Yöntem makalesi

Rejenerasyon Stentor içinde çalışma yöntemleri

15.1K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/57759

⸱

13 Haziran 2018

 ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Biophysics, University of California San Francisco

Bu makalede

Özet

Dev ciliate, Stentor coeruleus, rejenerasyon çalışma ve iyileşmesi için mükemmel bir sistemdir. Biz Stentor hücre kültürleri tek hücreler veya hücre parçaları kuran, rejenerasyon kesme hücreleri tarafından inducing, kimyasal olarak membranellar bant ve sözlü aparatı, görüntüleme ve hücre analizi rejenerasyon inducing için yordamlar mevcut rejenerasyon.

Özet

Hücreler dış tedirginlikler kurtarmak için yerlerine yeniden gerekir. Tek hücreli ciliate Stentor coeruleus bir yara iyileşmesi çalışmaya mükemmel model organizma ve sonraki hücre yenilenmesini dir. Stentor genom Son zamanlarda, RNAi gibi modern moleküler biyoloji yöntemleri ile birlikte satışa sunuldu. Bu araçlar tek hücre yenilenme moleküler seviyede eğitim olanak sağlar. Protokol ilk bölümünü kurulması Stentor hücre kültürleri tek hücreler veya hücre parçaları, birlikte Stentor kültürleri korumak için genel kurallar içerir. Stentor büyük miktarlarda kültür Biyokimya, sıralama ve kütle spektrometresi gibi değerli araçlar kullanmak için izin verir. Sonraki bölümlerde iletişim kuralının Stentorrejenerasyon inducing için farklı yaklaşımlar kapsar. El ile kesme hücreleri bir cam iğneyle sükroz veya üre hücrelerle tedavi hücre ön sonunda bulunan belirli yapılara yenilenme eğitim izin verirken büyük hücreli parçaları, yenilenme eğitim sağlar. Evreleme ve rejenerasyon dinamiklerini analiz için bir bölüm birlikte görüntüleme bireysel Yenileyici hücreler için bir yöntem sağlanır. Rejenerasyon tüm süreci üç aşamalı olarak ayrılmıştır. Hücreleri aşamalarla nüfusu ilerleme dinamiği görselleştirme tarafından yenilenme zamanlamayla heterojenite gösterilmiştir.

Giriş

Hücreleri enzimler, ama bileşenleri dikkatle doğru boyutta ölçekli ve iyi tanımlanmış pozisyonlarda düzenlenmiş oldukça karmaşık makineler basit çanta değildir. Tek tek hücreleri morfogenez hücre ve gelişim biyolojisi anahtar bir işlemi temsil eder, ama onun Moleküler mekanizma bilinmeyen1,2. BLOB'ları kültürlü bazı hücreler benzer olsa da, tek hücreli organizmalar son derece ciliates3,4' te görülen karmaşık kortikal desenleri tarafından örneği mimarileri, karmaşık.

Belki de en uç iyi biçimde yapılandırılmış bir hücre Stentor coeruleus, dev heterotrichous ciliate uzaktan Tetrahymena ve amip ile ilgili örnektir. Stentor 1 mm uzunluğunda ve 100'den fazla boyuna çizgili mavi pigment tüm hücre uzunluğu çalıştırmak Mikrotubul şeritler Paralel Yığınlar tarafından düzenlenen kirpikler satır içeren alternatif ile kaplı. Hücre trompet-(Şekil 1), bir membranellar bandı ve onun ön uç ve arka tarafında substrat hücre ekler bir holdfast sözlü bir aparat (OA) ile biçimlendirilmiştir. Açık ön-arka polarite ek olarak, hücre Ayrıca silier satırlar arasında yavaş yavaş bir saat yönünde artış aralığı öyle ki kendine özgü bir kiral desenlendirme gösterir. Bu bir süreksizlik en geniş satır ve hücre yüzeyine, bu bölgenin birleştiği en dar satır sonuç şerit kontrast odağı bilinen, ön uç yapıları başka bir hücre5, aşılı ikinci dizi oluşumu tetikleyebilir resmen Spemann'ın Organizer'a eşdeğer yapma. Böylece, gelişim biyolojisi tüm önemli işlemleri kendi analogları Stentoriçinde var: axiation, desen oluşumu ve indüksiyon. Bir embriyo bu işlemler farklı hücreler arasında ama Stentorkader farklılıklar tarafından tahrik edilmektedir, onlar tek bir hücrede bulunan farklı bölgeler arasındaki farklar kader tarafından yönlendirilmesi gerekir. Ne Stentor berisi bölgeler arasındaki farkları tanımlayan bir muamma.

Stentor herhangi bir bölümünü kesilirse, hücre eksik parçası normal saatler hücrede vermeye yeniden oluşturabilirsiniz. Bir hücre ise yarısında veya bile daha küçük parçalar halinde kesilmiş her parça normal görünümlü ama daha küçük bir hücreye yeniden düzenler ve hücre bölümleri6,7arasında doğru orantı geri yükler. Hatta küçük parçaları, 1/64th orijinal hücrenin boyutu küçük ama normalde vücutlu bir hücreye yeniden ve o zaman için tam boy6büyümek edebiliyoruz. Stentor böylece genellikle doku veya tüm organizmalar düzeyinde uygulanan cerrahi yöntemlerle organel boyutu ölçekleme ve hücre büyüme düzenleme mekanizmaları incelemek için benzersiz bir fırsat sunuyor.

Stentor cerrahi operasyonlar geniş bir aralıktan yeniden izin veren özellikler tüm genom8yaklaşık 50.000 kopya ile tek nodulated macronucleus (Şekil 1) içeren biridir. Bir hücre parçası macronuclear en az bir düğüm içeren sürece tam olarak yeniden oluşturmak için yeteneğine sahiptir. Stentor' nın yenilenme yeteneği altında yatan başka bir müthiş yara iyileşmesi kabiliyetini özelliğidir. Birçok hücre tipleri onların yarası9iyileşme yeteneğine sahip olmakla birlikte, Stentor fiziksel tedirginlikler olağanüstü bir aralıktan kurtarmak yapabiliyor. Stentor10 sitoplazmik akışı görselleştirme için yöntemler ile birlikte ciddi bir pertürbasyon Stentor kurtarma örneği olduğunu daha önce bildirdi. Bu yöntemler sitoplazma fiziksel durumunu nasıl yaralama ve sonraki rejenerasyon etkiler çalışma izin.

