Lazer-yakalama mikrodiseksiyon optimizasyonu gelen insan dokusu taze donmuş enterik gangliyon yalıtım için

Aaron A. May-Zhang; Karen K Deal; E. Michelle Southard-Smith

doi:10.3791/57762

Method Article

Lazer-yakalama mikrodiseksiyon optimizasyonu gelen insan dokusu taze donmuş enterik gangliyon yalıtım için

DOI:

10.3791/57762

⸱

June 14th, 2018

Aaron A. May-Zhang¹ , Karen K Deal¹ , E. Michelle Southard-Smith¹

¹Vanderbilt University Medical Center

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu iletişim kuralı, enterik gangliyon lazer yakalama mikrodiseksiyon (LCM) kullanarak sabitlenmemiş, taze rezeke insan bağırsak dokusundan izole yüksek bütünlük RNA örnekleri almak için hedeftir. Bu protokol flaş donmuş örnekleri insan bağırsak dokusu, cryosectioning, ethanolic boyama ve dehidratasyon, LCM, hazırlanıyor içerir ve RNA çıkarma.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yöntemin amacı enterik gangliyon lazer yakalama mikrodiseksiyon (LCM) kullanarak sabitlenmemiş, taze rezeke insan bağırsak dokusu toplanan yüksek bütünlük RNA örnekleri elde etmektir. Biz RNA yalıtır enterik gangliyon yeterince yüksek kalite ve miktar üzerinden RNA-devamı için almak için çok önemli beş adım iş akışında belirledik Öncelikle, bağırsak dokusu hazırlanırken, her örnek serosa mümkün olduğu kadar büyük temel kalıpları alt kısmında düzleştirme önce Blot tarafından kaldırıldı tüm aşırı sıvı olması gerekir. Örnekleri daha sonra hızlı bir şekilde Kuru buz ve 2-methylbutane bir bulamaç donmuş. İkinci olarak, ne zaman doku kesit, cryomolds bağırsak bölümler böylece slayt başına enterik gangliyon en büyük yüzey alanı verimli myenteric pleksus tam boyutunda paralel şekilde konumlandırmak önemlidir. LCM, polietilen napthalate (kalem) sırasında üçüncü-membran slaytlar teklif en büyük hız ve enterik gangliyon toplarken enterik gangliyon üniform olmayan şekiller anahat oluşturma esnekliği. Dördüncü olarak, enterik gangliyon bölümleri içinde farklı görselleştirme için etanol uyumlu boya, kresil mor gibi sulu boya göre RNA bütünlüğünü mükemmel koruma sunuyoruz. Son olarak, yakalanan gangliyon gelen RNA çıkarılması için biz DNA kirlenme ayrıcılıklarına olan üstün RNA miktarı vermiştir ticari RNA ayıklama kitleri ve kalite arasındaki farklar görülmektedir. Geçerli protokol bu faktörlerin en iyi duruma getirme büyük ölçüde iş akışını hızlandırır ve enterik gangliyon örnekler olağanüstü RNA kalite ve miktar ile verimleri.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yöntem yüksek kaliteli RNA örnekleri enterik gangliyon lazer yakalama mikrodiseksiyon (LCM) kullanarak insan bağırsak dokusundan elde etmek için tasarlanmıştır. Burada açıklanan Protokolü (RNA-seq) sıralama RNA için yeterli RNA kalite ve verim sağlamak için en iyi duruma getirilmiş ve taze rezeke, sabitlenmemiş, flaş donmuş insan bağırsak dokusu ile kullanılmak üzere tasarlanmıştır.

Fonksiyonel gastrointestinal ve gut motilite bozuklukları her dört kişi Amerika Birleşik Devletleri'nde etkiler. Gut homeostazı ve hareketliliği çok önemli bir rol oynar gibi enterik sinir sistemi (ENS), ikinci beyin¹olarak da sık sık ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada açıklanan tüm iletişim kuralları Vanderbilt Üniversitesi Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB tarafından) onaylanmış olması.

1. doku varıştan hazırlık

Uygun IRB onay aldıktan ve bunlar çalışma için gerekli tüm araştırma ölçütlere uyan donör taze rezeke, sabitlenmemiş bağırsak dokusu elde etmek için insan organ bağışı kuruluşları ile koordine.
Not: Bu protokol fareler ve diğer kemirgen modelleri ile kullanmak için adapte edilebilir.
1. Hemen rezeksiyon bağırsak her segmentin luminal malzeme veya dışkı kaldırmak için soğutulmuş PBS ve doku BIRIMI lümen kanül.
2. Sonra kızarma ve atık bir uygun biohazard receptacle at....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

LCM, RNA-devamı için standartlara toplantı kullanarak insan bağırsak örneklerinden enterik gangliyon nispeten hızlı toplamayı etkinleştirmek varolan iletişim kuralları için çeşitli iyileştirmeler yaptık İlk olarak, biz en iyi duruma getirilmiş Kuru buzun içinde 2 MB (Şekil 1B) bir bulamaç yüzeyinde yer büyük temel kalıpları bağırsak dokusu segmentlerinde hızlı donma. En iyi başarı cryosectioning ve sonraki LCM sırasında mukoza-tarafı (

