Fare modelleri Glomerular hastalığı böbrek fonksiyonlarının değerlendirilmesi

İnsan böbrek hastalığı taklit etmek için fare modelleri kullanımını giderek yaygın hale geliyor. Fare modelleri gibi kendiliğinden hipertansif fareler (SHR)¹, streptozotocin (STZ) spontan modelleri içerir-indüklenen diyabetik sıçan ve fareler²ve db/db yazın II diyabetik farelerin³, genetik modeller gibi birincil podocyte özgü fokal segmental glomerular skleroz (FSGS)⁴, podocyte özgü vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF-A) knock-out (VEGF-A KO) modeli⁵, modeller ve Alport sendromu⁶modelleri ve elde 5/6 nefrektomi⁷ ve tek taraflı üreteral obstrüksiyon (UUO) model⁸gibi modelleri. Bu modeller glomerular işlevinde farklı yönlerini değerlendirmek için çeşitli teknikler kullanılabilir. Böbrek hastalığı fare modellerinde glomerular işlevi tam olarak değerlendirmek için gerçekleştirilmesi gereken kapsamlı bir iş-up göstermek için bu yöntemi kağıt amacı budur.

Bu yöntemin kullanılması arkasındaki mantığı birden çok yönleri tam olarak değerlendirilecek glomerular fenotip sağlar olduğunu. Bu glomerular geçirgenliği, protein ve su, glomerular yapısal anormallikler ve ifade/yapıştırma mRNA'ların ve proteinler normal glomerular fonksiyonu için temel değişiklikler için değerlendirme içerir. Bu yöntemi kullanarak, araştırmacı böbrek fenotip modeli belirlemek ve mekanizma neden fenotip geliştirir olarak değerlendirmek mümkün. Bu hastalığın bu modeller potansiyel terapötik caddeleri incelerken gerekli olan mekanizma üzerinde hayati bilgi yok.

Literatürde, glomerular hastalığı fenotip idrarda albümin artan bir düzeyde tarafından belirlendiği yerde bir fare modeli ile sunulmak üzere ortak bir durum. Ancak, glomerular işlevi belirlemek için tek bir yöntem her zaman etkili değildir önermek kanıt yoktur; üriner albümin atılımı oranı ya da üriner albümin kreatinin oranı (uACR) ölçme sadece toplam böbrek fonksiyonları üzerine ve bilgiler değil, bireysel glomeruli sağlar. Önceki çalışmalarda geçirgenliği farklı glomeruli aynı böbrek^5,9,10değişebilir gösterdi. Buna ek olarak, bireysel glomeruli geçirgenliği değerlendirilmesi glomerular işlevi değerlendirme, daha duyarlı bir yoludur; bireysel glomerular Su geçirgenliği ölçüm tekniği (L_pA / V_ben) glomerular işlevinde uACR⁹ölçme daha değişiklikler daha duyarlı olmak göstermiştir. Bu tahlil fare modelleri dirençli proteinüri, bu c57BL/6 arka plan¹¹gibi için bu faydalıdır. Mevcut yöntemi kağıdın hem toplam böbrek geçirgenliği albümin için hem de bireysel glomerular geçirgenliği su inceliyor avantajdır.

Glomerular yapısal anormallikler incelenmesi kez lekeleri gibi periyodik asit Schiff (PAS), trichrome, ve gümüş lekelerin bir pil tarafından değerlendirilir. Bunlar bir skor yöntemi ile böbrek hastalığı düzeyini değerlendirmek eğitimli bir böbrek patolog etkinleştirin. Her ne kadar tüm iyi yöntemleri, glomerular makro yapısındaki değişikliklerden her zaman içinde gözlenir değil akut böbrek yaralanma¹²modelleri. Bu yöntem yukarıda açıklanan böbrek Histoloji teknikleri yerine getiren ek olarak, glomerular ultra-yapısı da elektron mikroskobu (EM) değerlendirilmek ki öneriyor. Lekeli glomerulus nispeten normal ışık mikroskop altında normal bakabilirsiniz; Ancak, EM, glomerular membran (GBM) genişliğinde küçük değişiklikler ile değerlendirmesi üzerine podocyte ayak işlem efasman, endotel fenestrations ve alt-podocyte alan kapsama analiz. Bu nedenle, glomerular ultra-yapısı ve mikro-yapısı değerlendirildi da glomerular disfonksiyon mekanizmasının belirlemek için hayati önem taşımaktadır.

Glomerular yapısal anormallikler değerlendirme ek olarak, mRNA ve protein ifade ve yapıştırma yanı sıra protein harekete geçirmek (Örneğin, fosforilasyon) değişiklikleri daha da glomerular hastalığı mekanizmaları aydınlatmak için incelenmesi gerekir. Glomerular hastalığı ararken veya örneğin, KO/aşırı-expressing bir gen glomerular hücreleri, örneğin podocyte özgü VEGF-A KO fare⁵' i gibi özellikle de bu protein ve mRNA değişiklikleri yalnızca içinde incelenir önemlidir glomerular hücreler ve değil bütün böbrek. Bu iletişim kuralı glomeruli fare böbrek korteks izole edilmiştir ve sonra protein/RNA izole bir yöntem açıklanır. Bu hastalık modeli glomeruli içinde protein/mRNA bozukluk belirli analiz sağlar.