Stentor' ın büyük boy, olağanüstü rejenerasyon yeteneği ve çoğu (örneğin, organizatörler, axiation ve desenlendirme) çok hücreli embriyo görüldüğü gelişimsel olayların bildirimlerini gerçek sırasında birçok gelişme biyologlar çekti yüzyılın son Thomas Hunt Morgan7de dahil olmak üzere. 50 's ve 60 's sırasında mikrocerrahi yaklaşımlar bu tek hücreli organizma11rejeneratif ve morfogenetik işlemlerinde şaşırtıcı bir dizi gösterdi. Ancak, Stentor bir moleküler biyoloji modeli sistem olarak yakın zamanda geliştirilmiştir. Son birkaç yıl içinde Stentor genom sıralı ve8monte ve gelişmiş12yöntemi yedirerek, RNAi kullanarak gen ekspresyonu huzursuz oldu.

Stentor modern moleküler biyoloji sadece bir model organizma içine geliştirilmiştir nedenlerinden biri son zamanlarda büyük kültürleri kendi uzun hücre döngüsü (3-5 gün) nedeniyle büyüyen zorluk oldu. Ancak, daha az malzeme onlar için kullanılan ve tek bir Stentor hücre hacmi bile tek analizi için geliştirilen NEMS yöntemlerine başvurmadan bu yöntemler için yeterlidir daha modern genomik ve proteomik Yöntemler gerektirir Stentorçok daha küçük olan hücreler. Bölüm 1 iletişim kuralının tek Stentor hücreden büyük bir kültür oluşturmak için yordam ayrıntıları. Aynı yaklaşım bir hücre kesim tarafından elde edilen bir hücre parçası büyük bir kültür oluşturmak için kullanılabilir. Bölüm 1 da uzun süreler sağlıklı Stentor kültürleri korumak için yönergeler sağlar. Bölüm 2 Protokolü'nün hücreleri el ile bir cam iğne ile kesim tarafından hücre yenilenmesini inducing için yöntemler sağlar. Bölüm 3 iletişim kuralının belirli hücre yapıları (membranellar band ve oral aparatı) yenilenme inducing iki yöntem adamıştır: sükroz veya üre hücrelerle tedavi yol açar ve ardından bu yapılar, dökülme için onların rejenerasyon. Bölüm 4 iletişim kuralının tek tek hücreleri Yenileyici görüntüleme üzerinde uzun süreler için bir yöntemi ayrıntıları. Bölüm 4 rejenerasyon ve ipuçları rejenerasyon dinamiklerinin Analizi aşamalarında açıklaması ile sona erer.

