Yöntem makalesi

Yamultma stres gelişmekte olan zebra balığı kalp oransal etkileri 4 boyutlu görüntülerini yakalamak için ışık sayfalık floresans mikroskobu

DOI:

10.3791/57763

⸱

10 Ağustos 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Bioengineering, The University of Texas at Arlington, 2Department of Medicine (Cardiology) and Bioengineering, UCLA, 3College of Health Science and Environmental Engineering, Shenzhen Technology University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Düzeltme bildirimi

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, zebra balığı 4-boyutlu (4 D) kalbimizde geliştirme görselleştirmek için bir iletişim kuralı mevcut. Işık sayfalık floresans mikroskobu (LSFM), üzerinden 4-D görüntüleme gelişmekte olan kalpleri yeniden oluşturmak için zaman içinde 3 boyutlu (3-D) görüntüleri alır. Nitelik ve nicelik endocardial çentik kardiyak trabeculation teşvik odası geliştirme sırasında sinyal kesme stres etkinleştirir gösteriyoruz.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hemodinamik kuvvetleri yaşadığı kalp etkisi kalp geliştirme, özellikle trabeculation, dallanma outgrowths Miyokardiyum üzerinden bir ağ oluşturur. Art arda sıralı sol ventrikül sigara-sıkıştırma kardiyomiyopati veya hipoplastik sol kalp sendromu gibi ventriküler kusur söz konusu sinyal çentik genetik program hataları. Bu iletişim kuralını kullanan, bu kesme tahrik stres trabeculation ve çentik sinyal birbirine bağlı belirlenebilir. Işık sayfalık floresans mikroskobu kullanarak, görsel olarak gelişmekte olan zebra balığı kalp mümkündü. Hemodinamik kuvvetleri çentik sinyal yolu ile trabeculation inisiyasyon modüle ve böylece, contractile işlev etkisi olup olmadığını bu el yazması değerlendirildi oluşur. Nitel ve nicel için kesme gerilme analizi, 4-D (3-D + TIME) görüntüleri zebra balığı kardiyak morfogenez sırasında elde ve entegre ışık sayfalık floresans mikroskobu 4-D eşitleme ile yakalanan ventrikül hareket. Kan viskozite gata1a- morpholino oligonucleotides (MO) mikro-makaslama stres, böylece, azaltmak için enjeksiyon yolu ile sinyal ve trabeculation inceltiyorum çentik aşağı düzenleyen düşürüldü. Nrg1 mRNA gata1a MO ile ortak enjeksiyon çentik ile ilgili genleri trabeculation geri yüklemek için kurtar. Yamultma çentik sinyal tahrik stres etkiler trabeculation onaylamak için cardiomyocyte kasılma daha da tnnt2atutuklandı - hemodinamik kuvvetleri, böylece, azaltmak için MO çentik hedef genlerin aşağı düzenleyen bir sigara-trabeculated geliştirmek Miyokardiyum. Son olarak, kesme stres duyarlı çentik genlerin ifade kalıplarının teyit endotel hücreleri pulsatil akışına subjecting tarafından yapılmıştır. Böylece, 4-D ışık sayfalık mikroskobu hemodinamik kuvvetleri çentik sinyal ve trabeculation klinik önemi için sıkıştırma kardiyomiyopati ile temel ortaya çıkardı.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gibi hemodinamik kesme stres, biyomekanik kuvvetleri yakından kalp morfogenez katılmaktadırlar. Yanıt olarak hemodinamik kesme kuvvetleri, miyokardiyal sırtlar ve yiv kesme stres yönünü ile uyum içinde bir dalga gibi trabeküler ağ atriyoventriküler (AV) Vana1arasında geliştirmek. Kalp trabeculation contractile işlevi ve miyokardiyal kitle2artırmak gereklidir. Konjenital kalp kusurları insanlar ve diğer omurgalı3yolları sinyal çentik mutasyonların neden. Örneğin, gata1a4 ve tnnt2a5 morpholino oligonucleotides (MO) eritropoietin (EPO) mRNA6 ve Isoproterenol (ISO)7 kırmızı kan artırmak iken arttığından, azaltmak için gösterilmiştir hücreleri ve kalp hızı sırasıyla ve bu nedenle kesme stres (WSS) duvar. Ayrıca, ErbB2 akıntı yönünde sinyal çentiği kadınlarda, cardiomyocyte yayılması ve farklılaşma sırayla8,9sinyal çentik etkinleştirir contractile güç oluşturmak için teşvik etmektedir. Bu kesme stres ventrikül gelişimi için tahrik trabeculation sinyal çentik yönetir önerilmektedir. Şu anda, daha konjenital kalp kusurları (KKH)10,11,12' ye lider genetik programlama olayları anlamak için girişimi birçok çalışma vardır, ama çok az araştırıyor nasıl mekanik Kuvvetleri şekillendirme kalp etkiler.

Mekanik Kuvvetleri araştırmak amacıyla hareket diyaframdan, gelişim döneminde yakın gözlem uygulanması gerekir. Ancak, in vivo içinde örnekleri nedeniyle geleneksel mikroskobu13inherence yenerek iyi kalitede görüntü elde etmek zordur. Bir örnek içinde zamanla geliştirme gözlemlemek için fiziksel kesit ve boyama, bu nedenle,13,14,15meydana gerekir. Confocal mikroskobu örnekleri14,163 boyutlu yapısını görüntüye yaygın olarak kullanılmasına rağmen bu görüntüleme sistemleri edinme hala yavaş tarama hızlarını sınırlıdır.