Bu iletişim kuralı bir tam böbrek iş-up bu fare modelleri glomerular hastalığı, böbrek ve tek bir fare elde edilecek glomerular fonksiyonu ile ilgili bilgiler çok miktarda etkinleştirme gerçekleştirilmesi gerektiğini açıklar. Yöntemler glomerular hastalığı tüm fare modelleri uygulanabilir glomerular işlevinin ayrıntılı işlevsel, yapısal ve mekanik analiz için olanak sağlar.

Tüm deneyler UK mevzuat ve yerel etik kurul onay uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Hayvan çalışmaları University of Bristol Araştırma Etik Komitesi tarafından kabul edildi.

1. üriner albümin kreatinin oranı (uACR)

Not: UACR albümin GFB geçirgenliği değerlendirmek için kullanılır. İdrarda albümin varlığını artan geçirgenliği kreatinin idrar debisi değişimler için kontrol etmek için normalleştirilmiş GFB genelinde gösterir. Albuminuria kronik böbrek hastalığı için ortak bir belirtecidir.

1. İdrar deneysel temel ve düzenli aralıklarla (haftalık için bir kez bir kez aylık) deneysel son nokta kadar toplamak.
2. Fare metabolik kafesleri su ve zenginleştirme diyet ile ayarlayın. Sessiz bir odada 6 h için bireysel kafeslerde fareler (Erkek, yaşlı 6-8 hafta) yerleştirin.
3. Boş kafes üzerinden dönüş fareler düzenli konut ve toplamak idrar için. En az 50 µL gereklidir.
   Not: Eğer fare verilen süre içinde idrar üretmek değil, başka bir gün daha sıcak bir odada yineleyin.
4. 500 x g 10 dk. toplamak için de idrar idrar santrifüj kapasitesi ve tortu podocyte kaybı değerlendirmek için korumak. -20 ° C'de idrar kısa vadede bu noktada depolar.
5. İdrar 1 x Tris arabelleğe alınmış serum (TBS pH 7.5) adlı bir 1:500 albuminuria şiddetine bağlı olarak 1:10000 seyreltme için % 1 sığır serum albumin (BSA) sulandırmak.
   Not: Son birim olmalıdır > 400 µL. gelin her zaman doğru seyreltme belirlemek için en iyi duruma getir.
6. Bir fare albümin enzim bağlantılı immunosorbent assay (ELISA) başına üreticinin yönergelerini kullanarak üriner albümin konsantrasyonu ölçmek.
   1. Kısaca, oda sıcaklığında 1 h için anti-fare albümin birincil antikor (10 µg/mL 0.5 M karbonat-bikarbonat pH 9,6) 100 µL ile protein bağlama için en iyi duruma getirilmiş ELISA plaka kat.
   2. Beş kez ile 1 x TBS artı % 0.05 kuyulardan aşırı antikor yıkama ara (pH 8.0) ve çözüm (1 x TBS % 1 BSA pH 8.0 ile) Oda sıcaklığında gecede engelleme 200 µL ekleyin.
7. Plaka beş kez yıkayın ve standartların 100 µL ekleyin (seri seyreltme: 2000 µg/mL % 1 BSA, pH 8.0 ile 1 x TBS 15.63 µg/ml), boş ve nüsha seyreltilmiş örneklerinde. Oda sıcaklığında 1 h için bırakın sonra plaka beş kez yıkayın.
   1. HRP algılama antikor 100 µL her şey (10 ng/mL % 1 BSA, pH 8.0 ile 1xTBS) ekleyin ve 1 h için oda sıcaklığında kuluçkaya.
   2. Plaka beş kez yıkayın ve her şey için 100 µL enzim substrat çözeltisi ekleyin. Plaka 15dk için geliştirmek ve reaksiyon 0,18 M sülfürik asit 100 µL ekleyerek durdurmak için karanlıkta bırakın (H₂SO₄).
      Dikkat:₄ aşındırıcı bu yüzden H₂.
8. Bir absorbans 450 plaka okuyarak her örneğinin albümin konsantrasyonu belirlemek nm. Her örnek içinde mevcut albümin ölçmek için standart eğri'yi kullanın. Teknik tekrarlar %5 büyük bir CV değeri varsa, tahlil örnekleri için yineleyin.
9. Alternatif olarak, Elektroforez kullanarak üriner albümin konsantrasyonu değerlendirmek. 4 protein örnek yükleme arabellek x 5 µL idrar 15 µL için ekleyin. Örnekleri 10 min için 95 ° c ısı ve sonra 4-%12 prekast Tris jel yükleyin.
   1. Jel 100 V ve leke gecede Coomassie mavi üreticinin iletişim kuralı başına çalıştırın.
   2. Jel görüntüleme sonra Dansitometresi kat değişiklik albümin konsantrasyonu denetime göre değerlendirmek için kullanın.
      Not: hiçbir bantları için beklenen albümin gözlenir, idrar protein konsantrasyonu değerlendirmek ve jöleye eklendi idrar seviyesini ayarlamak.
10. DH₂O 1:1, 1:5 ve 1:10 ham idrar örneğinde sulandırmak.
    Not: Son birim olmalıdır > 70 µL. doğru seyreltme her örneğinin belirlemek için en iyi duruma getir.
11. Kimyasal tahlil başına kiti talimatları kullanarak idrar kreatinin konsantrasyonu ölçmek. Kısaca, kreatinin standartları, boş veya seyreltilmiş idrar nüsha 96 iyi plaka için 20 µL yükleyin.
12. 490 bir absorbans plaka okuyarak her örneğinin kreatinin konsantrasyonu belirlemek nm önce ve sonra asit solüsyonu eklenmesi (dikkat, aşındırıcı; cilt ile temasından sakının).
    Not: Absorbans değerleri arasındaki farkı kreatinin konsantrasyonu her örnek içinde doğrudan orantılıdır. Standart bir eğri standartın nesil olduğunu. Teknik tekrarlar %5 büyük bir CV değeri varsa, tahlil örnekleri için yineleyin.
13. UACR (µg/mg) oluşturur. Her fare grafik olarak gösterilmesi için temel değeri için verileri normalleştirmek.