Protokol

1. kültür Stentor ve tek hücre veya hücre parçaları Stentor kültürler oluşturma

  1. Chlamydomonas reinhardtii kültür Stentorgıda olarak kullanılmak üzere hazırlayın.
    1. Chlamydomonas reinhardtii hücreleri ticari bir tedarikçiden (Tablo reçetesi) edinin.
    2. Chlamydomonas reinhardtii 500 mL sıvı kültürünün steril tekniği13kullanarak ticari olarak mevcut musluk medyada kurmak.
    3. Chlamydomonas kültür altında bir lamba Doygunluk (at doz yaklaşık 1) yakınındaki bir konsantrasyon haftada iki kez dokunun medya ile sulandrarak tutun.
      Not: Chlamydomonas kültür bir shaker üzerinde yetiştirilen olabilir.
    4. Düzenli olarak Chlamydomonas kültür kültür bir damla bir slayt üzerinde bir coverslip ile kapsayan koyup 40 X büyütme, mikroskop altında kontrol sağlıklı olup olmadığını denetleyin.
      Not: kültür bakteri ile kontamine yoksa Chlamydomonas hücreleri kümeler halinde toplanan Stentor beslenmesi için kullanmayın. Bu sorunların her iki durumda da yeni bir Chlamydomonas kültür başlatın.
  2. Stentor coeruleus hücreleri ticari bir tedarikçiden (Tablo reçetesi) edinin.
  3. Stentor hücreleri onların doğal habitat gerekiyorsa, gölet, göl veya nehir11koleksiyon yapıyorum.
    1. Gölet, göl veya nehir Stentor toplamak için suyun nispeten sakin, gölgeli ve açık olduğu bir alan bazı bitki örtüsü ile bulmak.
      Not: Burada duckweed büyür adreslerde Stentor bulma daha yüksek bir olasılık vardır.
    2. En az 2 lt su pour kolaydır bir kap içinde toplamak.
    3. Döküntü ve partiküler madde kabın altına yerleşmiş sonra yavaşça Stentorbirkaç saniye sonra her koleksiyonu büyük konteyner yerleşmek döküntü için bekleyen için incelemek için birkaç küçük kaplar doldurun.
    4. Örnekleri topluluğu bir konumda tamamlandıktan sonra en az 10 metre uzaklıktadır yeni bir konuma geçin ve orada örnekleri topluluğu.
      Not: birden fazla gölet tatmak zorunda kalabilirsiniz Stentor Vaha'da her gölet bulunmaktadır.
    5. Örnekleri ile laboratuvara dönmek ve su kaplarından bireysel Petri yemekler aktarın.
    6. Her kabında Stentor için bir stereomicroscope 5 X büyütme, eğik ışık altında arayın. Piyasada bulunan pastörize kaynak suyu (PSW) en az 100 µL içeren bir cam spot levha bir kuyunun içine 1 mL pipet kullanarak tek tek Stentor hücreler aktarın.
      Not: bir substrat (Şekil 1) bağlandığında bir trompet gibi şekil Stentor hücreleri var. Yüzme Stentor bir substrat (Video 1) bağlı hücreler daha az genişletilmiş hücrelerdir.
    7. Stentor PSW en az 3 yıkama x. Kuyuda Stentor hücreleri tutarak kuyudan su yaklaşık yüzde 90'ını kaldırarak yıkar gerçekleştirmek PSW 500 µL kuyunun içine ekleyerek izledi.
      Not: pipetler pipet ipuçları 10 µL veya daha küçük ile kullanarak Stentor tutmadan önce yaklaşık 0,5 mm pipet ucu hücreleri aracılığıyla büyük hücreli akar gibi oluşturulan kesme kuvvetleri nedeniyle yaralama önlemek için makas ile sonu kapalı kesmek çok küçük bir ipucu op ening.
  4. Chlamydomonas her Stentorbesleme önce hazırlayın.
    1. Chlamydomonas kültür 1.5 mL microcentrifuge tüp içine adım 1.1 olduğu gibi hazırlanan 1 mL aktarın. 2,095 x g 3 dk de santrifüj kapasitesi.
    2. Süpernatant kaldırmak ve Pelet PSW 1 mL resuspended. 2,095 x g 3 dk. Kaldır süpernatant de santrifüj kapasitesi ve Pelet PSW 500 µL içinde resuspend.
      Not: Böylece, yıkanmış ve konsantre Chlamydomonas "Chlamydomonashazırlanan" aşağıdaki adımlarda sevk edilecek. DOKUNUN medya önce Stentor besleme önemlidir böylece Chlamydomonas yıkama Stentoriçin zararlı olduğunu.
  5. Klonal Stentor kültür gerekirse kültür tek bir Stentor hücre veya bir hücre parçası başlatın.
    1. Bu yana tek Stentor hücreleri de PSW büyümek değil, klimalı ortam medya bir varolan, sağlıklı Stentor kültüründen 500 µL sterilize filtre hazırlayın.
    2. Klimalı ortam 500 µL bir cam spot levha kuyu birine aktarın.
    3. Bir Stentor şartına ortamı içeren cam spot kalıbının kuyuya aktarın. Transfer yapmak için mümkün olduğunca küçük orta olarak kullanın.
    4. Hazırlanan Chlamydomonas her Stentor 5 µL her 48 h besleme. Stentor böldüğünüzde, iyi hücreleri saymak ve hazırlanan Chlamydomonas hücre başına 5 µL ekleyin.
    5. Hücrelerin ışıkta (örneğin, şeffaf plastik kutular kağıt havlu ile kaplı) duyarlı olduğundan Stentor gölgeli bir yerde saklayın.
    6. Taze şartına orta her 96 h ile iyi Stentor ortam değişimi.
      1. Adım 1.5.1 olduğu gibi temiz klimalı ortam hazırlamak.
      2. Tüm Stentor hücreler sıvı yukarı ve aşağı kuyuda pipetting hafifçe tarafından kuyunun dibinden bağlantısını kesin olun.
      3. Dikkatle de kullanarak tüm hücreleri kuyuda kalır emin bir 1 mL pipet sıvı Aspire edin. Taze şartına medya 500 µL kuyuya ekleyin.
    7. İyi hücre sayısı 20 aşarsa, hücreler daha büyük konteyner için örneğin, bir geniş ağız cam kavanoz geçiş yapar.
      1. Bir autoclaved geniş ağız cam kavanoza PSW 20 mL ekleyin.
        Not: Cam Stentor için ısıyla dikkatli yıkama ve durulama ile değiştirilebilir.
      2. Dikkatli bir şekilde medya yukarı ve aşağı kuyunun tüm hücrelerden ayırmak için iyi pipette. 1 mL pipet ucu kullanarak tüm Stentor hücreleri toplamak ve hafifçe cam sürahi aktarmak.
    8. Kültürlerle yeterli hava erişmesine izin vermek için Stentor , kavanoz kapakları sıkın değil.
    9. PSW kavanoz her 48 h Stentor yoğunluğu yaklaşık 20 hücre/mL tutmak için ekleyin. Hücre yoğunluğu göz tarafından tahmin ediyoruz.
      Not: Alternatif olarak, 1 mL pipet kabarcık hava için kavanoza duvarlarından pipet kültür, 1 mL kadar bağlantısını kesin ve Pipet Ucu hücreleri saymak hücreleri olun
    10. Her 48 h, yem Chlamydomonas Stentor kültürler (bkz. Adım 1.4) kavanoz hazır. Kültür ile hazırlanan Chlamydomonas200 µL besleme ile başlayın. Kültür hacmi arttıkça, yavaş yavaş hazır Chlamydomonas ilâ 1 mL beslemek için kullanılan miktarını artırın.
    11. Kültür birimi jar'ın kapasitesi yaklaşık yüzde 90'ını ulaştığında kültür daha büyük bir kaba aktarın.
      1. Kültür kavanoz içinde yukarı ve aşağı, camdan Stentor ayırmak için 1 mL pipet ile pipette.
      2. Kavanoz tüm içeriğini 2 bardak cam kap içine dökün.
      3. Yaklaşık 25 mL PSW kalan Stentortoplamak için 2 su bardağı cam kaba olan durulayın.
  6. 2 bardak Cam kaplarda sağlıklı kültürleri korumak.
    1. Stentor kültürler hazırlanan Chlamydomonas Kültür 100 mL başına 2 mL her 4-5 günde besle. PSW Stentor yoğunluğu yaklaşık 20 hücre/mL tutmak için her 4-5 gün cam kaba ekleyin.
      Not: 450 mL 2-cup kapsayıcı tutan en fazla birimdir.
    2. Haftada bir kez, kültürler diseksiyon mikroskop Wrotek, mantar ve diğer büyüme için X 5 altında inceleyin. Sağlık Kültür uzatmak için bulaşıcı mikroorganizmalar ile birlikte anormal şekilli ve renksiz Stentor hücreleri 1 mL pipet kullanarak kaldırın.
    3. Cam kap %90 dolu olduğunda, kültür bölün.
      1. PSW 25 mL Cam kaba ekleyin. 25 mL pipet pipet yukarı ve aşağı Stentor camı ayırmak için kullanın. Yeni bir 2 bardak cam kap içine taşımak hakkında %50-kültür.
      2. Her iki kültürler için 25 mL PSW ekleyin ve iki kültür iletişim kuralının bu bölümde açıklandığı gibi korumaya devam etmeyi planlıyor.
        Not: Stentor hücreleri yüksek sıcaklığa duyarlı olduğundan, kültürler saklandığı Oda sıcaklığı 25 ° C veya daha düşük korumak. Alternatif olarak, kültürlerin bir kuluçka makinesine tutulabilir. Stentor kültür sorun giderme için Tablo 1 ' e bakın.