Işık sayfalık floresans mikroskobu (LSFM) vivo görselleştirme dinamik olaylar kadar çalışma mesafesi13ile sağlar benzersiz bir görüntüleme tekniğidir. Optik bir örnek17bölüm için bir ışık sayfalık floresan mikroskopi bu tekniği kullanır. Nedeniyle aydınlatma ışık örnek üzerinde ince bir levha fotoğraf ağartma ve fotoğraf toksisite13,18bir azalma vardır. Görünümü ve uzun çalışma mesafesi geniş alan görüntülü13,14,17oldukları gibi bozulmamış kalmak için büyük örnekleri verir. Düşük büyütme, uzun süre yansıması daha büyük bir alanı sağlar çalışma mesafesi sinyal-gürültü oranı ödün vermeden yansıması daha kalın örnekleri sağlar. Birçok grup, LSFM görüntü tüm embriyoların17' ye kullandık14,18, kas ve kalpleri19 diğer dokular arasında beyin görüntüsü örnekleri çeşitli türler gösteriliyor.

Zebra balığı kalp giriş veya çıkış parça occluding tarafından azaltılmış hemodinamik kesme kuvvetleri önceki araştırma gösterdi rağmen sadece nitel bilgilerdir. Bir anormal üçüncü odası, azalmış kalp döngü ve Engelli Vana oluşumu20içinde sonuçlanır. 4-D LSFM görüntüleri kalp doku gelişimi etkiler hemodinamik kesme kuvvetleri yol yeni bir bakış açısı vermek. Bu mekanik Kuvvetleri güç duyarlı sinyal molekülleri etkinleştirmek ve trabeküler sırtlar oluşumu teşvik. 4-D görüntüleme ekledi zaman yönü nedeniyle bir daha önce fark edilmeden gitti yeni âyetlerini için neden olabilir gerçek zamanlı geliştirme değişiklikleri izlemek yapabiliyor. Zebra balığı bilim adamları sadece hücre-hücre etkileşimleri karşı tüm omurgalı hayvan gözlemleyebilirsiniz çünkü görüntüleme için ideal bir modeldir. Oksijen aynı zamanda olmadan damar sistemine bağlı olarak, farklı olarak memeli geliştirmede gerçekleşmesi geliştirme sağlar tüm embriyo aracılığıyla yaygın. Zebra balığı kalp dört odacıklı kalp gerektirir, pulmoner organları yoksun olsa bile çok sayıda insan ve zebra balığı21arasında korunmuş kardiyak genlerini var.

Bu makale, ışık sayfalık floresans mikroskobu zebra balığı kalplerine çeşitli koşullar altında gelişen trabekül görüntü için nasıl kullanılacağını açıklar. İlk olarak, enjeksiyon gata1a4 veya tnnt2a5 alt kan viskozite ve bu nedenle WSS MOs kullanıldı. Morfoloji kalp sonra kaydedildi. Balık ayrı bir grup, WSS EPO mRNA6 veya isoproterenol7 yönetmek olarak artan ve sonuçları görülmektedir. Biz aynı zamanda farklı pulsatil veya salınım akış oranları ile bir hücre çalışma yaptık. Her grup görüntüleme sonra WSS endokard çentik üzerinden tarafından hissedilen başlatır trabeculation sinyal bulduk.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aşağıdaki yöntemleri UTA ve UCLA IACUC iletişim kurallarına uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Bu deneysel grupları ile transgenik Tg(cmlc2:gfp), kullanılan wea (zayıf atrium) veya clo (cloche) mutantlar: (a) vahşi-tipi (WT) denetim, (b) gata1a MO ve (c) tnnt2a MO enjeksiyonları (Tablo 1).

ModeliAdıDeğiştirilmiş genlerFenotipBaşvuru
DenetimVahşi türüHiçbiriN/A
TG(cmlc2:Gfp)Kardiyak myosin hafif ZinciriYeşil flourescence özellikle Miyokardiyum içinde ifade34
Azalan duvar kesme stresZayıf atrium (wea) mutantAtrium özgü myosin heacy ZinciriAtrium değil sözleşme, kompakt ventrikül, kalın miyokard duvar, dar lümen, dialated atrium,37
Cloche (clo) mutantN/ADiyaframdan, küçük ventrikül, var olmayan kalp cushins ile unaturally büyük atrium tümüyle kaldırılmasını41
gata1a MO gata1a Anemi alyuvarlar eksikliği4
tnnt2a MOtnnt2a39
Artan duvar kesme stres EPO mRNAHiçbiriŞiddetli polisitemya, kan hücreleri, dolaşımdaki sayıdaki artış, viskozite arttı6
IsoprotenerolHiçbiriArtmış kalp hızı7

Tablo 1: Zebra balığı açıklamaları. Tanımları ve deneylerde kullanılan zebra balığı açıklamaları.