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çok sayıda enterik gangliyon verimli toplama RNA-devamı için RNA türetmek için bir kaynak olarak bu yordamla Burada, sonuna kadar RNA bütünlüğünü koruyarak varolan iletişim kuralları'nda belirtilen işlemler hız. Bu yordamdaki adımların tümünü birbirine bağlı olduğundan, tüm sorunları çalışma başlangıcından bertaraf edilmesi ve tüm örnekleri olarak benzer şekilde bir başkasına mümkün olduğunca güvenilir RNA-seq. elde etmek için hazır olduğundan önemlidir

Arasındaki zaman aralığını (soğuk iskemi.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar hiçbir ifşa etmek çıkar çatışması var.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz bağış ve bu iş mümkün kılan onların aileleri için minnettarız. Ayrıca Uluslararası Tıp Enstitüsü ve Tennessee donör Bu çalışmada kullanılan doku koordinat koleksiyonu yardım hizmetleri personeli yardım ederiz. Bu eser Ulusal Sağlık Enstitüleri, NIH OT2-OD023850 EMS² ve nakit çekmek için gelen NIH T32-DK007673 AMZ için gelen hibe tarafından desteklenmiştir. Vanderbilt translasyonel patoloji paylaşılan kaynak personel için erişim okek enstrüman ve doku hazırlık tavsiyeler için minnettarız. Vanderbilt doku patoloji paylaşılan kaynak NIH hibe P30-CA068485-14 ve U24-DK059637-13 tarafından kısmen desteklenir. Genom teknoloji erişim merkezi Washington Üniversi....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number
% 10 Nötr tamponlu formalin	Sigma	HT501128-4L
2-Metilbütan	Fisher	O3551-4
3 mL şırınga	BD	309628
50 mL konik tüpler, polipropilen ve nbsp;	Corning	05-526B
Taban kalıpları 37x24x5mm, tek kullanımlık	Elektron Mikroskobu Bilimleri	5025511
Belzer UW Soğuk Hava Deposu Çözümü	Bridge to Life	N.A.
CapSure Macro LCM kapakları	Arcturus, ThermoFisher	LCM0211
Streç Sargı, Press' n Mühür	Sevindim	N.A.
Kresil Menekşe Asetat	Akros Organics	AC405760025
Kesme Tahtası Elektron	Mikroskobu Bilimleri	63308
Etanol, 190 geçirmez	Pharmco-AAPER	111000190
Etanol, 200 geçirmez	Pharmco-AAPER	111000200
Cam Mikroskobu slaytları	Fisher	12-550-343
Eldivenler, uzatılmış manşet	Microflex
Önlükler, cerrahi-tek kullanımlık	Kimberly-Clark	19-088-2116
Tepsi, 20 L (büyük polipropilen sterilizasyon tavası)	Nalgene	1335920B
Kimwipes (büyük)	Kimberly-Clark	34120
Kimwipes (küçük)	Kimberly-Clark	34133
Lazer Yakalama Mikrodiseksiyon Sistemi (ArcturusXT)	ThermoFisher	N.A.
Leica Kriyostat Mandren, büyük, 40 mm	Güneydoğu Patoloji Enstrüman Servisi	N.A.
Işık Mikroskobu	Olympus	CX43
Mikroskop objektifi (20X)	Olympus UPlanFl 20X/0.50, ∞/0.17	N.A.
Mikroskop objektifi (10X)	Olympus UPlanFl 10X/0.25, ∞/-	N.A.
Moleküler Elekler	Acros Organics	AC197255000
Nükleaz içermeyen su	Ambion	AM9937
PicoPure RNA ekstraksiyon kiti	Uygulamalı Biyosistemler	12204-01
Pelet Havaneli	Kimble Kontes	4621973
PEN membran LCM slaytları	Arcturus, ThermoFisher	LCM022
RNaz içermeyen tüpler, 1.5 mL	Ambion	AM12400
RNaseZAP	Sigma	Sigma-R2020
RNA Ekstraksiyon Kiti "A" (PicoPure)	Uygulamalı Biyosistemler	12204-01
RNA Ekstraksiyon Kiti "B" (RNeasy Mikro kit)	Qiagen	74004
RNA Ekstraksiyon Yöntemi "C" (TRIzol)	Invitrogen	15596-026
RNA Ekstraksiyon Kiti "D" (RNeasy PLUS Mini kit)	Qiagen	74134
Sıçrama Kalkanı, tek kullanımlık yüz siperi	Fisher	17-310
Makas, Cerrahi, 14,5 cm "keskin-keskin"	Güzel Bilim Araçları	14002-14
Şırınga filtresi, selüloz asetat (0.2 μ m)	Nalgene	190-2520
Doku Dondurma Ortamı	Genel Veri Sağlık	TFM-5
Ksilenler	Fisher	X3P1GAL

19010144

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gershon, M. D. The second brain : the scientific basis of gut instinct and a groundbreaking new understanding of nervous disorders of the stomach and intestine. , HarperCollinsPublishers. 1st edn (1998).
Grundmann, D., Klotz, M., Rabe, H., Glanemann, M., Schafer, K. H. Isolation of high-purity myenteric plexus from adult human and mouse ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Lazer-yakalama mikrodiseksiyon optimizasyonu gelen insan dokusu taze donmuş enterik gangliyon yalıtım için

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles