTR Ala97Ser mutasyon, Tayvan en yaygın endemik mutasyon genetik onay göstermek. Protokol dört ana adımları kapsar: toplama tüm kan örneklerini, DNA ekstraksiyon, PCR ile tüm 4 TTR ekzonlar Genetik Analizi ve DNA sıralamanın.
Giriş
Transthyretin (TTR) Amiloidoz (ATTR) kalıtsal sistemik amiloidoz1en sık görülen ve transthyretin (TTR) gen2' deki bir otozomal baskın devralınan mutasyon neden olabilir. TTR mutasyonlar tetrameric protein yapısı istikrarsızlaştırmak ve amiloid liflerinde2' ye yeniden monomerleri içine onun ayrılma için kurşun. 100'den fazla amyloidogenic TTR mutasyonlar bildirilen dünya çapında1olmuştur. Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) yöntemleri ile Genetik analizlerle TTR nokta mutasyon varlığını doğrulamak ve radioactively etiketli probları southern blot3ile karşılaştırıldığında kullanımı kaçınarak dahil olmak üzere avantajlara sahip. PCR çok sayıda modern Bilimler4alanlara uygulanan hızlı, kolay, ucuz ve güvenilir bir tekniktir.
Bu ilerici ve ölümcül hastalığın erken tanı onun fenotipik heterojenite verilen zordur. Dikkat ve daha geniş tanıma ATTR yanı sıra gelişmekte olan tedaviler5erken belirtileri üzerinde artan ile TTR genetik testi de dahil olmak üzere uygun Diagnostik araştırmalar bu nedenle prognoz geliştirmek için kritik olan araçlardır. Ayrıca, farklı mutasyon özelliği farklı alellerle, yasi, ilerleme, hastalık şiddeti, medyan sağkalım karaciğer nakli veya TTR stabilizatörleri2,6, etkinliği kalıpları ile ilişkili olan ve genetik danışmanlık7,8,9büyük etkiler değişken derece tutulumu, nörolojik ve kardiyoloji. Ayrıca, son derece hassas bir genetik test ATTR iki farklı tür ayıran tek araçtır: kalıtsal (mutant) ve vahşi türü (mutant olmayan form, Senil sistemik amiloidoz, SSA)7. Terapiler yaygın olarak2farklı olduğundan ATTR, türleri onaylamak için zorunludur. Bu nedenle, TTR genetik test kademeli protokolü tanımlamak için artan bir zorunluluk yoktur.
Ala97Ser, Tayvan, en yaygın endemik mutasyon örnek olarak kullanarak mutasyon tespit etmek için moleküler yaklaşım ayr›ca gösterilecektir. Değişiklikleri DNA ekstraksiyon adımda kullanılan üç çözümleri azaltmak ve DNA yeterli miktarda verir. Bu iletişim kuralı, bölgeler de dahil olmak üzere 5' akıntıya karşı 3' aşağı, organizatör, intron, tüm 4 TTR ekzonlar analiz edildi ve çevrilmeyen bölgeler (UTR) değil sıralı.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Laboratuvarda yapılan test gereksinimleri, klinik laboratuvar iyileştirme değişiklikler (CLIA), 1988, kurumsal İnceleme Kurulu, Chang Gung Memorial Hastanesi tarafından onaylanmış yönetmelikleri uyarınca gerçekleştirilmiştir ve Üniversite (lisans no. 100 - 4470A3 ve 104-2462A3). Aydınlatılmış onam tüm hastalardan elde edildi.
1. kan numune toplama
- Tam kan piyasada bulunan EDTA tedavi tüpler içine toplamak. Karışımı yavaşça ve işleme kadar kan örneği 4 ° C'de depolayın.
2. DNA ekstraksiyon periferik kandan
Bir DNA ekstraksiyon kiti genomik DNA ekstraksiyon için kullanın (bkz. Tablo malzeme).
- Çözüm 1 10 mL 4.0 mL kan örneği için ekleyin. Örnek 10 min için buz üzerinde kuluçkaya.
- 2.000 x g 4 ° C'de 5 min için de örnek santrifüj kapasitesi Kaldırmak ve süpernatant dikkatli atın. Pelet çözüm 1 3 mL resuspend.