2. doku ve kan toplama

Not: Böbrek ve glomerular doku yapısal, protein ve mRNA ifade işaretleri böbrek hastalığının değerlendirmek için kullanılabilir. Kan işaretleri up-düzenlenir glomeruli filtrasyon kapasitede bir azalma gösteren böbrek hastalığında olabilir kreatinin gibi böbrek işlevinin değerlendirmek için kullanılabilir.

1. Aşağıdaki çözümleri hazırlamak: taze % 2.5 oxazolidin 0.1 M sodyum cacodylate (pH 7.3), 1 fosfat tamponlu tuz (PBS), memeli zil'ın çözüm (115 mM sodyum klorür (NaCl), 10 mM sodyum asetat (CH₃COONa), 1.2 x %4 paraformaldehyde mM sodyum fosfat (Na₂HPO₄), 25 MM sodyum bikarbonat (NaHCO₃), 1.2 mM magnezyum sülfat (MgSO₄), 1 mM kalsiyum klorür (CaCl₂), 5.5 mM D (+) glikoz, pH 7,4) % 1 BSA ve 1 x PBS ile.
   Dikkat: % 2.5 oxazolidin: toksik, derhal, tahriş edici; bir duman dolapta kullanın. 0.1 M sodyum cacodylate: toksik, bir duman kabine kullanımda. % 4 İngiltere'de yılın: sabitleştirici, duman kabine kullanımda
2. Aşağıdaki belgeleri hazırlamak: isoflurane, küçük ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA)-boyalı kan tüpleri, 23-25G iğneler, 5 mL EDTA kaplı şırınga, 10 mL Cam şişe, 10 mL plastik şişeleri, 0.5 mL Plastik tüpler, tek kullanımlık mendil kalıpları, Kuru buz, sıvı N ₂, fare cerrahi araçları ve en iyi kesim Orta (OCT).
3. Fareyi fare non-yanıt veren bir isoflurane odası veya terminal anestezi enjekte edilebilir anestetik ajanlar (Fentobarbital, 50 mg/kg gibi eşdeğer yolları kullanarak ayak pedi için bir iğne iğne için varlık tarafından doğrulanmadı derin anestezi altında yer mayi [IP]; Avertin, 240 mg/kg IP), ya da karbondioksit (CO₂) çıkması (% 75 CO₂/25% O₂).
4. Fare ile kardiyak ponksiyon sol ventrikül itlaf ve mümkün olduğunca çok kan toplamak. En fazla 4 saat için kan EDTA kaplı tüp aktarın. Tercih Eğer fare ile servikal yerinden çıkması juguler ven rüptürü değil için alınan bakım ile itlaf.
5. Karın ve buz soğuk 1 x PBS yıkama böbrekler dışarı incelemek.
6. Kortikal glomeruli incelemek için böbrek korteks bir kutup kaldırın ve 1 mm³ parçalar halinde kesin. Derin juxta medüller glomeruli incelemek için aynı tekniği ile medulla dokudan yineleyin. 5 mL % 2.5 oxazolidin çözeltisi içinde cam EM şişe yerleştirin. 4 ° C'de mağaza
   Dikkat: % 2.5 oxazolidin çözüm: toksik, derhal, tahriş edici; bir duman dolapta kullanın
   Not: işlemi en iyi sonuç için 1 ay içinde.
7. Histoloji için 5 mL % 4 paraformaldehyde 4 ° c 24 h 5 mL % 70 de aktarmak için de bir böbrek kortikal ve juxta medüller glomeruli-ecek var olmak mevcut, emin olmak için ve düzeltme üst üçte kaldırmak alkol parafin içinde katıştırma önce 24 saat.
   Dikkat: %4 PFA: sabitleştirici, duman kabine kullanımda
8. Ayirt için kortikal ve medüller glomeruli mevcut, doku kalıp ve Ekim ceket içine olacak emin olmak için böbrek, üçüncü sırada yer kuru buz dondurmak ve-80 ° C'de depolamak için
9. Protein ve RNA için yer 3 x 2 mm³ adet böbrek korteks 0.5 mL plastik boru ve ek içine sıvı N₂' dondur. Mağaza-80 ° C'de Uzun süreli doku depolama için RNA, RNA sabitleme çözüm 5 cilt olarak doku yerleştirin ve-80 ° C'de saklarız
10. Glomeruli yalıtımı, kalan böbrek doku kadar dilim ve 5 mL memeli zil'ın çözeltisi % 1 BSA buz ile yerleştirin. Glomeruli hemen elek hazır olun.

3. plazma kreatinin

Not: Plazma kreatinin yukarı glomeruli filtrasyon kapasitede bir azalma gösteren böbrek hastalığında düzenlenmiş olabilir. Protokol burada açıklanmayan rağmen kan üre nitrojen (BUN) seviyesi de değerlendirilebilir.