1. çalışma Kur

  1. Nrg1 ve EPO mRNA trabeculation kurtarmak için hazır olun.
    1. İnsan Nrg1 cDNA elde etmek ve bir donör plazmid yükseltmek.
      Not: İnsan Nrg1 cDNA William Talbot Stanford Üniversitesi'nden gelen yetenekli olduğunu.
      1. Gerekli reaktifler ve malzemeler, PCR (-20 ° C'de depolanan) mastermix, astar (-20 ° C'de depolanan) (bkz: Tablo 2), (Oda sıcaklığında saklanan) bir PCR plaka ve 20 μL pipet (Oda sıcaklığında saklanan) Yani dışarı çıkar. Örnek ürünler için bkz: tablo malzemelerin .
        figure-protocol-1
        Tablo 2: Nrg1 insan klonlama için astar.
      2. Mastermix onaylatılacak 20 μL pipet kullanımında ayarla her astar için hazır olun. Triplicates 1 kümesi için kullanın mastermix 37,5 μL, DNA-Alerjik su 3 μL, 4,5 μL astar. Daha fazla triplicates için sadece örnekleri sayısı ile çarpın.
      3. Böylece 10 μL örnek başına iyi başına toplam çalışma çözüm insan Nrg1 cDNA (20 ng/μg konsantrasyon) DNA ücretsiz su ile astar şerit oranında seyreltin.
        Not: Her çözüm adım 1.1.1 altında eşit olarak dağıtılır emin olun. Bunu yukarı ve aşağı pipetting tarafından her çözüm karıştırarak. Çapraz kontaminasyonu önlemek için tek bir örnek için bir pipet ucu kullanın.
      4. Aliquot Nrg1 cDNA PCR plaka istenen wells için 10 μL çok kanallı pipet ile.
      5. CDNA Wells mastermix 14.5 μL ekleyin. Yapışkan bir kapak kuyuları mühür ve PCR makineye yerleştirmek için PCR plaka uygulanır.
      6. PCR makine başlatmak ve döngüsü enzimler ve kullanılan astar göre uygun sıcaklıklarda ulaştığından emin olmak.
    2. Nrg1 cDNA plazmid pCS2 clone+ cDNA tüm plazmid bakmaksızın emin olmak için fazla enzim BamHI ve EcoRI kullanarak BamHI ve EcoRI sitelerinde.
      1. Nrg1 cDNA plazmid pCS2 ile bağışı mix+, piyasada bulunan master mix çözüm ve astar (Tablo 2).
        Not: Toplam reaksiyon birim ana Mix, astar 3 μL ve 20 ng/μL donör plazmid Nrg1 cDNA ile 1 μL 25 μL ile 50 μL olmalıdır.
      2. Adım 1.1.2.1 karışımından PCR makinesinde yerleştirin ve aşağıdaki özellikleri karşılamak için parametreleri ayarla: 98 ° C 10 s, 5-15 s 55 ° C ve 72 ° C 5 s/kb için için.
      3. Üreticinin yönergelerini izleyerek bir arıtma kit kullanarak PCR ürünü arındırmak. Ürün elüsyon arabellek 50 μL elute.
      4. Arıtılmış PCR ürünü ve pCS2 5 μg sindirmek+ BamHI ve EcoRI ayrı olarak 37 ° C'de 2 h 200 μL tepki birimindeki için. Ticari bir kit ile ortaya çıkan sindirim arındırmak ve 20 μL ve 100 μL Tris-HCL (pH 8,5), anılan sıraya göre elute.
      5. Nrg1 cDNA 4 μL ve sindirilmiş pCS2 2 μL ligate+ bir 25 μL tepki ile 1 μL ligaz katalizör 16 ° C'de gecede plazmid.
        Not: Yordamı burada gecede kuluçka için durdurulabilir.
      6. E. coli bakteri hücre ( Tablo malzemelerigörmek) klonlama için uygun 50 μL içine adım 1.1.2.5 çözümden ligasyonu ve dönüşüm 2 μL kullanın.
    3. Dönüşümün PCR kullanarak Nrg1 cDNA klonlar tarama tarafından gerçekleşti onaylayın. Klonlar rasgele seçin ve bir belirli astar, polimeraz ve deoksribonüklotit trifosfatlardan (dNTPs) ekleyin.