- Örnek 4 ° C'de 5 min için 2.000 x g de tekrar santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın. Pelet çözüm 2 3 mL resuspend.
- 10 µL 100 µg/mL nihai bir konsantrasyon almak ve iyice karıştırın pronase hisse senedi çözüm (225 mg/mL) ekleyin. 37 ° C'de gecede kuluçkaya.
- Buz 10 dakika süreyle Ekle 0.8 mL çözüm 3 örnek tüp soğuk ve 3 - 5 kez tersine çevirin. Örnek 5 min için buz yerleştirin.
- Örneği ' 3000 x g 4 ° C'de 15 dakika santrifüj kapasitesi Dikkatle süpernatant 15 mL steril konik santrifüj tüpü aktarın.
- 6 µL 20 µg/mL nihai bir konsantrasyon almak için RNase hisse senedi çözüm (10 mg/mL) ekleyin. 15 dakika 37 ° C'de kuluçkaya.
- İzopropil alkol ve mix 2.5 mL iyice yavaşça DNA çökelti birkaç kez ters çevirme tarafından ekleyin (beyaz, topaklanmış malzeme ipliklerini oluşturacak). Bir büyük geçişli damlalıklı kullanarak, DNA precipitant yeni bir 1,5 mL santrifüj tüpü aktarın.
- 4 ° C'de 3 min için 12.000 x g, santrifüj Süpernatant dikkatli atın. Yıkama DNA Pelet 500 µL % 70 etanol ekleyerek.
- 1 dk. için 12.000 x g, santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın. Hava kuru DNA Pelet oda sıcaklığında. GKD2O 100 µL ekleyin ve 15 dakika DNA resuspend 65 ° C'de kuluçkaya.
3. genomik DNA miktar
Bir spektrofotometre kullanın (miktar ve kalite genomik DNA'ın algılamak için Malzemeler tablobkz:).
- Spektrofotometre makineye bağlı olan bilgisayarda oturum. Yazılımını açın.
- Spektrofotometre makine başlatın:
- "Nükleik asit" spektrofotometre yazılım'ı tıklatın.
- Ayaklı bir tek kullanımlık kağıt mendil ve arıtılmış su ile temizleyin.
- Spektrofotometre boş:
- Kaide arıtılmış su 2 µL yükleyin.
- Spektrofotometre üst kol aşağı indirin ve "Boş" Bunu ayarlamak için tıklatın.
- Bittiğinde, üst kol lift ve ayaklı bir bezle kurulayın.
- Ölçü örnek:
- "DNA-50" örnek türü tıklatın.
- DNA örneği kaide üzerinde 2 µL yükleyin.
- Üst kol aşağı indirin ve "A260/A280 oranı ve örnek konsantrasyonunu ölçmek için ölçü birimi"'ı tıklatın.
- Kaide arasında her çalışma bir silme ve arıtılmış su ile temizleyin.
- "Print Screen" verileri toplamak üzere tıklatın.
4. Genetik analizlerle mutasyonların
Hedef DNA PCR4ile yükseltmek. PCR 25 µL tepki olarak gerçekleştirmek bir DNA polimeraz kullanarak karışımı kiti ( Tablo malzemelerigörmek). Tablo 1 TTR gen intronic astar gösterir.
| Gen | Astar sıra |
| Exon1 | F: 5'-TCAGATTGGCAGGGATAAGC-3' R: 5'-GCAAAGCTGGAAGGAGTCAC-3' |
| Exon2 | F: 5'-TCTTGTTTCGCTCCAGATTTC-3' R: 5'-TCTACCAAGTGAGGGGCAAA-3' |
| Exon3 | F: 5'-GTGTTAGTTGGTGGGGGTGT-3' R: 5'-TGAGTAAAACTGTGCATTTCCTG-3' |
| Exon4 | F: 5'-GACTTCCGGTGGTCAGTCAT-3' R: 5'-GCGTTCTGCCCAGATACTTT-3' |
Tablo 1. TTR gen intronic astar. (NCBI başvuru sıra: NC_000018.10)
- Reaktifleri 0.2 mL PCR tüp Tablo 2 ' de ekleyin.