1. Kan örneği ' 500 x g 4 ° C'de 15 dakika santrifüj kapasitesi
2. -20 ° C de kısa vadede bu noktada saklanabilecek olan plazma toplamak.
3. 1.11 protokolündeki üriner kreatinin için kimyasal kreatinin tahlil başına yukarıdaki talimatları kullanarak plazma kreatinin konsantrasyonu ölçmek.
4. 490 bir absorbans plaka okuyarak her örneğinin kreatinin konsantrasyonu belirlemek nm önce ve sonra asit solüsyonu eklenmesi.
   Not: Bu absorbans değerleri arasındaki farkı kreatinin konsantrasyonu her örnek içinde doğrudan orantılıdır. Standart bir eğri standartın nesil olduğunu. Teknik tekrarlar %5 büyük bir CV değeri varsa, tahlil örnekleri için yineleyin.

4. Glomeruli yalıtım

Not: Glomeruli bireysel glomeruli ex vivogeçirgenliği, hem de ifade belirli protein ve mRNA işaretleri glomerular hastalığının değerlendirmek için izole.

1. Memeli zil'ın çözüm % 1 BSA ile yerleştirilen böbrek doku almak ve bir standart tekniği¹³eleme kullanarak glomeruli incelemek. Kısaca, 70 µm (alt), 100 µm, 125 µm, 175 µm, 250 µm ve 425 µm (üst) elek üstünde-e doğru bir cam kabı yığını.
2. Böbrek püre, bir şırınga dalgıç 425 µm kullanarak elek ve % 1 BSA ile buz soğuk memeli zil'ın çözüm kullanarak itme. Böbrek parçaları itilir gibi üst elek kaldırmak ve sonraki aynı şeyi yapmaya devam edin. Tekrar sadece 100 µm ve 70 µm elekler kalır.
3. 100 µm ve 70 µm tarafından muhafaza glomerular hasat aktarım Elekler için 10 mL taze memeli zil'ın çözeltisi % 1 BSA, buz ile.
   Not: glomeruli mL zil'ın çözüm başına sayısı az ise, glomeruli son iki elekler toplamak için kullanılan zil'ın çözüm hacmini azaltmak.
4. 5 mL glomeruli içine iki ayrı tüp (2.5 mL her) ve 4 ° C'de 10 dakika 1000 x g, santrifüj içeren çözüm de kaldırmak Süpernatant kaldırmak ve ek protein ve RNA ayıklama daha sonraki bir tarihte-80 ° C'de depolamadan önce sıvı N₂ glomeruli dondurma.
5. Glomeruli ölçme noktalar glomerular L_pA 37 ° C'de bir su banyosunda içeren kalan çözüm yer / V_benex vivo. İçinde 3 h-böbrek çıkarmadan tamamlayın.

5. glomerular Su geçirgenliği (L_pA / V_ben)

Not: Glomerular L_pA / V tahlil_ben bireysel glomeruli geçirgenliği ex vivo ölçüm hızlı bir tekrarlanabilir bir şekilde sağlar. Bir artış glomerular L_pA / V_ben GFB, bozulma olan böbrek hastalığı düşündüren olduğunu gösterir.

1. Glomerular L_pA ayarla / V_ben teçhizat somon ve ark¹⁰içinde açıklandığı gibi. Belgili tanımlık kurmak ayrıntılı bir diyagram için Şekil 1 ' e bakınız.
2. Aşağıdaki çözümleri hazırlamak: memeli zil'ın çözüm % 1 BSA (pH 7,4) ile ve memeli zil'ın çözüm % 8 BSA (pH 7,4) ile. Her ikisi de 37 ° c sıcak
3. Mikropipetler cam kapiller tüpleri üzerinden çekin (optik yoğunluk: 1,2 mm). 5-8 µm diyafram bahşiş bir mikroskop altında micropipette keserek oluşturmak.
4. Glomerular L_pA kullanın / V_ben teçhizat Bowman's kapsül ve emme kullanarak micropipette üzerine borulu parçaları olduğu gibi bireysel glomeruli yakalamak için. Oncometric tahlil ayrıntılı bir özetini somon ve ark¹⁰içinde bulunur. Bir kez bir glomerulus yakaladı ve emme micropipette güvenli, kısaca, mikroskop altında glomerulus video kaydı başlar.
5. İlk olarak, %30 1 BSA zil'ın çözüm glomerulus equilibrate perifusate konsantre % 8 BSA zil'ın çözüm 10 için geçiş yapmadan önce s s. Daha sonra perifusate geri % 1 BSA zil'ın çözüm anahtarı ve durmak belgili tanımlık yazmak.
6. Glomerulus silsin ve fare başına 10-15 glomeruli için işlemi tekrarlayın. Perifusate akış oranları aynı ve hızlı değil sağlamak (10 mL/dak) olarak değil glomerular yapısı deforme etmek için.
7. Glomerular büzülme glomerular birime (V_ben) normalleştirilmiş glomerular Su geçirgenliği (L_pA) hesaplamak için başlangıç hızını ölçmek. Somon ve ark¹⁰analizi ile ilgili detaylı bilgi bulunabilir.

6. periyodik asit Schiff (PAS) leke

Not: PAS lekesi glomerular kapiller döngüler Bodrum zarı ve borulu epitel vurgular. Glomerular hücrelerin, mesangial matris ve potansiyel genişleme ve GBM (yani, kalınlaşma ve düzensizlikler) olası değişiklikler ayrıntılı görselleştirme sağlar.