      Not: Vektör kontrol edildi (pCS2+) ve Insert (insan cDNA) olmadan. Almak mı çok büyük bir koloninin aşırı bakteri PCR inhibe olabilir çünkü.
      1. Dönüşüm ve ekran pCS2 üzerinden 8 kolonileri almak+-Nrg1 klonlar Tablo2 PCR primerler kullanılarak.
      2. PCS2 izole etmek için Nrg1 cDNA ile bir klon kültür+-Nrg1 plazmid DNA. E. coli bakteri pCS2 ile 100 μL ile aşılamak+-Nrg1 plazmid 100 mL LB medya ve kültür 37 ° C'de (160-225 RPM) sallayarak içine
    4. Saf pCS2 transfect+-Nrg1 plazmid HEK-293 içine hücreleri üreticinin yönergelerini izleyerek bir ticari transfection reaktif kullanarak bir 6-şey tabak içinde.
    5. 24 h transfection sonra lizis tampon kullanarak hücreleri parçalayıcı ve SDS-sayfa jel çalıştırmak, bir jel membran aktarmak ve ardından ile anti-Nrg1 antikor22leke. Nrg1 protein ifade bir Western Blot kullanarak doğrulayın.
      Not: Boş bir pCS2 denetimidir+ plazmid. Jel membran transfer gecede ortaya çıkarsa buraya duraklatılmış.
    6. Ticari bir ürün Reçetesi tablo benzer kullanarak Nrg1 mRNA sentez ve üreticinin yönergeleri izleyin.
      1. PCS2 5 μL Al+-plazmid linearize NotI 200 μL tepki için 37 ° C'de 2 h ile Nrg1 DNA izole bakteri kültürü ve Özet.
      2. Ticari bir kit ile Doğrusallaştırılmış plazmid arındırmak ve Tris-HCl (pH 8,5) 20 μL içinde elute.
      3. Vitro transkripsiyon bir 20 μL tepki üreticinin yönergeleri izleyerek Doğrusallaştırılmış plazmid 5 μL kullanarak bir ticari RNA izolasyon kiti ile yapmak.
      4. Vitro Nrg1 transkripsiyonu RNA lizis arabellek 350 μL için ekleyin ve sonra bir RNA izolasyon kiti ile arındırmak. RNA Tris-HCl (pH 8,5) 60 μL elute.
      5. RNA konsantrasyon ölçmek ve-80 ° c ileride kullanmak üzere saklayın.
    7. Adımları izlemeniz 1.1.6.1 - EPO cDNA ve mRNA hazırlık ama pCS2 + plazmid EcoRI ve XhoI içine cDNA siteleri yerine klon için yukarıda 1.1.6.5.
  2. Zebra balığı Morpholino enjekte
    1. 23 gata1a4 (5 '-CTGCAAGTGTAGTATTGAAGATGTC-3) ve tnnt2a5 (5 '-CATGTTTGCTCTGATCTGACACGCA-3) ATG dizisi karşı online bir araç (Tablo reçetesi) kullanarak MO enjeksiyonları tasarlayın.
    2. Gata1a ve tnnt2a MO ayrı 8 ng/nL ve 4 ng/nL, son konsantrasyonları sırasıyla nükleaz ücretsiz su yapmak için ekleyin. 20 pg/nL son bir konsantrasyon ile EPO mRNA ile yineleyin. Son Hacim 1 mL olduğundan emin olun.
    3. 1 enjekte nL 8 ng/nL gata1a MO, ve 1 tnnt2a MO 1 4 hücreli aşamaya ayrı zebra balığı embriyo içine, 4 ng/nL, nL ventrikül duvar kesme stres (WSS)24azaltmak için. WSS artırmak için 1 enjekte EPO mRNA6 1 - 4 hücre aşamada zebra balığı embriyo içine 20 pg/nL, nL.
  3. Kimyasal olarak trabeculation inhibe zebra balığı tedavi
    1. 20 mL pipet kullanarak seyreltik 10 mg/mL AG1478% 1 DMSO 30 5 mikron son bir konsantrasyon E3 orta hpf 15 mL tüp içine. Bir denetim olarak % 1 DMSO sadece her balıkla tedavi.
    2. N-[N-(3,5-Difluorophenactyl)-L-Alanyl]-S-Phenylglycine t-butil ester (DAPT) % 1 DMSO ekleyin (100 mikron) E3 orta çentik 40, sinyal etkisizleştirmek için 15 mL tüp içinde hpf benzer bir şekilde. Bir denetim olarak sadece % 1 DMSO ile tedavi.