| Bileşenleri | Birim (µL) | Son konsantrasyonu |
| 10 x arabellek | 2.5 | 1 x |
| MgCl2 (25 mM) | 1.5 | 1.5 mM |
| 360 GC artırıcı | 1 | - |
| 360 DNA polimeraz | 0,2 | 2 U/reaksiyon |
| dNTP Mix (25 mM her) | 2 | 2 mM |
| Astar F (10 µM) | 1 | 0.4 ΜM |
| Astar R (10 µM) | 1 | 0.4 ΜM |
| DNA (100 ng) | 2 | |
| PCR-sınıf su | 13,8 | - |
| Toplam hacim | 25 | - |
Tablo 2. PCR reaksiyon koşulları.
- Karışımı yavaşça ve kısaca tüm bileşenleri tüp alt toplamak için benchtop santrifüj üzerinde santrifüj kapasitesi. Tüp bir thermocycler yerleştirin.
- PCR 30 döngüleri için gerçekleştirin. 30 denatürasyon adıma, her döngü oluşur 94 ° c, astar için 30 tavlama s s 58 ° C ve polimeraz uzantısı için 45 s 72 ° c (bkz. Tablo 3).
| Adım | Sıcaklık (° C) | Zaman | döngüsü |
| İlk denatürasyon | 95 | 5 dk | 1 |
| DNA denatürasyon adım | 94 | 30 s | 30 döngüleri |
| Astar tavlama adım | 58 | 30 s | 30 döngüleri |
| Polimeraz uzantısı adım | 72 | 45 s | 30 döngüleri |
| Yazı uzama adım | 72 | 10 dk | 1 |
| PCR sonu Bisiklete binme | 4 | Belirsiz |
Tablo 3. PCR ürünleri yükseltecek koşulları Bisiklete binme.
- PCR ürünü jel elektroforez ile görselleştirme tarafından doğrula:
- % 1.2 özel jel hazırlayın:
- 100 mL 0.5 ile 1,2 g özel tozu karışımı bir mikrodalga şişesi x TBE. Mikrodalga fırında 2 dk kadar özel tamamen çözülür. Özel karışımı ile 55 ° c sakin
- Etidyum bromür çözüm (10 mg/mL) 2 µL özel karışıma ekleyin ve karışımı yavaşça. Yaklaşık 5-7 mm bir jel tepsisine özel karışımı dökün, sonra comb(s) yere ekleyin. (En az 30 dk) kuvvetlendirmek ve dikkatli bir şekilde çıkarın comb(s) izin verir.
- Örnekleri yüklemek ve bir özel jel çalıştırmak:
- Jel ve tepsi Elektroforez hücreye yerleştirin. 0,5 ile Elektroforez hücreyi doldurmak jel kaplı kadar x TBE.
- Dikkatle 2 yük µL 100 bp DNA'ın moleküler boyutu marker olarak jel tek şeritli içine merdiven ( Tablo malzemelerigörmek). Ek şerit içine yük boya/örnek karışımı (1 µL 6 x yükleme boya ile PCR ürünü karışımı 5 µL).
- Güç kaynağı açın. 25 dk için jel 100 V çalıştırın.
- Jel Elektroforez hücreden kaldırın. DNA parçalarının UV bir görüntüleme sistemi ışığı altında görselleştirin.
- % 1.2 özel jel hazırlayın:
5. DNA sıralama
- PCR ürünleri ticari bir seti kullanarak arındırmak ve ticari olarak veya bir Otomatik Sekanslama ile sıra ( Tablo malzemelerigörmek).
- Nükleotit dizileri nükleotit veritabanları10nükleotit sorguya karşılaştırmak için NCBI patlama sunucuya gönderin. Sonuçlar görüntülenir sonra sıra hizalamaları gerçekleştirmek ve beklenen mutasyon tanımlar.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Özel jel elektroforez iki hasta ve beklenen boyutlarda bir 454 bp PCR ürünü exon 4 TTR gen (Şekil 1) için de dahil olmak üzere, bir sağlıklı tek tek ortaya bantları.