1. 5 µm kalınlık poli-L-lizin kaplamalı slayta adlı bir microtome kullanarak parafin katıştırılmış, PFA-sabit böbrek korteks bölüm. 1 h. sağlamak için 37 ° C'de kuru bölüm herhangi bir kıvrım veya morfolojisi mikroskop altında deforme edebilirsiniz delik içermez.
2. İki kez ksilen kuluçka tarafından slaytlar deparaffinize (dikkat, tahriş edici; duman kabine kullanımda) 3 min için iki kez %100 alkol 3 dakika ve sonra bir kez % 95, % 70 ve % 50 alkol 3 dk her, tüm oda sıcaklığında. DH₂O. slaytları yeniden hidrat
3. Periyodik asit çözüm slaytları kuluçkaya (dikkat, tahriş edici; duman kabine kullanımda) (1 g/dL) 5 min ve sonra durulama için çeşitli değişiklikler dH₂O. slaytları ile 100 mL dH₂O oda sıcaklığında bir kapsayıcı kullanın.
   Dikkat: periyodik asit çözüm: tahriş edici; duman dolapta kullanın
4. Schiff'ın reaktif slaytları kuluçkaya (Parasoaniline HCl 6 g/M ve sodyum METABISÜLFİT %4 oranında HCl 0,25 mol/L) Oda sıcaklığında 15 dakika. Musluk suyu 5 min için çalışan slaytlar yıkayın.
5. Hematoksilen ile counterstain 3 için iyice musluk suyu 15dk için çalışan slaytlar durulama önce s.
   Not: Bazı optimizasyon hematoksilen boyama için en uygun zamanı belirlemek için gerekli.
6. 6.2. adımda tersine, deparaffinization protokolü kullanarak slaytları kurutmak. Ksilen ile bitirmek.
7. Hava kuru slaytlar ve bağlama ile montaj ksilen-esaslı kitle iletişim araçları.
8. Işık mikroskobu glomerular yapıları değerlendirmek için 400 X büyütme, görüntü. Aşağıdaki değerlendirmek: kalınlaşma ve GBM usulsüzlükler çöken kapiller döngüler, fibrotik doku, skleroz, hücresel proliferasyonu (endotel, podocyte ve mesangial veya inflamatuar hücre tutam infiltre).
   Not: glomerular patofizyolojisi kapsamlı bir değerlendirme için başka bir yerde lezyonlarının böbrek olmalıdır değerlendirilmiş, tübüllerin gibi.

7. iletim elektron mikroskobu (TEM)

Not: TEM Ultra yapısal anormallikler muayene GBM, podocyte ayak süreçleri ve ışık mikroskobu ile görünür olmayan endotel fenestrations gibi böbrek sağlar. Bu nerede böbrek hasarı çok (yani, hiçbir albuminuria ve önemli yapısal anormallikler) belirgin değildir modellerinde önemlidir.

1. % 2.5 gluteraldehdye - sabit doğranmış böbrek almak ve % 1 osmiyum tetroxide içinde 50 mL 0.1 M cacodylate arabelleği (pH 7.3) ve daha sonra dH₂O 50 mL 1 h. Yıkama için (3 x 15 dk değişiklikleri) sonrası düzeltme.
   Dikkat: % 2.5 oxazolidin: toksik, derhal, tahriş edici; bir duman dolapta kullanın. 0.1 M sodyum cacodylate: toksik, bir duman kabine kullanımda
2. Alkol ile kurutmak ve Araldite reçine embed.
3. 50-100 nm kalınlığı bölümleri kesme ve % 3 (sulu) uranyl asetat ve Reynolds ın götürmek sitrat eriyik ile leke.
4. Çeşitli alanlarda glomerulus 940 X, dijital filmler ele, 1250 X ve 6200 X emin olmak için podocytes, GEnCs, GBM ve mesangium belirlenebilir.
5. ImageJ kör glomeruli çözümlemek için kullanın. Ölçeğin her 6200 X test için bir cetvel gibi bilinen mesafe iki nokta arasında bir çizgi çizerek ayarlayın. Analiz için gidin ve ölçek, nerede hattın uzunluğu-ecek var olmak göstermek piksel olarak ayarlayın. Bilinen mesafe ve ölçü birimleri yazın. Aşağıda listelenen her parametre ölçüm için iletişim kuralları kullanırlar.
   Not: Bu analiz fare yaklaşık 1 günlük gerektirir. İstatistiksel elektrik, 3 glomeruli 3 fare üzerinden üzerinden ortalama ölçüleri kullanın.
   1. GBM için sabit dijital kılavuz (10 x 10) 6200 X test yerleştirin ve GBM nerede kılavuz çizgileri GBM çapraz noktada kalınlığını ölçmek. Bazal podocyte ayak işlem hücre zarı düz çizgi aracını kullanarak endotel hücre zarı için dikey teğet içinde için bazal endotel hücre membran ölçmek. Ortalama ölçüm için her glomerulus üzerinden 10 bireysel ölçümleri belirleyin.
   2. Endotel fenestrasyon numarası için 6200 X test mevcut GBM uzunluğunu ölçmek ve GBM uzunluğu birimi başına endotel fenestrations saymak. Ortalama glomerulus başına en az 4 Filmler üzerinden alın.
   3. Podocyte için işlem genişliği ayak, sabit dijital kılavuz (10 x 10) 6200 X test yerleştirin. Kılavuz çizgileri çapraz podocyte ayak süreçleri genişliğini ölçmek. GBM buluştuğu ayak işleminin en geniş parçası genişlikte ölçün; yolun podocyte bazal membran tanjantını dik olduğundan emin olun. Ortalama ölçüm için her glomerulus üzerinden 10 bireysel ölçümleri belirleyin.
   4. Genişlik yarık podocyte için sabit bir dijital kılavuz (10 x 10) 6200 X test yerleştirin. Kılavuz çizgileri çapraz podocyte yarık diyaframlar genişliğini ölçmek. Bu ayak süreçleri podocyte membran-membran yakın birlikte, her ayak işlem en geniş kısmında nerede noktadır. Ölçüm podocyte bazal membran tanjantını dik olduğundan emin olun. Ortalama ölçüm için her glomerulus üzerinden 10 bireysel ölçümleri belirleyin.
   5. Podocyte sayısı için süreçleri, 6200 X test mevcut GBM uzunluğunu ölçmek ve ayak podocyte ayak süreçleri GBM uzunluğu birimi başına saymak. Ortalama glomerulus başına en az 4 Filmler üzerinden alın.
   6. Alt-podocyte alanı kapsamının Neal ve arkiçin detaylı yöntemine bakın. ¹⁴.
6. 940 X filmler kullanarak, glomeruli anormal yapısını, mevduat ve infiltratlar varlığı için göz göre inceleyin.