2. görüntüleme teknikleri

  1. 4-D LSFM kardiyak görüntüleme eşitleme algoritması ile
    1. Tüm balık embriyo 2B görüntüleri birden çok kalp (Şekil 1) aşağıdaki adımları kullanarak döngüleri yenerek öncelikli. Işık-levha kalınlığı yaklaşık 5 mikron olduğundan emin olun. 10 Bayan Set z tarama bir çekim hızı ile 500 x-y kare 1 mikron Nyquist örnekleme ilke25göre kayıpsız dijital örnekleme için götürün.
      1. %1 (w/v) özel jel 100 mL 1 g özel ekleme ve tüm özel eriyene kadar Isıtma oluşturun. Küçük bir plastik tüp embriyo ve 20 μL pipet kullanarak özel yükleme ve sahne alanı'nda güvenli.
      2. Yazılım ile ilgilenen görüntü açın ve örnek canlı görmek için Live ' yı tıklatın. Örnek odakta olması düğmeyi kullanarak amaç ayarlayın. Benzer şekilde, embriyo üst örnek canlı görüntüler sahneye taşıyın.
      3. 5 için 500 kez fotoğraf çekmek mikroskop'ın yazılım26kullanarak 10 X büyütme s.
      4. Motor yeni bir katmana (z ekseni içinde 1 mikron) kullanarak sahne alanı taşımak ve görüntüleme yordamı yineleyin.
      5. Tüm kalp tam yansıma kadar 2 adımları yineleyin.
    2. Veri bütünlüğünü ilk ve son kalp döngüsü görüntüleri göz ardı ederek. Dönem kalp döngüsünün aynı zaman noktada kalp döngüsünde ama farklı dönemlerde çekilmiş görüntüleri eşleştirerek bulmak. Dönem bulmak için geliştirilen aşağıdaki denklemi kullanın:
      figure-protocol-2(1)
      D dönem bir hipotez, montaj için kullanılan maliyet fonksiyonu olduğu yerde benm yakalanan görüntünün τ' görüntü yakalandı, zk z-yön Dizin görüntü, xm zamanı vektör piksel dizinin ve T' periyodik hipotezdir.
    3. Aşağıdaki denklemi benzer aşamasında iki resim arasındaki göreli kayma bulmak için kullanın:
      figure-protocol-3(2)
      nerede Qk', k gösterir bir maliyet için göreli shift, R olası kayma mahalle işlevdir, L görüntü yakalama toplam süre, x piksel dizini, zk ve zk' birinci ve ikinci z-yön dilimler, t zaman ise s göreli shift hipotez.
    4. İlk görüntü açısından mutlak üst karakter için göreli shift dönüştürmek ve görüntüleri sonraki bölümde daha önce açıklanan27olarak hizalamak için mutlak ilişkisini bulmak için sözde ters yaklaşımı kullanarak doğrusal Denklem çözmek.
    5. Son 4-D görüntüleri görüntü işleme yazılımı (Tablo reçetesi) kullanarak işlendi.
      1. 3-b yığın 2B görüntüleri
        1. Ticari bir görüntü işleme yazılımı açın.
        2. Açık veri' ı tıklatın.
        3. Seçme tüm belgili tanımlık imge 3-b yığılmış > tıklayın yükleme.
        4. Voksel boyutu 0.65 x 0.65 x 1 Ekle > Tamam' ı tıklatın.
        5. 3 boyutlu görüntü görselleştirmek için Multi-Planar görünüm kutusunu tıklatın.
        6. Mavi slice_1.tiff kutusunu sağ tıklatın > seçin görüntü > Volrenseçin.
        7. Düzenle ' yi tıklatın > seçenek > seçin eşlem düzenleyin.
        8. Kırmızı özetlenen kutularını kullanarak renk Ayarla > Tamam'ı tıklatın.
      2. 3-b 4-D için dönüştürme
        1. Tıklayın "Dosya > Aç zaman serisi veri.
        2. Sadece yapılan 3-b tartışırım seçin > tıklayın yükleme.
        3. Daha önce aynı Voksel boyutu olarak girin.
        4. Mavi slice_1.tiff kutusunu sağ tıklatın > seçin "görüntü" > seçin Volren.
        5. Düzenle ' yi tıklatın > seçenek > seçin eşlem düzenleyin. Kutuları kullanarak rengi ayarladığınız > Tamam' ı tıklatın.
        6. Zaman serisi kontrol sağ tıklayın > Movie maker ' ı tıklatın > film izlemek için Play tuşuna basın.
        7. Bir dosya adı, çerçeve boyutu, kare oranı, 1'e eşit kalite Monoscopic yazın Ekle > Uygula ' yı tıklatın
        8. Videoyu dışa aktarmak. Belgili tanımlık video içinde uygun bir yazılımını açın.