2. inducing rejenerasyon kesme Stentor hücreleri tarafından

  1. Kılcal tüpler gibi program kullanarak üzerinden birkaç iğne yapmak için bir iğne çektirmenin kullanın: ısı - 735, çekme - 100, hız - 110, zaman - 150, basınç - 400.
  2. PSW 50 mL % 4 methylcellulose çözeltilerine hazırlayın.
    1. Methylcellulose 1 g ekleyin (viskozite: 1500 cP) PSW 50 ml.
    2. Methylcellulose dağılması kolaylaştırmak en az 8 h için 4 ° C'de kuluçkaya.
    3. %4 methylcellulose çözüm oda sıcaklığında tutmak.
  3. Bir cam spot levha kesim gerçekleştirdikten sonra hücre parçaları saklamak için hazırlayın.
    1. Filtre sterilize sağlıklı bir kültür, 500 mL Cam spot levha de gerekli başına ortamdan.
    2. 500 mL steril ortam her gerekli Wells aktarın.
  4. (Tanımlanmış trompet şekli, canlı mavi-yeşil renk ve hiçbir büyük boşluklara sahip) bir sağlıklı Stentor 2 µL damlacık içinde toplamak ve bir coverslip veya slayt üzerinde yerleştirin. 2 µL % 4 methylcellulose (Şekil 2) ekleyin. Stentor (Video 2) kesmeden önce sakin ol bırak.
  5. Cam iğne iğne kırılma önlemek mümkün olduğunca kesme yüzeyine paralel olarak tutun.
  6. Bir stereo diseksiyon mikroskop kullanarak, cam iğne ucu bulun ve taşımak daha yakın hücreye (Şekil 3A). Stentor sözleşme temas üzerine iğne (Şekil 3B ve C) ile gözlemlemek.
    Not: ön sonunda zor posterior ucundan ayıran yapar bir yönde hücreyse çok yavaşça iğneyi tarafıyla döndürün.
  7. Cam iğne yan ile sözleşmeli Stentor üzerinde iki hücreyi kesmek için hafifçe bastırın(şekil 3D ve E, Video 3). İki parça parça füzyon önlemek için aralarında sitoplazmik hiçbir bağlantı sağlamak ayrı hareket (Şekil 3F).
  8. Her iki parçaları en az bir macronuclear her parçaları eğik aydınlatma diseksiyon mikroskop altında incelenerek donanıma sahip olup olmadığını kontrol edin.
    Not: en az bir macronuclear düğüm olan hücre hayatta kalmak için gereklidir. Hücre mavi-yeşil pigment ile birlikte onun film tabakası (şeffaf kabuk) sırasında veya sonrasında kesme dökmek. Çoğu durumda, bu hücrenin uzun vadeli canlılığı etkilemez.
  9. Parçaları adım 2.3 hazırlanan bir cam spot levha kuyu içine taşıyın.
  10. Kesme hücreleri bir kısmını değil yenileyecek çünkü birden çok hücre kesmek.
  11. Bir oturumda birden çok kesim yapmak Eğer cam iğne yerine ağır Stentor kalıntı veya ucu kırık ne zaman ile kaplı olur. Alternatif olarak, iğne silikon spacer bir parçasına nazikçe silerek temizleyin.
    Not: Cam iğneler birden çok hücre kesme oturum için kullanılabilir.
  12. Hücre parçaları ile cam spot levha nem odasında tutun.
  13. Bölüm 4 görüntüleme hakkında ayrıntılı bilgi için iletişim kuralı ve Stentor rejenerasyon sonuçları yorumlanması için devam edin.

3. Membranellar grubu ve sukroz veya üre tedavisi Oral aparatı rejenerasyon inducing

  1. Sükroz kullanarak Membranellar band ve oral aparatı kaldırma
    1. Sükroz PSW içinde % 25 çözeltisi hazırlamak.
    2. % 25 sukroz 500 µL ek kapaklı bir microcentrifuge tüp içinde PSW ekleyin.
    3. 3 microcentrifuge tüpler PSW 1 mL her tüp ile ek kapaklar ile hücreleri sükroz tedavi sonrası yıkama için hazırlayın.
    4. 30-60 Stentor hücreler kültür ortamlarına 1 ml 1 mL pipet (Şekil 4, ok A) kullanarak bir ayrı microcentrifuge tüp içine toplamak.
    5. Tüm hücreleri 200 µL pipet tek beraberlikle kullanarak 125 µL son hacim tüpte toplamak. Onları (3.1.2 adımda hazırlanan) % 25 sukroz 500 µL ile tüp 625 µL % 20 sükroz çözüm (Şekil 4, ok B) elde etmek için transfer. Bir kronometre başlatın.
    6. Bu % 20 sükroz çözüm ve fiske-spin raf için 1 dk microcentrifuge tüpte Stentor kuluçkaya.
    7. Tek bir beraberlik tüm hücrelerde toplamak (daha kolay koleksiyonu için 200 µL maksimum kapasite için pipet ayarlayın).
    8. Kronometre sükroz tedavi 2 dk gösterir kadar hücreleri pipet ucu tut.
    9. Bir adımda 3.1.3 (Şekil 4, ok C) hazırlanan microcentrifuge tüpler içine Stentor çıkarma. Fiske-spin tüp raf.
    10. İki kez daha, bir kez her microcentrifuge tüpler PSW içeren kalan iki adım 3.1.3 (Şekil 4, okları D ve E) hazırlanan hücreleri yıkayın.
      Not: Tek beraberlik hücre toplama tekniği yıkar arasında önemli değildir.
    11. Bölüm 4 görüntüleme hakkında ayrıntılı bilgi için iletişim kuralı ve yorumu Stentor rejenerasyon dinamiklerinin (Şekil 4, okları F ve G) için devam edin.
  2. Üre kullanarak Membranellar band ve oral aparatı kaldırma
    1. PSW %4 üre çözeltisi hazırlamak.
    2. 300 µL % 4 üre ek kapaklı bir microcentrifuge tüp içinde PSW ekleyin.
    3. 3 microcentrifuge tüpler PSW 1 mL hücreleri üre tedaviden sonra yıkamak için her tüp içeren ek kapaklar ile hazır olun.
    4. 30-60 Stentor hücreler kültür ortamlarına 1 ml 1 mL pipet (Şekil 4, ok A) kullanarak bir ayrı microcentrifuge tüp içine toplamak.
    5. Tüp içinde 300 µL son Hacim 1 mL pipet tek beraberlikle kullanarak tüm hücreleri toplamak. Onları 300 µL % 4 üre (3.2.2. adımda hazırlanan) ile tüp 600 µL % 2 üre çözüm (Şekil 4, ok B) elde etmek için transfer. Bir kronometre başlatın.
    6. Bu % 2 üre çözüm ve fiske-spin raf için 1 dk microcentrifuge tüpte Stentor kuluçkaya.
    7. Tek bir beraberlik tüm hücrelerde toplamak.
    8. Kronometre üre tedavi 2 dk gösterir kadar hücreleri pipet ucu tut.
    9. Bir adımda 3.2.3 (Şekil 4, ok C) hazırlanan microcentrifuge tüpler içine Stentor çıkarma. Fiske-spin tüp raf.
    10. İki kez daha, bir kez her microcentrifuge tüpler PSW içeren kalan iki adım 3.2.3 (Şekil 4, okları D ve E) hazırlanan hücreleri yıkayın.
      Not: Tek beraberlik hücre toplama tekniği yıkar arasında önemli değildir.
    11. Bölüm 4 görüntüleme hakkında ayrıntılı bilgi için iletişim kuralı ve yorumu Stentor rejenerasyon dinamiklerinin (Şekil 4, okları F ve G) için devam edin.