8. ayirt Podocyte ve endotel işaretleri için

Not: Immunostaining protein ifade kalıplarının glomerular hastalığında daraltabilirsiniz endotel kılcal döngüler gibi görselleştirme sağlar.

1. Kesit önce 2 h için-20 ° C'de donmuş böbrek içeren OCT-kalıp yerleştirin. Böbrek kesme yüzeyi dikkatlice de odaklı doku bölümleri etkinleştirmek için OCT-kalıp alt karşı yerleştirilir emin olun.
2. Bir cryostat kullanarak, Bölüm doku 5 µm kalınlığa üstünde-e doğru poli-L-lizin, slaytlar kaplı.
   Not: hiçbir kıvrımlar veya delik morfolojisi deforme edebilirsiniz doku bölümünde olduğundan emin olun.
3. Cryostat kaldırılması slaytlar düzeltmek %4 oranında PFA 10 dk. Yıkama için 100 mL ile bir kapta 3 x 5 dk dH₂O. slaytlar.
   Dikkat: %4 PFA: sabitleştirici, duman kabine kullanımda
4. Kullanılan antikor miktarı en aza indirmek için bölümler hidrofobik kalemle çizin. Kuru bölümleri izin vermeyin.
5. Oda sıcaklığında 1 h için çözüm (% 3 BSA ve 1 x PBS % 5 normal serum) engelleme kuluçkaya.
6. Bir aspiratör ile engelleme çözümü kaldırmak ve bölümleri ile seyreltilmiş birincil antikor (Nephrin, podocin veya PECAM-1) 1:250 (1 x PBS % 3 BSA) kuluçkaya. Slaytlar bir oksijen odası 4 ° C'de gecede yerleştirin. Hafif nemli bir oda yoksa, parafilm küçük bir şerit antikor kaplı slayt yerleştirin. Bölümün engel değil olarak ertesi gün kaldırırken ilgilen.
7. Slaytlar 3 x 5 dk 1 x PBS içinde yıkayın.
8. -Uygun floresan ikincil antikor 1: seyreltme 1000 (1 x PBS % 3 BSA) içinde belgili tanımlık karanlık oda sıcaklığında 2 h ile kuluçkaya.
9. Slaytlar 3 x 5 dk 1 x PBS içinde yıkayın. DAPI içeren ortam takma floresan ile bağlayın.
10. Glomeruli görüntülemek için 400 X büyütme, floresan mikroskop ile görüntü slaytlar. Bu önyargı önlemek için kör emin olun.
11. Glomerular alan ve boyama, yani, kapiller döngü sayısını desenini normalleştirilmiş boyama yoğunluk analiz etmek için kullan ImageJ glomerular alanına, kör bir şekilde normalleştirilmiş.

9. protein çıkarma ve Western blot

Not: Western blot dysregulated renal hastalığı olarak bilinen ifade proteinler değerlendirmek için bize izin verir. Örneğin, podocin ve nephrin ifade bir azalma podocyte kaybı olduğunu gösterir.

1. Protein böbrek korteks ve elenmiş glomeruli ayıklamak; her biri için aynı protokoldür ve lizis arabellek hacmi doku miktarına göre ayarlanır.
2. Tezcan böbrek/glomeruli NP-40 lizis eklemeden önce buz üzerinde (150 mM NaCl, %1 NP-40, 50 mM Tris pH 8) içeren fosfataz ve proteaz inhibitörleri tampon. Örnek için 30 homojenize s.
3. Homojenize örnekleri 30 dk, vortexing düzenli aralıklarla buz üzerinde kuluçkaya.
4. Örnekleri, 10.000 x g 4 ° C'de 15 dakika santrifüj kapasitesi
5. Süpernatant buz taze bir tüp için kaldırın.
   Not: yaklaşık 1 mg protein örnek başına kurtarmak bekliyoruz.
6. Standart 4 x Laemmli tampon kullanarak proteinler denatüre. 95-100 ° C'de karışımı 5 dakika kaynatın.
7. Glomerular Hücre işaretçisi proteinleri (Nephrin, Podocin, PECAM-1, vb) ve fosforilasyon ifade ve ifade bilinen/Western blot () kullanarak hastalık modeli böbrek/glomeruli değiştirilecek olan proteinlerin değerlendirmek Standart Yöntem; Mahmud ve Yang¹⁵).
   Not: Protokol boyutuna ve bereket protein ilgi bağlı olarak değişir.