Resim 1 . PCR tasvir jel elektroforez güçlendirilmiş TTR gen. Normal: sağlıklı bir birey. Lane M: 100 bp ...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Protokol içinde iki önemli adım vardır. İlk olarak, beyaz kan hücreleri yeterli sayıda için hemodiluted numune kaçınılmalıdır11olmalıdır. İkinci olarak, uygun PCR astar kullanımı güvenilir sonuçlar12elde etmek için esastır. Primer-BLAST web aracı astar4,13tasarlamak için kullanılır; en az 40 baz çifti 4 TTR ekzonlar her tarafında örtülmelidir. Ayrıca astar özgüllük kontrol etmek için NCBI üzerinde patlama çalıştırın...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar ifşa gerek yok.
Teşekkürler
Bayan Shin-eğlenceli Wu deneylerde yardımları için teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışmada Chang Gung tıbbi araştırma programı (CMRPG3C0371, CMRPG3C0372, CMRPG3C0373) ve IRB 100-4470A3, 104-2462A3, Tayvan bir hibe tarafından desteklenmiştir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| EDTA ile tedavi edilmiş tüpler | BD | ||
| DNA Ekstraksiyon Kiti | Stratagen | 200600 | |
| NanoDrop ND2000 spektrofotometre ve nbsp; | Thermo Fisher Scientific | NanoDrop 2000 | |
| Hassas Görev Silecekleri | Kimberly-Clark | Kimtech Science Kimwipes | |
| AmpliTaq Gold 360 DNA Polimeraz kiti | Uygulamalı Biyosistemler | 4398823 | |
| TTR gen intronik primerleri | Ekson1 | F: 5'-TCAGATTGGCAGGGATAAGC-3' | |
| Ekson1 | R: 5'-GCAAAGCTGGAAGGAGTCAC-3' | ||
| Ekson2 | F: 5'-TCTTGTTTCGCTCCAGATTTC-3' | ||
| Ekson2 | R: 5'-TCTACCAAGTGAGGGGCAAA-3' | ||
| Ekson3 | F: 5'-GTGTTAGTTGGTGGGGGTGT-3' | ||
| Ekson3 | R: 5'-TGAGTAAAACTGTGCATTTCCTG-3' | ||
| Ekson4 | F: 5'-GACTTCCGGTGGTCAGTCAT-3' | ||
| Ekson4 | R: 5'-GCGTTCTGCCCAGATACTTT-3' | ||
| termodöngüleyici | Uygulamalı Biyosistemler | GeneAmp PCR Sistemi 9700 | |
| elektroforez hücresi ve nbsp; | ADVANCE | Mupid-2plus | |
| DNA merdiveni | Protech | PT-M1-100 | |
| boya | BioLabs | B7021 | |
| AlphaImager EC | Alpha Innotech | AlphaImager EC | |
| otomatik sıralayıcı | Uygulamalı Biyosistemler | 3730xl DNA Analiz Cihazı |
Kaynaklar
- Planté-Bordeneuve, V., Said, G. Familial amyloid polyneuropathy. The Lancet Neurology. 10 (12), 1086-1097 (2011).
- Planté-Bordeneuve, V., et al. Long-term treatment of transthyretin familial amyloid polyneuropathy with tafamidis: a clinical and neurophysiological study. Journal of Neurology. 264 (2), 268-276 (2017).
- Nichols, W. C., Benson, M. D. Hereditary amyloidosis: detection of variant prealbumin genes by restriction enzyme analysis of amplified genomic DNA sequences. Clinical Genetics. 37 (1), 44-53 (1990).
- Lorenz, T. C. Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998(2012).
- Hsu, H. C., et al. Phenotypic expressions of hereditary Transthyretin Ala97Ser related Amyloidosis (ATTR) in Taiwanese. BMC Neurology. 17 (1), 178(2017).
- Barroso, F. A., et al. Long-term safety and efficacy of tafamidis for the treatment of hereditary transthyretin amyloid polyneuropathy: results up to 6 years. Amyloid. 24 (3), 194-204 (2017).
- Rapezzi, C., et al. Disease profile and differential diagnosis of hereditary transthyretin-related amyloidosis with exclusively cardiac phenotype: an Italian perspective. European Heart Journal. 34 (7), 520-528 (2013).
- Mariani, L. L., et al. Genotype-phenotype correlation and course of transthyretin familial amyloid polyneuropathies in France. Annals of Neurology. 78 (6), 901-916 (2015).