3. qRT-PCR Analizi

  1. Zebra balığı RNA çentik ligandlar, reseptörler, ölçmek için yalıtım kalp ve genler ifadeleri hedef
    1. Zebra balığı tricaine fluorhidrat28,29dozda subjecting tarafından kurban. Yukarıda açıklanan protokol30kullanarak, zebra balığı kalpler varlığına ve RNA izolasyon için hazırlanmış.
    2. Toplam RNA ayırma ve üreticinin yönergeleri izleyerek cDNA sentez seti kullanarak cDNA sentez.
    3. PCR astar tasarım çentik ligandlar için Jag1, Jag2, Dll4, reseptör Notch1bve sinyal ilgili genlerin Nrg1 ve ErbB2. Biz kullanılan astar için bkz: Tablo 3.
    4. 3.1.3. adımdaki astar, adım 3.1.2 izole mRNA ve ticari mastermix PCR plakasına ekleyin. Uygun sıcaklık ve kez kullanılan enzimler göre qRT PCR çalıştırın. Zebra balığı α-aktin sonuçları normalleştirmek.
      Not: Bu ifade düzeyleri her ligandlar, reseptörleri ve genler için hesaplar.

4. vitro insan aort endotel hücre (HAEC) deneyleri

  1. Dinamik kesme stres modeli
    1. Kültür HAEC hücreleri ile HAEC kültür kitle iletişim araçları. Sonra tamamen konfluent, laminar akış ve pulsatil 23 x 10-5 N 24 h için 1 Hz hızında akışının hücreleri göstermek.
      1. EC ısınmak medya/DMEM FBS bir suda banyo için 20 min.
      2. HAEC hücreler sıvı azot tanktan almak ve şişe eriyene kadar su banyosu yerleştirin.
      3. 1000 μL pipet kullanarak, çözdürülen hücreleri çıkarın ve 3-5 mL medya ile 15 mL tüp içinde koydu. 53 x g 3 dk de hücre çözümü santrifüj kapasitesi.
      4. Çözüm kapalı Aspire edin ve toplam hacmi 10 mL için yeterli medya ekleyin. Şişeye kap ve hücre alt plaka üzerinde eşit olarak dağıtmak için steril bir T75 şişesi hücre çözümü ekleyin.
      5. Baş harfleri, tarih, hücre tipi ve geçiş numarası şişeye işaretleyin. Hücrelerin % 80 birleşmesi olana şişeye 37 ° c, % 5 CO2, kuluçkaya. 2-3 günde medya değiştirmeyi unutmayın.
      6. Ticari bir pompa kullanarak, şişeye için tüp takmak ve adım 4.1.131,32,33olarak yukarıda belirtilen parametreleri ayarlayın.
    2. GI254023X HAEC orta 5 mikron 30 dk için son bir konsantrasyon, 50 mL ekleyin.
    3. Önceden karışık GI254023X ile sinyal, çentik bastırır bir ADAM10 inhibitörü kuralları aynı laminar akış veya pulsatil akışı deneyler 4.1.1 olduğu gibi.
    4. Çentik ligandlar (Jag1, Jag2 ve Dll4) ve çentik hedef genlerin ölçmek (tüylü ve artırıcı Split [Hes]) HAEC örnekleri (laminar akışı, laminar akış + GI254023X, pulsatil akışı, dört gruplar için qRT-PCR kullanarak daha önce açıklanan32pulsatil akışı + GI254023X).