10. RNA çıkarma ve polimeraz zincir tepkimesi (PCR)

Not: mRNA ifade analizi nasıl genler gen ekspresyonu ve alternatif işlenim değişiklikler gibi böbrek hastalığında düzenlenmektedir belirlemek için bize izin verir.

1. Böbrek korteks hala donmuş ederken iyice 3 mL fenol reaktif bir havaneli ve harç kullanarak eziyet. Glomerular özleri kullanıyorsanız, fenol reaktif 1 mL ekleyin ve örnek için 30 homojenize s.
   Dikkat: TRIzol reaktif: tahriş edici; duman dolapta kullanın
2. Chomczynski ve Sacchi¹⁶tarafından açıklanan yöntemi kullanarak bir RNA ayıklama gerçekleştirmek.
   Not: Ticari RNA ayıklama kitleri bu yöntemi alternatif olarak mevcuttur.
3. Miktar ve kullanılabilir çeşitli yöntemlerden birini kullanarak elde edilen RNA kalitesini değerlendirmek. RNA bu noktada bölünmemeli ve-80 ° C'de saklı. Tekrar önlemek çözülme donma.
   Not: bir açık 28S ve 18S ribozomal bant sağlamak için bir özel jel RNA çalıştırarak yeni Eğer bu yöntem, bir sonraki adıma devam etmeden önce RNA kalitesini kontrol. Bu yöntemi kullanarak RNA'ın 2-5 µg arasında kurtarmak bekliyoruz.
4. DNaz tedavi RNA (RNase free su ile 10 µL artı 1 µL DNaz ve 1 µL DNaz arabelleği kadar yapmak cilt) 1 µg 1 h için 37 ° C'de DNaz durmak eriyik için 10 dk 65 ° C'de 1 µL ile reaksiyonu durdurmak.
5. Oligo (dT) ve rasgele astar 0.5 µL ekleyin. 10 dk 70 ° C'de kuluçkaya.
6. Hemen buz 5 min için gidermek.
7. Aşağıdaki; MMLV ters transkriptaz enzimi (400 U; eski yerine koymak ile DEPC H₂O RT - denetimi örneğini), MMLV arabellek (1 x), dNTP mix (0.5 mM) ve ribonükleaz inhibitör (40 U); DEPC su ile ilâ 50 µL olun.
8. Reaksiyon mix 1s 95 ° C enzim devre dışı bırakmak 5 min için takip için 37 ° C'de kuluçkaya.
   Not: en fazla 3 saat için 37 ° C'de cDNA daha yüksek bir verim üretmek için kuluçkaya.
9. Miktar ve cDNA bulunan çeşitli yöntemler kullanarak kalitesini değerlendirmek.
10. Kullanım genler mRNA ifade ve yapıştırma desenleri değerlendirmek için PCR onaylanmadığına karar dysregulated glomerular hastalık modeli olmak. Protokol faiz gen bağlı olarak değişir.

İdrar toplanan metabolik mağaraları vahşi türü (WT), indüklenebilir podocyte özgü VEGF-A knock (VEGF-A KO) dışarı ve VEGF-A KO X Neph-VEGF165b fareler tarafından kullanarak (insan VEGF-A165b izoformu içinde podocytes içinde aşırı hızlı VEGF-A KO fareler bir Kurucu şekilde). Ölçümü üriner albümin kreatinin oranı 0, 4, 10 ve 14 hafta sonra doksisiklin indüksiyon VEGF-A KO VEGF-A KO fareler ilerici albuminuria 10 WT littermate kontrollere göre hafta tarafından geliştirilmiştir. Mutlak değerler Şekil 2Ave temel bir Şekil 2Bher fare değerleri normalleştirilmiş görülebilir. Ancak, albuminuria içinde VEGF-A X Neph-VEGF-A165b fareler (resim 2), gözlenen değil o VEGF-A165gösteren b albuminuria5modelde koruyucudur.

Glomerular LpAVben bireysel glomeruli WT, VEGF-A KO ve VEGF-A X Neph-VEGF-A165b böbrekler elenmiş olarak ölçüldü. Ne zaman perifused % 8 BSA ile 3A rakamgösterilir nasıl bir glomerulus yakalanıyor ve büzülme örneği görülmektedir. Bu büzülme sonra glomerular LpA belirlemek için kullanılan / Vben her glomerulus (Şekil 3B) için. VEGF-A KO fareler vardı bir önemli ölçüde artış glomerular LpA / Vben 14 haftalık WT kontrol glomeruli için karşılaştırıldığında VEGF-KO indüksiyon post. Daha düşük olmasına rağmen farelerde VEGF-A X Neph-VEGF-A165b, artan glomerular LpA / Vben değil VEGF-A165b 14 hafta5aşırı ifade tarafından engel.

PAS böbrek korteks bölümlerini 14 hafta sonra VEGF-A KO indüksiyon boyama glomerular yapısal anormallikler farelerde VEGF-A KO veya VEGF-A X Neph-VEGF-A165b (Şekil 4A) olmadığını göstermiştir. Ancak, analiz üzerinden EM glomerular ultra yapısının VEGF-A KO fareler bir artan GBM genişliği geliştirilen, endotel fenestrae sayısı azalmıştır, SPS kapsama azalmıştır ve ortalama podocyte yarık genişliği arttı (Şekil 4 c-4F ). Ortalama podocyte ayak genişliği ve yırtmaçlı değişmemiştir (Şekil 3B ve 3 G) sayısı işlem. VEGF-A165b VEGF-A KO farelerde aşırı ifade değişiklikleri için GBM engelledi ve genişliği (Şekil 4 c ve 4F) kesti. Ancak, VEGF-A165b değişmiş fenestrae numarası ve SPS kapsama (Şekil 4 d ve 4E)5üzerinde bir etkisi vardı.