4. görüntüleme ve hücre yenilenmesini analiz

  1. İdam dik bir mikroskop kullanarak kullanıyorsanız görüntü yeniden oluşturulmasını tek tek hücreler için damlacık yöntemi.
    1. PSW 100 µL cam spot kalıbının kuyuya koymak.
    2. Kültür ortamının (içinde bulundukları ortam) 4 µL 1 Stentor hücrede izole, 10 ya da 20 µL kullanarak pipet. 22 x 22 mm2 coverslip (Şekil 5) ortasında damlacık Kasası.
      Not: hücreleri bu 1) sağlıksız olup olmadığını (anormal şekilli veya ağır vacuolated) ya da 2) hala membranellar bant veya oral için aygıtlar (kimyasal tedavi deneyleri için) varsa, görüntüleme için kullanmayın.
    3. Stentor 4 daha fazla damlacıkları önceki damlacık çevresinde kültür medyada damlacıklar arasında yeterli boşluk bırakarak düzenleyin.
    4. Coverslip damlacıkları ile ters çevir ve hafifçe PSW adım 4.1 içinde eklendiği cam spot levha kuyusu üzerine getirin.
    5. Not: PSW iyi (Şekil 5) damlacıkları buharlaşma en aza indirmek olacaktır.
    6. Kalan hücreleri adımları 4.1.1 - 4.1.4 izleyerek görüntüleme için hazır olun.
    7. İstediğiniz zaman çözünürlüğü ile mikroskop altında Yenileyici hücreleri görüntü. Alternatif olarak, bir diseksiyon stereo mikroskop kullanarak rejenerasyon gözlemlemek.
      Not: Hücre kesme veya sukroz veya üre ile tedavi hemen sonra yeniden oluşturma işlemi başlar. Ancak, görünür yeni ağız yapıları yeniden oluşturma işlemi başlangıç sonra yaklaşık 3 h oluşturacak.
  2. Her zaman noktası için yeniden oluşturma işlemi etapları birini her hücreye atayın. Bunu yapmak için her hücreye aşamaları (Şekil 4 ve Şekil 6) gösteren temsili resim karşılaştırın.
    1. Aşama 1 bir membranellar Grup henüz (Şekil 6A) var mı hücrelere atayın.
    2. Stage 2 membranellar grubu ile hücrelere atayın.
      Not: Bir membranellar Grup 3-6 h (Şekil 4, Şekil 6B) tedaviden sonra görünür. Sadece bir oral primordium görüntülenmeden önce bu sahne çok sonunda membranellar grubun posterior sonuna ek bir eğimi görünür.
    3. Stage 3 bir oral primordium hücrelerle atayın.
      Not: Bir oral primordium 6-8 h membranellar grubu (Şekil 4, Şekil 6C ve 6 D) posterior sonundaki tedaviden sonra görünen bir invagination var. Hücreleri ön bitiş ve karakteristik trompet hücre şekil (Şekil 4, Şekil 6E) adlı bir membranellar orkestra varken yeniden oluşturma işlemi tamamlandı. En Stentor hücreler tamamen yenilenme başlangıcından bu yana içinde 8-9 h yeniden oluşturulur.
  3. Her birine bir yığın kutu arsa (Şekil 7) şeklinde her zaman için yeniden oluşturma işlemi aşamaları yüzdesi arsa.
    Not: Bu tür bir arsa Vaha'da hücreleri rejenerasyon dinamiklerinin görselleştirme sağlar.

Sonuçlar

Stentor kültürler güvenilir bir şekilde kurulan ve tek tek hücreler veya hücre parçaları Bölüm 1 iletişim kuralı kullanılarak saklanır. Büyük bir sağlıklı kültürün temsilcisi örnek Video 1' de gösterilen.

Zamanlı kurs rejenerasyon yenilenme adım 3.1, görüntüleme ve analiz yöntemi Bölüm 4 (Şekil 7) ele birlikte özetlenen başlatmak için sükroz tedavi yöntemini kullanarak Stentor ölçülmüştür. Bu arsa bir saat süren formaya hücreleri nüfus tarafından belirli herhangi bir sahne ulaşmak için geçen süre içinde olduğunu gösterir. Bu tür bir analiz hücreleri yenileyici bir nüfus yenilenme işleminde geçici heterojenite çalışma sağlar.