5. kurtarma ve çentik sinyal aşırı ifade

  1. 1 enjekte nL 5 pg/nL (Kimden adım 1.1.6) bir konsantrasyon gata1a çentik hedef genlerin24overexpress için MO ile 1-4 hücre aşamada itibariyle hazırlanan Nrg1 mRNA.
  2. 1 enjekte nL Nrg1 mRNA wea mutant yılında benzer bir şekilde24içine.
  3. Çift Nrg1 mRNA konsantrasyonu (10 pg/nL) ve24 1 enjekte nL zebra balığı içine ventriküler morfoloji gözlemlemek için.
  4. 1 enjekte hematopoiesis ventriküler WSS daha önce gösterilen24artırmak için ek olarak EPO mRNA6 1-4 hücre aşamada zebra balığı embriyo içine 20 pg/nL, nL.
  5. 1 enjekte nL contractility, zebra balığı ise 24 h için E3 Orta'ya oranını artıran 50 mikron Isoproterenol7, daha önce gösterilen24kültürlü.
  6. 4-D LSFM görüntüleme her grup için gerçekleştirin. Adımları 2.1.1-2.1.5.2.8 yönergeleri izleyin.

6. miktar kesirli kısalma ve birim değişim zaman içinde

  1. Her grup, 50, 75 ve 100 için 4-D LSFM görüntüleme gerçekleştirmek hpf. Adımları 2.1.1-2.1.5.2.8 yönergeleri izleyin. Her kalp duvar hareket çoğaltılması için 600 düğümleri sahiptir, bu nedenle her görüntü bölün.
  2. Ventrikül çapının değişikliği diastole ve aşağıdaki formülü kullanarak sistol sırasında tedbir:
    figure-protocol-4(3)
    Her 0.1, 3-b ventriküler görüntüleri yüklemek Görselleştirme yazılımları ve ölçü birimi s.
  3. Birim değişikliği 75 her deney grubu için zaman içinde Arsa hpf ve 100 hpf.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

LSFM bu el yazması yüksek çözünürlüklü 2-B ve 3-b resim elde etmek için kullanılmıştır. Şekil 1A ve 1B' da görüldüğü gibi aydınlatma objektif hafif levha örneği'yönlendirir. Hafif levha zayıflık nedeniyle, sadece tek bir uçağı aydınlatılır. Algılama objektif aydınlatma objektif konumlandırılmış dik ve ışıklı uçakta (Şekil 1B) odaklanmıştır. Aydınlatma objektif hafif sayfasından sonra soldan sağa doğru (

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol için 4-D görüntüleme değişiklikler biyomekanik kuvvetler trabeküler ağ gelişimini izlemek için kullanılabileceğini göstermiştir. Özellikle, endotel hücreleri tarafından deneyimli kesme stres sırayla trabeculation teşvik cascade sinyal çentik başlatır. Bu makale, biz göstermiştir (1) gata1a MO enjeksiyon hematopoiesis azalma ve bu nedenle duvar kesme stres azalır, (2) tnnt2a MO enjeksiyon duvar kesme stres ve (3) wea azaltmak için ventrikül contractile işlevi inhibe olduğunu mutantla...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazar William Talbot insan sağlamak için Stanford Üniversitesi için şükran ifade etmek istiyorum Nrg1 cDNA ve Deborah Yelon üzerinden sağlamak için UCSD için WEA mutantlar. Yazarlar ayrıca Cynthia Chen resim alma ile yardımcı olduğunuz için teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışmada hibe NIH HL118650 (T.K. Hsiai), tarafından desteklenmiştir (için T.K. Hsiai) HL083015, HD069305 (için NC Chi ve T.K. Hsiai.), HL111437 (için NC Chi ve T.K. Hsiai), HL129727 (için T.K. Hsiai), T32HL007895 (için R.R. Sevag Packard), HL 134613 (V. Messerschmidt için) ve University of Texas sistem yıldız (J. Lee) finansman.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Clontech Hifi PCR ön karışımı Takara 639298PCR mastermix
1.1.1.1, 1.1.1.2, 1.1.1.5, 1.1.2.1, 3.1.4
İnsan Nrg1 WilliamTalbot, Stanford Üniversitesi, Stanford, California, ABD'den cDNA HediyesiN/ATrabekülasyon kurtarma için kullanılır
1.1.1.3, 1.1.1.4, 1.1.2.1
CFX Connect™ Gerçek Zamanlı PCR Tespit SistemiBio-Rad1855201PCR Makinesi
1.1.1.5, 1.1.1.6, 1.1.2.2, 1.1.3.2
pCS2+GE SağlıkPlazmidi mRNA
sentezlemek için kullanılır 1.1.2.1, 1.1.2.4, 1.1.2.5
Nükleospin saflaştırma kiti   Clontech740609.25DNA Saflaştırma
1.1.2.3, 1.1.2.4, 1.1.6.2
T4 DNA ligazı Clontech2011APCR Ligasyon çözümü
1.1.2.5
Yıldız yetkin hücrelerClontech636763E. coli transformasyon için kullanılan hücreler
1.1.2.6, 1.1.3.1, 1.1.3.2
Lipofektamin 2000 transfeksiyon reaktifiLife Technologies11668027Transfeksiyon reaktifi
1.1.4
mMessage SP6 kitiInvitrogenAM1340mRNA
sentezlemek için kullanılan kit 1.1.6.3
Aurum Total RNA Mini KitBio-Rad7326820RNA'yı Saflaştırır;
1.1.6.4, 3.1.2
GeneTools 4.3.8GeneToolsN/AYazılımı
1.2.1, 3.1.3
EPO cDNACreative BiogeneCDFH006026WSS
1.2.2, 1.2.3, 1.1.7
AG1478Sigma-Aldrich T4182ErbB inhibitörü
1.3.1
E3 ortamıEmbriyoları büyütmek için
1.3.1, 1.3.2, 5.1.5
DAPTSigma-Aldrich D5942γ-sekretaz inhibitörü
1.3.2
Agaroz Sigma-Aldrich A9539Embriyoları monte etmek için kullanılır
2.1.1.1
ORCA-Flash4.0 LT  Dijital CMOS kameraHamamatsu PhotonicsC11440-42UGörüntüleri yakalamak için kullanılır
2.1.1.2, 2.1.1.3
Amira SoftwareFEI SoftwareN/AGörselleştirilmiş ve Analiz Edilmiş görüntüleri 3D ve 4D olarak
2.1.5.1.1-2.1.5.2.8
Trikaon mesilat Sigma-Aldrich 886-86-2Embriyoları insanca sedasyona tabi tutmak veya kurban etmek için kullanılır
3.1.1
iScript cDNA Sentez KitiBio-Rad1708890cDNA
Sentezler 3.1.2
Eppendorf 5424 mikrosantrifüjEppendorf05-400-005Mikrosantrifüj
4.1.1.3
GI254023XSigma-Aldrich 260264-93-5ADAM10 inhibitörü
4.1.2, 4.1.3  
İzoprenalin hidroklorürSigma-Aldrich I5627İzoproterenol, WSS
5.1.5
MATLABMathworksN/AKardiyak mekanik analizini
Astar tasarımı için artırır