RT-PCR süzülen glomeruli çıkarılan RNA üzerinde gerçekleştirilen insan VEGF-A165b mRNA sadece VEGF-A KO X Neph-VEGF-A165b fareler (5A rakam) mevcut saptandı. Protein süzülen glomeruli ve Western blot yoluyla protein düzeyleri değerlendirmek ayıklanan VEGFR-2 glomerular protein ifadesi VEGF-A KO fareler, azaltılan hangi VEGF-A165b ( aşırı ifade tarafından engellendi bulundu Şekil 5B ve 5 C)5.

Şekil 1. Grafiksel kurulum glomerular geçirgenliği (LpA) teçhizat. (A) glomerulus yakaladı (B) üzerinde emme kullanarak bir tutucu içinde micropipette, hangi istikrar için bir takma üzerine sabitlenmiş. (C) dikdörtgen microslide. (D) 4 X amacı, bir video kamera ile mikroskop. (E) % 1 BSA çözüm 37 ° C'ye ısıttı. (F) % 8 BSA çözüm 37 ° C'ye ısıttı. (G) uzaktan dokunun taşıyan iki perifusate içeren satırların, hızlı perifusate Satım izin veren. (H) rotanın glomerulus Hidromasajlı Küvet microslide doğru perifusate. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 2. Üriner albümin kreatinin oranı. (A) 0, 4, 10 ve 14 hafta sonra VEGF-A KO indüksiyon WT, VEGF-A KO ve VEGF-A X Neph-VEGF-A165b farelerde uACR değerlerinde. (B) her bireysel fare temel değerine (hafta 0) aynı uACR değerleri normalleştirilmiş. UACR anlamlı bir artış VEGF-A KO fareler hafta 10 ve 14 WT littermate kontrollere, VEGF-A X Neph-VEGF-A165b farelerde engelledi göre (* p < 0,05; İki yönlü ANOVA, düzeltme çiftleri arasında karşılaştırma için; n = 4-12 fareler her zaman noktası; hata çubukları: standart hata ortalamaya [SEM]). Bu rakam Stevens ve ark5değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 3. Glomerular Su geçirgenliği ölçümü. (A) glomerulus emme; üzerinden micropipette üzerinde yakaladı perifusate % 1 BSA (AI) % 8 BSA (bütün) açık olduğundan ve glomerular büzülme görülmektedir. (B) önce ve % 8 BSA geçiş sonrası alınan ölçümlere glomerular LpA belirlemek için kullanılır / Vben. (C) VEGF-A KO fareler geliştirmek bir artan glomerular LpA / Vben 14 haftalık indüksiyon WT kontrollere göre VEGF-A KO post. Bu önemli ölçüde VEGF-A X Neph-VEGF-A165b farelerde engellendi değil (* p < 0,05; Tek yönlü ANOVA, çiftleri arasında karşılaştırma için Bonferroni düzeltmesi; n = 4-9 fareler, 15-30 glomeruli; hata çubukları: SEM). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 4. Glomerular yapısal analizi. (A) PAS böbrek korteks boyama WT, VEGF-A KO ve VEGF-A X Neph-VEGF-A165b fareler (AI - III)--dan glomeruli içinde yapısal anormallikler değil göstermek. EM VEGF-A KO glomeruli (AIV - VI) Ultra yapısal anormallikler ortaya koydu. (B) gruplar arasında ortalama FPW değişmedi. (C) GBM VEGF-A KO glomeruli, VEGF-A165b. fenestrae sayısı VEGF-A165b. (E) SPS kapsama tarafından değişmeden kaldı VEGF-A KO glomeruli içinde azalmıştır (D) tarafından engelleyen arttı yapıldı Ayrıca VEGF-A165b. yarık genişliği ortalama VEGF-A KO glomeruli artış oldu (F) tarafından değişmeden kaldı, VEGF-A KO glomeruli içinde azalmıştır değişmeden hangi VEGF-A165b (G) yarık numarası tarafından engellendi üç gruplar arasında (* p < 0,05; Tek yönlü ANOVA, çiftleri arasında karşılaştırma için Bonferroni düzeltmesi; n = 3 fareler, 9 glomeruli; hata çubukları: SEM). Bu rakam Stevens ve ark5değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 5. mRNA ve protein ifade işaretleri. (A) RT-PCR gösterdi insan VEGF-A165b mRNA ifade yalnızca belirgin VEGF-A KO X Neph-VEGF-A165b fareler üzerinden süzülen glomeruli. (B) Western blot VEGFR-2 proteini ifade VEGF-A KO X Neph-VEGF-A165b glomeruli engelleyen aşağı VEGF-A KO glomeruli içinde düzenlenir olduğunu belirtti (* p < 0,05; Tek yönlü ANOVA, çiftleri arasında karşılaştırma için Bonferroni düzeltmesi; n = 3 - 6 fareler; hata çubukları: SEM). Bu rakam Stevens ve ark5değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Yazarlar ifşa gerek yok.