Şu ana kadar sükroz tedaviler (Şekil 4 ve Şekil 6) düzinelerce sonra gözlenen rejenerasyon zamanlama özeti aşağıdadır. Stentor hücreleri (Bu aşamada hemen sükroz fiyasko sonra başlar) herhangi bir membranellar grup olmadan yaşlar gibi baktığımda 1 aşamasıdır. Bir membranellar grup görünüp (sukroz tedaviden sonra 3-6 h) yetişen 3-6 h. Stage 2 için bu aşamada sürer. 3-4 h. Stage 3 bir oral primordium membranellar grubu (sukroz tedaviden sonra 6-8 h) posterior sonunda görünür ve her iki yapılar ön hücrenin sonuna doğru taşınır için bu aşamada sürer. Bu sahne için 1-2 saat sürer. Membranellar band ve sözlü aparatı hücrenin ön sonuna erişildiğinde, bu yeniden oluşturma işlemi tamamlandığında belirtti. Hücre karakteristik Stentor trompet benzeri şekli kabul etmiştir. Hücreleri tamamen rejenere 8-9 h sükroz tedaviden sonra vardı.

Membranlar bantlı paramesyum diyagramı, oral aparat, gıda kofulu, makronükleus işaretli.
Şekil 1. Anlık görüntüsünü Stentor. Membranellar bant ve sözlü aparatı hücre ön sonunda gösterilir. Holdfast hücrenin arka sonundadır. Stentor macronucleus nodulated olduğunu. İyi beslenmiş Stentor yeşil gıda çoğunlukla Chlamydomonasiçeren boşluklar vardır. Ölçek çubuğu olduğunu 0.5 mm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Diseksiyon mikroskobu kurulumu; Biyoloji araştırmalarında gözlem için Stentor örnekli cam slayt.
Şekil 2. Stentor kesme set-up. Hücre kesme el ile piyasada bulunan bir diseksiyon stereo mikroskop kullanarak hücre, bakarken bir cam iğne işleyerek gerçekleştirilir. Kağıt mendil amacı hücreleri daha iyi görmek için beyaz arka plan sağlamaktır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Mitotik süreçteki aşamaları gösteren, AF olarak işaretlenmiş bölünen hücrelerin mikroskopi dizisi.
Şekil 3. Anlık görüntülerini Video Stentor cam iğne ile kesmek için nasıl gösteren 3. Hemen iğne dokunana önce(a)A Stentor . (B) A Stentor yavaşça bir iğne ve cam slayt arasında sıkışmış. (C) A iğne gücüne tepki Stentor sözleşmeli. (D) A Stentor yavaşça iğneyi tarafı ile cepten basarak kesilmiş. (E) A Stentor şimdi ikiye ama değil ayrılmış. (F) iki Stentor parçaları. Ölçek çubuğu olan 0,25 mm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Sükroz/üre şok adımları, santrifüj tüpleri, hücre aşamaları ile stentör rejenerasyon süreci diyagramı.
Şekil 4. Bölüm 3 ve Bölüm 4 Protokolü'nün şematik görselleştirme. Bu sükroz veya üre tedavisi ve hücre yenilenmesini gözlenmesi gerçekleştirmek için resimli bir protokoldür. Alt panelinde belirtilen zaman yıkama 1 başından itibaren ölçülür. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Diseksiyon mikroskobu kurulumu, 9 oyuklu spot plakası, mikro damlacık reaksiyonunun analizi, optik çalışma.
Şekil 5. Kurulum rejenerasyon dik bir mikroskop ile görüntüleme ve/veya doğrudan gözlem için. Coverslip asılı her 4 µL damlacık içinde bir hücre yenilenme geçiren vardır. Cam spot levha kuyu su damlacıkları buharlaşma sınırlar. Paralel olarak birden çok hücre yenilenme takiben bu kurulum verir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Bitki hücre yapısı analizi; mikroskop görüntüleri A-E; Hücre morfolojisi varyasyonlarını vurgulayın.
Şekil 6. Stentor anlık görüntülerde her aşamasında membranellar bant ve sözlü aparatı rejenerasyon. (A)sahne 1 bir gözyaşı damlası gibi hücre şekil ve membranellar grup yokluğu ile karakterize. (B) sahne 2 membranellar Grup, sürekli atıyor kirpikler tabanlı yapısı görünümünü tarafından karakterizedir. Membranellar bantları panelleri B beyaz kesikli çizgilerle işaretlenir - ö. (C ve D) Aşama 3 oral primordium (bir okla işaretli) görünümünü ile karakterizedir. Oral primordium membranellar grubun posterior sonunda bir invagination gibi görünüyor. Oral primordium sonra hücreyi ön doğru sözlü aparatı olmak yukarı taşıyın. Hücre karakteristik Stentor trompet benzeri şekli benimsemiştir ve sözlü aparatı (bir okla işaretli) hücre ön sonunda büyümüştür (E) yeniden oluşturma işlemi tamamlanır. Ölçek çubuğu olan 0,25 mm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Hücre aşaması dağılım çubuğu grafiği, sakaroz şoku sonrası zaman, 9 saat boyunca dört aşamayı gösteriyor.
Şekil 7. Kutu arsa gösteren yığılmış nasıl oranlar hücre yenilenme sükroz tedaviden sonra tüm evrelerinde değiştirir zamanla. Arsa yeniden oluşturma işlemi aşamaları Yenileyici hücreleri nüfusu içinde zamanlaması heterojenlik gösterir. "Trafiğe çıkış son" yenilenme tamamlanması gösterir. Hücre sayısı: 28. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Laboratuvar deneyinde fotosentez çalışması için yeşil alg kültürüne sahip beher.
Video 1. Örnek bir sağlıklı Stentor kültür. Bir kültür Bu konsantre ise, genellikle, kültür bölme önerilir. Bu videoyu izlemek için lütfen buraya tıklayın. (İndirmek için sağ tıklatın.)

Mikroskop altında damla; sıvı yüzey gerilimi çalışması; mikroskopi yöntemi; eğitim analizi.
Video 2. Stentor methylcellulose ile yavaşlama. Bu videoyu izlemek için lütfen buraya tıklayın. (İndirmek için sağ tıklatın.)

İnce bir tel üzerinde damlacık konumlandırmasını vurgulayan mikroakışkan bir kurulumun mikroskobik görüntüsü.
Video 3. Kesme Stentor. Tek tek hücreleri el ile mikroskop hücre cam iğne basarak anatomi bir stereo altında birden fazla parçalara kesilebilir. Bu videoyu izlemek için lütfen buraya tıklayın. (İndirmek için sağ tıklatın.)