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lee, J., et al. Moving domain computational fluid dynamics to interface with an embryonic model of cardiac morphogenesis. PLoS One. 8 (8), e72924(2013).
  2. Peshkovsky, C., Totong, R., Yelon, D. Dependence of cardiac trabeculation on neuregulin signaling and blood flow in zebrafish. Dev Dyn. 240 (2), 446-456 (2011).
  3. High, F. A., Epstein, J. A. The multifaceted role of Notch in cardiac development and disease. Nat Rev Genet. 9 (1), 49-61 (2008).
  4. Galloway, J. L., Wingert, R. A., Thisse, C., Thisse, B., Zon, L. I. Loss of Gata1 but Not Gata2 Converts Erythropoiesis to Myelopoiesis in Zebrafish Embryos. Developmental Cell. 8 (1), 109-116 (2005).
  5. Chi, N. C., et al. Cardiac conduction is required to preserve cardiac chamber morphology. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (33), 14662(2010).
  6. Paffett-Lugassy, N., et al. Functional conservation of erythropoietin signaling in zebrafish. Blood. 110 (7), 2718(2007).
  7. De Luca, E., et al. ZebraBeat: a flexible platform for the analysis of the cardiac rate in zebrafish embryos. Scientific Reports. 4, 4898(2014).
  8. Liu, J., et al. A dual role for ErbB2 signaling in cardiac trabeculation. Development. 137 (22), 3867-3875 (2010).
  9. Samsa, L. A., et al. Cardiac contraction activates endocardial Notch signaling to modulate chamber maturation in zebrafish. Development. 142 (23), 4080-4091 (2015).
  10. Li, Y., et al. Global genetic analysis in mice unveils central role for cilia in congenital heart disease. Nature. 521, 520(2015).
  11. Sifrim, A., et al. Distinct genetic architectures for syndromic and nonsyndromic congenital heart defects identified by exome sequencing. Nature Genetics. 48, 1060(2016).
  12. Hu, Z., et al. A genome-wide association study identifies two risk loci for congenital heart malformations in Han Chinese populations. Nature Genetics. 45, 818(2013).
  13. Huisken, J., Stainier, D. Y. R. Selective plane illumination microscopy techniques in developmental biology. Development (Cambridge, England). 136 (12), 1963-1975 (2009).
  14. Panier, T., et al. Fast functional imaging of multiple brain regions in intact zebrafish larvae using Selective Plane Illumination Microscopy. Frontiers in Neural Circuits. 7, 65(2013).
  15. Lee, E., et al. ACT-PRESTO: Rapid and consistent tissue clearing and labeling method for 3-dimensional (3D) imaging. Scientific Reports. 6, 18631(2016).
  16. Kelley, L. C., et al. Live-cell confocal microscopy and quantitative 4D image analysis of anchor-cell invasion through the basement membrane in Caenorhabditis elegans. Nature Protocols. 12, 2081(2016).
  17. Lee, J., et al. 4-Dimensional light-sheet microscopy to elucidate shear stress modulation of cardiac trabeculation. The Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1679-1690 (2016).
  18. Lavagnino, Z., et al. 4D (x-y-z-t) imaging of thick biological samples by means of Two-Photon inverted Selective Plane Illumination Microscopy (2PE-iSPIM). Scientific Reports. 6, 23923(2016).
  19. Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Optical Sectioning Deep Inside Live Embryos by Selective Plane Illumination Microscopy. Science. 305 (5686), 1007(2004).
  20. Hove, J. R., et al. Intracardiac fluid forces are an essential epigenetic factor for embryonic cardiogenesis. Nature. 421 (6919), 172-177 (2003).
  21. Bakkers, J. Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease. Cardiovascular Research. 91 (2), 279-288 (2011).
  22. BioRad. General Protocol for Western Blotting. 6376, http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_6376.pdf (2018).
  23. GeneTools. Gene Tools Oligo Design Website. , https://oligodesign.gene-tools.com/request/ (2018).
  24. Mullins, M. Zebrafish Course. , ed University of Chicago (2013).
  25. Grenander, U. Probability and Statistics: The Harald Cramér Volume. , Alqvist & Wiksell. (1959).
  26. Fei, P., et al. Cardiac Light-Sheet Fluorescent Microscopy for Multi-Scale and Rapid Imaging of Architecture and Function. Scientific Reports. 6, 22489(2016).
  27. Liebling, M., Forouhar , A. S., Gharib, M., Fraser, S. E., Dickinson, M. E. Four-dimensional cardiac imaging in living embryos via postacquisition synchronization of nongated slice sequences. Journal of Biomedical Optics. 10 (5), (2005).
  28. Adeoye, A. A., et al. Combined effects of exogenous enzymes and probiotic on Nile tilapia (Oreochromis niloticus) growth, intestinal morphology and microbiome. Aquaculture. 463, 61-70 (2016).
  29. Matthews, M., Varga, Z. M. Anesthesia and Euthanasia in Zebrafish. ILAR Journal. 53 (2), 192-204 (2012).
  30. Singleman, C., Holtzman, N. G. Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (55), e3165(2011).
  31. Li, R., et al. Disturbed Flow Induces Autophagy, but Impairs Autophagic Flux to Perturb Mitochondrial Homeostasis. Antioxidants & Redox Signaling. 23 (15), 1207-1219 (2015).
  32. Li, R., et al. Shear Stress-Activated Wnt-Angiopoietin-2 Signaling Recapitulated Vascular Repair in Zebrafish Embryos. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 34 (10), 2268-2275 (2014).
  33. Baek, K. I., et al. Flow-Responsive Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-Protein Kinase C Isoform Epsilon Signaling Mediates Glycolytic Metabolites for Vascular Repair. Antioxidants & Redox Signaling. 28 (1), 31-43 (2018).
  34. Huang, C. J., Tu, C. T., Hsiao, C. D., Hsieh, F. J., Tsai, H. J. Germ-line transmission of a myocardium-specific GFP transgene reveals critical regulatory elements in the cardiac myosin light chain 2 promoter of zebrafish. Developmental Dynamics. 228 (1), 30-40 (2003).
  35. Vermot, J., et al. Reversing blood flows act through klf2a to ensure normal valvulogenesis in the developing heart. PLoS Biol. 7 (11), (2009).
  36. Grego-Bessa, J., et al. Notch signaling is essential for ventricular chamber development. Dev Cell. 12 (3), 415-429 (2007).
  37. Berdougo, E., Coleman, H., Lee, D. H., Stainier, D. Y. R., Yelon, D. Mutation of weak atrium/atrial myosin heavy chain disrupts atrial function and influences ventricular morphogenesis in zebrafish. Development. 130 (24), 6121(2003).
  38. Arnaout, R., et al. Zebrafish model for human long QT syndrome. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (27), 11316-11321 (2007).
  39. Chi, N. C., et al. Genetic and physiologic dissection of the vertebrate cardiac conduction system. PLoS Biol. 6 (5), e109(2008).
  40. Liao, W., et al. The zebrafish gene cloche acts upstream of a flk-1 homologue to regulate endothelial cell differentiation. Development. 124 (2), 381-389 (1997).
  41. Stainier, D. Y., Weinstein, B. M., Detrich, H. W. 3rd, Zon, L. I., Fishman, M. C. Cloche, an early acting zebrafish gene, is required by both the endothelial and hematopoietic lineages. Development. 121 (10), 3141-3150 (1995).
  42. Santi, P. A. Light Sheet Fluorescence Microscopy: A Review. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 59 (2), 129-138 (2011).
  43. Engelbrecht, C. J., Stelzer, E. H. Resolution enhancement in a light-sheet-based microscope (SPIM). Optics Letters. 31 (10), 1477-1479 (2006).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Düzeltme

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart
Posted by JoVE Editors on 9/03/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for: Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart. Additional author names were added, and an author affiliation was updated.

The author list was updated from:

Victoria Messerschmidt*1, Zachary Bailey*1, Kyung In Baek2, Richard Bryant1, Rongsong Li2, Tzung K. Hsiai2, Juhyun Lee1

to:

Victoria Messerschmidt*1, Zachary Bailey*1, Kyung In Baek2, Yichen Ding2, Jeffrey J. Hsu2, Richard Bryant1, Rongsong Li2, Tzung K. Hsiai2, Juhyun Lee1

The author affiliation for Rongsong Li was updated from:

Department of Medicine (Cardiology) and Bioengineering, UCLA

to:

College of Health Science and Environmental Engineering, Shenzhen Technology University

Etiketler

TrabeculationNotch Signaling4D ImagingGata1a MorpholinoNrg1 mRNATnnt2a MorpholinoHemodynamic Forces

İlgili makaleler