- Hammarström, P., Jiang, X., Hurshman, A. R., Powers, E. T., Kelly, J. W. Sequence-dependent denaturation energetics: A major determinant in amyloid disease diversity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, suppl 4 16427-16432 (2002).
- Johnson, M., Zaretskaya, I., Raytselis, Y., Merezhuk, Y., McGinnis, S., Madden, T. L. NCBI BLAST: a better web interface. Nucleic Acids Research. 36, Web Server issue 5-9 (2008).
- Fox, A. J., et al. Next generation sequencing for the detection of actionable mutations in solid and liquid tumors. Journal of Visualized Experiments. (115), (2016).
- Date, Y., Nakazato, M., Kangawa, K., Shirieda, K., Fujimoto, T., Matsukura, S. Detection of three transthyretin gene mutations in familial amyloidotic polyneuropathy by analysis of DNA extracted from formalin-fixed and paraffin-embedded tissues. Journal of the Neurological Sciences. 150 (2), 143-148 (1997).
- Ye, J., Coulouris, G., Zaretskaya, I., Cutcutache, I., Rozen, S., Madden, T. L. Primer-BLAST: a tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC Bioinformatics. 13, 134(2012).
- Green, M. R., Sambrook, J. Molecular cloning: A laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2012).
- Buckingham, L., Flaws, M. L. Molecular diagnostics: Fundamentals, methods, and clinical applications. , F.A. Davis Co. Philadelphia. (2012).
- Tan, S. C., Yiap, B. C. DNA, RNA, and Protein Extraction: The Past and The Present. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2009, (2009).
- Rapezzi, C., et al. Systemic cardiac amyloidoses: disease profiles and clinical courses of the 3 main types. Circulation. 120 (13), 1203-1212 (2009).
- Gertz, M. A., Dispenzieri, A., Sher, T. Pathophysiology and treatment of cardiac amyloidosis. Nature Reviews Cardiology. 12 (2), 91-102 (2015).
- Vrana, J. A., et al. Clinical diagnosis and typing of systemic amyloidosis in subcutaneous fat aspirates by mass spectrometry-based proteomics. Haematologica. 99 (7), 1239-1247 (2014).
- Nakamura, M., et al. Identification of a new transthyretin variant (Ile49) in familial amyloidotic polyneuropathy using electrospray ionization mass spectrometry and nonisotopic RNase cleavage assay. Human Heredity. 49 (4), 186-189 (1999).
- Ueda, M., Ando, Y. Recent advances in transthyretin amyloidosis therapy. Translational Neurodegeneration. 3, 19(2014).
- Brown, E. E., et al. Genetic testing improves identification of transthyretin amyloid (ATTR) subtype in cardiac amyloidosis. Amyloid. 24 (2), 92-95 (2017).
- Tasaki, M., et al. Rapid detection of wild-type and mutated transthyretins. Annals of Clinical Biochemistry. 53 (4), 508-510 (2015).
- Plante-Bordeneuve, V., et al. Diagnostic pitfalls in sporadic transthyretin familial amyloid polyneuropathy (TTR-FAP). Neurology. 69 (7), 693-698 (2007).
- Hsu, J. L., et al. A prospective, observational study of patients with uncommon distal symmetric painful small-fiber neuropathy. PLoS ONE. 12 (9), 0183948(2017).
- Salvi, F., Pastorelli, F., Plasmati, R., Bartolomei, I., Dall'Osso, D., Rapezzi, C. Genotypic and phenotypic correlation in an Italian population of hereditary amyloidosis TTR-related (HA-TTR): Clinical and neurophysiological aids to diagnosis and some reflections on misdiagnosis. Amyloid. 19, suppl 1 58-60 (2012).
- Suhr, O. B., Lundgren, E., Westermark, P. One mutation, two distinct disease variants: Unravelling the impact of transthyretin amyloid fibril composition. Journal of Internal Medicine. 281 (4), 337-347 (2017).
- Vilà-Rico, M., et al. Quantitative analysis of post-translational modifications in human serum transthyretin associated with familial amyloidotic polyneuropathy by targeted LC-MS and intact protein MS. Journal of Proteomics. 127, 234-246 (2015).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