Kültür ile sorunMuhtemel çözümüMümkün önlenmesi
Kültür Wrotek veya diğer büyük organizmalar tarafından boğulmuş olduğunu.Çok sayıda Stentor mümkün olduğu yeni bir kültür tabak içine kaldırın. Sonra hücreleri üç kez yıkayın.Stentor onları, ne zaman bile onları ticari bir tedarikçiden satın alırken iyice yıkayın.
Kültür mantar veya diğer küçük organizmalar tarafından boğulmuş olduğunu.Bir köşe tanımlamak vardır en azından Stentor. O bölgede birçok Stentor kaldırmadan mümkün olduğu kadar medya kaldırın ve yeni PSW ekleyin. Yavaşça ama iyice distrubute için istilacı organizmaların karıştırın. Sonraki besleme atlayın ve Stentor onları yemek.Kültür düzenli olarak gözlemlemek ve medya için taze PSW değiş tokuş ederek küçük kirletici maddeleri kaldırın.
Stentor birbirinin üstüne atma.Konsantrasyonu 20'den az hücre/mL olması kültür bölün.Kültürler daha sık bölün.
Stentor hücreleri çiftleşme.Her 5 günde yerine her 4 günde besle.
Kültür karanlık atık malzemenin bir yeri vardır.Çok karanlık malzemenin hücreleri çıkarmadan mümkün olduğunca Stentor atık olmaktan çıkarın. Stentor karanlık malzeme iliştirilmişse, yukarı ve aşağı kendi atık Stentor hücrelerden serbest bırakmak ve sonra hücreleri çıkarmadan medya ile atık kaldırmak için pipet. Veya, bu Stentor kaldırmak ve buna göre yem daha az.Besleme Stentor daha az yemek kültürünün 100 mL başına 1 mL.
Sağlıksız seyir (vacuolated/davul gibi şişmiş veya yuvarlak) Stentor. Birçok Stentor hücreleri çıkarmadan mümkün olduğu kadar medya kaldırın ve yeni PSW ekleyin.Medya düzenli olarak değişimi.

Tablo 1. Stentorkültür için sorun giderme kılavuzu.

Tartışma

Stentor kültür sorunları bir dizi sunuyor. İlk olarak, çok sayıda hücre gerektirir deneyler gerçekleştirmek için bir çok sayıda Stentor kültürlerin Stentor konsantrasyon 20 hücre/mL aştığında sağlıksız hale kültürler korumak gerekiyor. İkinci olarak, Stentor kültürler kez kontamine organizmalar Stentor daha hızlı Böl ve (ortak bir kirletici Wrotek 's) kültür korkutur. Böylece, düzenli olarak kültür bir mikroskop altında incelemek ve kirletici kaldırmak gereklidir. Zaman zaman, yeni bir kültür hücreleri el ile kirlenmiş bir kültürden kurtardım az sayıda üzerinden yeniden başlatılması gerekiyor. Bu sağlıklı Stentor kültürleri korumak için gereken süreyi artırır. Üçüncü olarak, tek bir hücre 400 mL kültür genişleyen Stentor hücre döngüsü 3-5 gün olduğundan en az bir ay gerektirir. Dördüncü olarak, başka bir model aksine ciliates, Stentor nadiren kist formuna gidin ve onlar dondurulamaz.

Stentor kültürü çalışmalarının önemli bir yönü bir uygun gıda organizma seçimidir. Stentor kültür için çeşitli yöntemler daha önce tarif edildi. Onlardan biri olan Stentoryem kültür bakteriler için yağsız süt kullanmayı göstermektedir. Böyle bir tekniği Stentorkültür etkilidir; Ancak, genomik tekniklerin uygulanması tanımsız gıda organizmalar genomik Okunma kaynaklanan karışıklığı önlemek için saf örnekleri gerektirir. Geçerli iletişim kuralını kullanarak, Stentor kitle yetiştirilir ve sıralı yemeklerini Chlamydomonas, çünkü gıda organizma genomik kirlenme varlığı algılanabilir ve için kontrollü. Bilinmeyen nedenlerden dolayı Tartar Stentor önce nerede bulduğunu için döndürerek hisselerini doldurmak zorunda. Geçerli protokol ile biz yıllardır Stentor yetişmek mümkün olmuştur.

Rejenerasyon deneyler Stentor ile genellikle basit ama akılda tutulması gereken birkaç kritik bilgi vardır. Bölüm 2 açısından Stentor kesme hücreleri yarım dakika içinde hakim. Stentor daha gelişmiş mikrocerrahi prosedürleri mastering pratik bir hafta gerektirebilir. Süre sükroz veya üre tedavisi (Bölüm 3) görüntüleme başında en hücreler hala onların membranellar grup varsa, performans, 10-30 s otelde sükroz tedavi sonraki gerçekleştirilir için kuluçka süresini artırmak. Hücre ölümüne neden olur çünkü sükroz tedavi 3 dk kuluçka dışında zaman artırmak değil.

Stentor Imaging rejenerasyon uzun süreler görüntü büyük hücrelere yöntemleri gerektirir. Bölüm 4'te ayrıntılı görüntüleme yöntemi yalnızca dik bir mikroskopla kullanılabilir. Daha sonra ters bir mikroskop yerine kullanılabilir durumdaysa, hücreleri bir slayt veya coverslip küçük odalarında yerleştirilebilir. Vazelin ve kapak odadan buharlaşma önlemek için başka bir coverslip oluşturmak için bir yöntemdir. Alternatif olarak, tek bir hücre için bir oda istediğiniz boyuta delik bir 1 x 1 cm2 silikon rondela kare ile bir delik yaparak yapılabilir (malzemeler tablo), yer açıcı bir coverslip yerleştirerek, hücre odasında koymak ve odası ile başka bir coverslip kapsayan. Imaging, Stentor rejenerasyon her aşamasının karakteristik özellikleri gözlemlemek için doğru yönde değilseniz, sıkıca hücre sözleşme yapmak için plaka dokunun. Hücre yenilenme aşamasında tanımlamak için uzatmak seyretmek (tam çekiş alır yaklaşık 45 s). Hala yanlış yönde hücreyse, dokunarak tekrarlayın. Şekil 1 ve Şekil 6 ' da gösterilen görüntüleri stereo zoom mikroskop tarafından alındı; Ancak, tüm deneylerin ayrıntılı stereo mikroskop dissekan X 5 kullanılarak gerçekleştirilebilir.

Kültür ve Stentor Imaging yanı sıra başka bir yeniden oluşturma işlemi, özellikle zaman aşamalarında tanımlamak gerekli miktarı izleme mücadeledir. Yenileyici hücre mükemmel oral primordium açıkça görünür bölge ile odaklı ise, sahne alanı'nın kimlik birkaç saniye sürer. Bazen, ancak, Stentor hücre yenilenme aşamasında, böylece tanımlamak için daha fazla zaman ayırdığınız açık atama engelleyen bir yönde olduğunu. Tek tek hücreleri Yenileyici miktar böylece evreleme ve beklemek gözlemci gerektiren geçici hassas azalan Yenileyici hücrelerin tümünü geciktirebilir sahne ve bu hücreyi taşındı yeniden görüntü için gereken süre önemli miktarda Yeni bir yönelim. Sonuç olarak, bu zaman ve emek yoğun deneydir. Bu nedenlerden dolayı bu Stentor hücreleri tespit ve rejenerasyon video mikroskobu verilerdeki aşamalarında atama için otomatik yöntemleri geliştirmek için son derece cazip olacaktır. Bunlar da daha tekrarlanabilir deneyler için sağlayacak örnek boyutu ve insan önyargı kaldırılması artırır.

Son derece hassas genomik ve proteomik yöntemleri ortaya çıkması çalışmalar tek hücre ulaşmak koymak başladı. Böyle tek hücreli analizleri için dev bir Stentor hücre boyutunu kanıtı-of-concept deneyler için bir arzu test deneği yapar. Mümkün, bu tür deneyler için Stentor kültür esastır ve çok yöntem tanımlamak burada daha da daha gelişmiş tek hücreli teknikleri gelişiminde bir rol oynaması gerektiğini.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Bu eser NIH grant R01 GM113602 (WFM) ve NSF 1144247 (AL) tarafından desteklenmiştir. Biz Mark Slabodnick ve Natalie Kirkland bazı bu protokoller ilk sürümleri geliştirmek ve bilgilendirici tartışma kabul edersiniz. Karina Perlaza ve Greyson Lewis el yazması eleştirel okuma için teşekkür ederiz.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Stentor coeruleus canlı kültürCarolina Biyolojik Tedarik131598
Chlamydomonas reinhardtii agarüzerinde Carolina Biyolojik Tedarik152040
Pastörize kaynak suyu, 1 litrelik şişeCarolina Biyolojik Tedarik132458
Metil selüloz, 1500 cPMillipore SigmaM0387
Pyrex cam spot plakaFisher Scientific13748B
Vidalı kapaklı geniş ağızlı cam kavanoz, 60 mLCarolina Biyolojik Tedarik715740
Cam kapaklı 2 fincan cam kapPyrex1095600
CultureWell silikon levha malzemesiGrace Bio Labs664475
KimwipesKimberly Clark34155
Posi-Click 1.7 mL mikrosantrifüj tüpüDenvilleC2170
Kapak CamıFisher en iyi12-548-B
TAP Büyüme Ortamı, Chlamydomonas kültürü için optimize edilmiştirThermoFisherA1379801
Silikon ara parçası, CultureWell Silikon Levha, 0,25 mm Kalınlık/13 cm x 18 cmGrace Bio Labs664475
Petrolatum, Petrol Jeli, BeyazSpektrumP1037
Borosilikat cam kılcal borular.
OD: 1,2 mm, ID: 0,9 mm, uzunluk: 10 cm.		Sutter AletiB120-90-10
İğne çektirmesi P-87Sutter Aleti
Stemi 2000 stereo mikroskopZeiss
Axiozoom V16, stereo zoom mikroskobuZeiss

Kaynaklar

  1. Kirschner, M., Gerhart, J., Mitchison, T. Molecular "vitalism". Cell. 100 (1), 79-88 (2000).
  2. Shulman, J. M., St Johnston, D. Pattern formation in single cells. Trends in Cell Biology. 9 (12), M60-M64 (1999).
  3. Wloga, D., Frankel, J. From molecules to morphology: cellular organization of Tetrahymena thermophila. Methods in Cell Biology. 109, 83-140 (2012).
  4. Frankel, J. Pattern Formation: Ciliate Studies and Models. , Oxford University Press. Oxford. (1989).
  5. Tartar, V. Grafting experiments concerning primordium formation in Stentor coeruleus. Journal of Experimental Zoology Part A. 131 (1), 75-121 (1956).
  6. Lillie, F. R. On the smallest parts of Stentor capable of regeneration; a contribution on the limits of divisibility of living matter. Journal of Morphology. 12 (1), 239-249 (1896).
  7. Morgan, T. H. Regeneration of proportionate structures in Stentor. The Biological Bulletin. 2 (6), 311-328 (1901).
  8. Slabodnick, M. M., et al. The macronuclear genome of Stentor coeruleus reveals tiny introns in a giant cell. Current Biology. 27 (4), 569-575 (2017).
  9. Tang, S. K. Y., Marshall, W. F. Self-repairing cells: How single cells heal membrane ruptures and restore lost structures. Science. 356 (6342), 1022-1025 (2017).
  10. Slabodnick, M., Prevo, B., Gross, P., Sheung, J., Marshall, W. Visualizing cytoplasmic flow during single-cell wound healing in Stentor coeruleus. Journal of Visualized Experiments. 82 (82), 50848(2013).
  11. Tartar, V. Biology of Stentor. , Pergammon Press. Oxford. (1961).
  12. Slabodnick, M. M., et al. The kinase regulator mob1 acts as a patterning protein for stentor morphogenesis. PLOS Biology. 12 (5), e1001861(2014).
  13. Harris, E. The Chlamydomonas sourcebook: Introduction to Chlamydomonas and its laboratory use. 1, Academic Press. Cambridge. (2009).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Stentor RejenerasyonuH cre K lt rCam ne ile KesmeS kroz UygulamasMembranellar BantOral AparatusI k MikroskopisiRejenerasyon A amalarTek H cre AnaliziPast rize Kaynak Suyu
Rejenerasyon Stentor içinde çalışma yöntemleri
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.